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Neuroscience

गंभीर रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद आतंच और वृद्धि कारक कॉकटेल के साथ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अस्तित्व और भेदभाव की पदोन्नति

Published: July 27, 2014 doi: 10.3791/50641
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1,2
1Veterans Administration Medical Center, San Diego, 2Department of Neurosciences, University of California, San Diego

Summary

वृद्धि कारक युक्त आतंच matrices पूरा रीढ़ की हड्डी transection की साइटों में grafted तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया. Grafted कोशिकाओं को पूरी तरह से घाव गुहा भरा और लंबी दूरी पर मेजबान रीढ़ की हड्डी में axons बढ़ाया कि न्यूरॉन्स सहित कई तंत्रिका कोशिका प्रकार, में भेदभाव.

Abstract

तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) स्वयं को नवीनीकृत और न्यूरॉन्स और glia में अंतर कर सकते हैं. प्रतिरोपित एनएससी रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के बाद खो न्यूरॉन्स और glia जगह ले सकता है, और एक घाव ऊपर और नीचे रीढ़ की हड्डी खंडों को फिर से कनेक्ट करने के लिए कार्यात्मक रिले फार्म कर सकते हैं. तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं कलम बांधने का काम पिछले अध्ययनों से रीढ़ की हड्डी में घाव गुहा के भीतर अधूरा भ्रष्टाचार के अस्तित्व द्वारा सीमित किया गया है. इसके अलावा, भ्रष्टाचार सेल अस्तित्व, भेदभाव, और प्रक्रिया विस्तार से ट्रैकिंग अनुकूलित नहीं किया गया था. अंत में, पिछले अध्ययनों में, सुसंस्कृत चूहा एनएससी आम तौर पर भाग्य एक विशेष सेल प्रकार के लिए प्रेरित किया गया था, जब तक बल्कि न्यूरॉन्स से घायल रीढ़ की हड्डी, के लिए grafted जब glia में अंतर करने की सूचना मिली. इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, हम भी गंभीर एससीआई की साइटों के लिए एनएससी के अस्तित्व, एकीकरण और भेदभाव में सुधार के लिए नए तरीकों को विकसित किया है. एनएससी हौसले से हरी FL व्यक्त एक स्थिर ट्रांसजेनिक फिशर 344 चूहा रेखा से भ्रूण दिन 14 रीढ़ की हड्डी (E14) से अलग थेuorescent प्रोटीन (GFP) और वृद्धि कारकों से युक्त एक आतंच मैट्रिक्स में एम्बेडेड थे; घाव गुहा में grafted कोशिकाओं को बनाए रखने और सेल अस्तित्व का समर्थन करने के उद्देश्य से इस सूत्रीकरण. आतंच / वृद्धि कारक कॉकटेल में एनएससी, जिससे सूजन की पीक समय से परहेज है, दो सप्ताह वक्ष स्तर 3 (टी 3) पूरा रीढ़ की हड्डी लेनदेनों के बाद प्रत्यारोपित किया गया. परिणामस्वरूप grafts पूरी तरह से घाव गुहा भरा और मेजबान रीढ़ की उल्लेखनीय लंबी दूरी पर कॉर्ड, और glia में axons बढ़ाया जो दोनों न्यूरॉन्स में विभेदित. GFP व्यक्त सुसंस्कृत मानव एनएससी की Grafts इसी तरह के निष्कर्ष में हुई. इस प्रकार, तरीकों तंत्रिका स्टेम सेल ग्राफ्टिंग, अस्तित्व और vivo में निष्कर्ष के विश्लेषण में सुधार के लिए परिभाषित कर रहे हैं.

Introduction

रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) अक्सर हर्जाना न केवल interneurons और मोटर न्यूरॉन्स की कमानी नुकसान के कारण मस्तिष्क के लिए और से ले जाने के संकेत है कि सफेद बात इलाकों, बल्कि केंद्रीय ग्रे बात है,. एससीआई का परिणाम मोटर और घाव नीचे संवेदी समारोह दोनों का नुकसान हुआ है. दुर्भाग्य से, वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) अनायास स्थायी कार्यात्मक घाटे 1 में जिसके परिणामस्वरूप, पुनर्जन्म नहीं होता है. इसलिए, घायल वयस्क रीढ़ की हड्डी और सुधार मोटर में, संवेदी और स्वायत्त समारोह का पुनर्निर्माण एससीआई अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है. तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी), सीधे भ्रूण या वयस्क सीएनएस से अलग है, चाहे खो न्यूरॉन्स और glia बदलने के लिए मजबूर उम्मीदवार कोशिकाओं रहे हैं. इसके अलावा, इन कोशिकाओं को एक घाव साइट 2,3 भर axonal चालन को बहाल करने के लिए नए कार्यात्मक रिले फार्म की क्षमता है.

तिथि करने के लिए, शरीर रचना का एक विस्तृत व्याख्या, electrophys नहीं किया गया हैiological और गंभीर एससीआई के बाद प्रतिरोपित एनएससी द्वारा neuronal रिले गठन के व्यवहार प्रभाव. पहला, प्रतिरोपित एनएससी या भ्रूण सीएनएस ऊतक बड़े घाव cavities में grafted जब खराब जीवित रहते हैं: इस के लिए कई कारण हैं. पिछले अध्ययनों बड़े खाली पित्ताशय घाव cavities 4,5 छोड़ने, पर्याप्त जल्दी सेल नुकसान दिखा. कुछ अध्ययनों में grafted कोशिकाओं बाद में विभाजित है और घाव गुहा 4,5 भरने, लेकिन इस सप्ताह के दिनों की देरी के बाद हो सकता है, और बाद में घाव साइट भरने पूर्ण या संगत नहीं हो सकता होगा. दूसरा, सेलुलर अस्तित्व, भेदभाव / परिपक्वता, और प्रतिरोपित एनएससी के परिणाम पर ध्वनि डेटा प्रदान करता है कि एक कुशल ट्रैकिंग प्रणाली की कमी थी. सबसे पहले पढ़ाई सामान्य गति की दिशा में जैसा कि रक्त प्रवाह में था तथा कुंचन में और प्रत्यारोपण 2,3 से axonal अनुमानों का पता लगाने के लिए प्रतिगामी लेबलिंग का उपयोग किया. हालांकि, इन तकनीकों केवल आंशिक रूप से और अक्सर unclearly लेबल axonal grafted कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाले अनुमानों, और दरियाफ्त तरीकों subjec हैंप्रत्यारोपित कोशिकाओं से परे डाई रिसाव की वजह से कलाकृतियों को टी. अन्य समूहों घायल कृंतक रीढ़ की हड्डी 5,6 में मानव भ्रूण एनएससी के प्रत्यारोपण के बाद axonal अनुमानों लेबल करने के लिए मानव विशिष्ट neuronal मार्कर का इस्तेमाल किया. हालांकि, उन अध्ययनों में, xenografts लगातार अच्छी तरह से जीवित नहीं था. हाल ही में, GFP रिपोर्टर जीन के वायरल वितरण सुसंस्कृत एनएससी 7,8 लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, GFP अभिव्यक्ति अक्सर असंगत था और 7 नीचे विनियमित किया जा सकता है. हाल ही में, stably रिपोर्टर जीन, GFP, या मानव अपरा alkaline फॉस्फेट व्यक्त ट्रांसजेनिक दाता चूहों या चूहों के उपयोग में नाटकीय रूप से इन विवो 9,11 में प्रतिरोपित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं / progenitors की ट्रैकिंग में सुधार हुआ है. तीसरा, कई अध्ययनों बरकरार या घायल वयस्क रीढ़ की हड्डी में भ्रष्टाचार के परिवेश में प्रत्यारोपित जब भ्रूण या वयस्क या तो सीएनएस से निकाली गई इन विट्रो सुसंस्कृत चूहा एनएससी विशेष रूप से glial प्रजातियों में अंतर संकेत मिलता है किइन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं स्थानीय वातावरण स्टेम कोशिकाओं के भाग्य का हुक्म हो सकता है यह दर्शाता है कि न्यूरॉन्स और इन विट्रो में glia दोनों में फर्क करने में सक्षम हैं कि इस तथ्य के बावजूद डी 7,12,13,. वैकल्पिक रूप से, सुसंस्कृत एनएससी, वयस्क सीएनएस से ली गई है, खासकर उन विवो 13 में glial प्रजातियों में अंतर करने के लिए आंतरिक defaulty संपत्ति हो सकती है.

क्योंकि ऊपर चर्चा की सीमाओं के कारण, हमारे समूह ने हाल ही में गंभीर रूप से घायल वयस्क रीढ़ की हड्डी में भ्रूण एनएससी ट्रैकिंग, अस्तित्व, और भेदभाव / परिपक्वता सुधार करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल विकसित की है. संक्षेप में, हम में विवो प्रत्यारोपण 14 के बाद GFP अभिव्यक्ति को बनाए कि एक GFP रिपोर्टर जीन व्यक्त एक स्थिर ट्रांसजेनिक फिशर 344 चूहा inbreed लाइन के साथ शुरू हुआ. अगला, हम भ्रूण दिन से 14 फिशर 344 रीढ़ की हड्डी, न्यूरॉन्स और glia दोनों उत्पन्न करने की क्षमता बरकरार रखती है कि विकास का एक मंच हौसले से अलग एनएससी इस्तेमाल किया. अंत में, हम एम्बेडेडविकास युक्त एक आतंच मैट्रिक्स में हौसले से अलग एनएससी कोशिकाओं को बनाए रखने और समान रूप से भ्रष्टाचार सेल अस्तित्व, भेदभाव और एकीकरण का समर्थन करने के लिए लक्ष्य एक बड़े घाव गुहा के भीतर उन्हें वितरित करने के लिए 15-17 कारकों. Grafts T3 पूरा transection, रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद दो सप्ताह के स्थलों में रखा गया था. ये grafted कोशिकाओं को लगातार पूरा transection साइटों भरा और लंबी दूरी की 18 से अधिक मेजबान रीढ़ की हड्डी में axons की बड़ी संख्या को बढ़ा दिया है कि प्रचुर मात्रा में न्यूरॉन्स में विभेदित. इसी तरह के परिणाम इम्युनो कमी चूहों 18 को सभ्य मानव तंत्रिका स्टेम सेल grafts का उपयोग कर प्राप्त किया गया.

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल VA सैन डिएगो संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं. प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और सुरक्षा के लिए एनआईएच दिशा निर्देशों का कड़ाई से पालन कर रहे हैं. पशु अध्ययन के दौरान भोजन और पानी के लिए नि: शुल्क उपयोग कर सकते है और पर्याप्त रूप से दर्द और परेशानी को कम करने के लिए इलाज कर रहे हैं.

1. आतंच घटक की तैयारी ग्रोथ फैक्टर कॉकटेल युक्त

  1. (सामग्री तालिका देखें) 50 मिलीग्राम / एमएल 2x शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए 0.5 मिलीलीटर पीबीएस में 25 मिलीग्राम चूहे फाइब्रिनोजेन भंग. फाइब्रिनोजेन भंग करने के लिए मुश्किल है और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या waterbath में रखा जाता है और 1-2 घंटे के लिए हर 5-10 मिनट हिल जाना चाहिए.
  2. 50 यू / मिलीलीटर 2x शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए 10 मिमी बाँझ 2 CaCl 2 मिलीलीटर में 100 संयुक्त राष्ट्र चूहा थ्रोम्बिन भंग.
  3. 100 μl शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित सांद्रता में पीबीएस में वृद्धि कारकों भंग: 1 मिलीग्राम / एमएल: BDNF; विवो में intrathecal प्रेरणा के रूप में NT-3 (उच्च स्टॉक एकाग्रता
  4. 50 मिमी DMSO के शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए 1.3 मिलीलीटर DMSO में 25 मिलीग्राम MDL28170 (calpain अवरोध करनेवाला) भंग, और फिर 1 मिमी शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए पीबीएस में 50x पतला.
  5. 1,000 μl वृद्धि कारक कॉकटेल समाधान (चित्रा 1) के उत्पादन के लिए प्रत्येक विकास कारक घटक के 100 μl और MDL28170 (1 मिमी शेयर समाधान) के 100 μl मिलाएं.
  6. सी. ° -70 में भंडारण के लिए 10 या 20 μl में वृद्धि कारक है और विभाज्य युक्त 25 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन काम कर समाधान प्राप्त करने के लिए 500 μl वृद्धि कारक कॉकटेल के साथ 500 μl फाइब्रिनोजेन 2x शेयर समाधान मिक्स समाधान -70 डिग्री सेल्सियस पर करने के लिए 12 महीने के लिए स्थिर है
  7. इसी तरह, भंडारण एक के लिए इसी तरह की 10 या 20 μl संस्करणों में वृद्धि कारक है और विभाज्य युक्त 25 यू / एमएल थ्रोम्बिन काम कर समाधान प्राप्त करने के लिए 500 μl वृद्धि कारक कॉकटेल के साथ 500 μl थ्रोम्बिन 2x शेयर समाधान मिश्रणटी -70 डिग्री सेल्सियस के लिए 12 महीने के लिए.
  8. कोशिकाओं के साथ मिश्रित जब तक कलम बांधने का काम के दिन, बर्फ पर फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन युक्त वृद्धि कारक कॉकटेल जगह है.

2. T3 स्पाइनल कॉर्ड transection

  1. स्वीकार्य तरीकों का उपयोग कर वयस्क महिला फिशर 344 चूहों या athymic नग्न चूहों anesthetize. पूंछ और पंजा चुटकी के लिए जवाबदेही पूरी तरह से अनुपस्थित रहे हैं जब विषयों को गहराई से, anesthetized हैं. नोट: हम आम तौर पर 150-200 ग्राम फिशर चूहों या 180-220 ग्राम athymic चूहों, और ketamine के एक संज्ञाहरण कॉकटेल (2 मिलीग्राम / किग्रा) (25 मिलीग्राम / एमएल), xylazine (1.3 मिलीग्राम / एमएल) और acepromazine (0.25 मिलीग्राम का उपयोग / एमएल).
  2. जानवरों संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं, जबकि सूखापन या आंखों की चोट को रोकने के लिए नेत्र मरहम लागू करें.
  3. ऊपरी वक्ष क्षेत्र दाढ़ी और betadine साथ त्वचा को साफ.
  4. , # 15 ब्लेड का उपयोग त्वचा और मांसपेशियों में कटौती एक शल्य retractor का उपयोग T3 बांस का पर्दाफाश, और एक rongeur का उपयोग T3 / 4 रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए T3 बांस पर एक laminectomy प्रदर्शन.
  5. एक लंदन बनाओएक # 11 ब्लेड का उपयोग लगभग 2 मिमी लंबाई की ड्यूरा में gitudinal midline चीरा.
  6. सही पार्श्व पूरे रीढ़ की हड्डी में कटौती करने ड्यूरा नीचे iridectomy कैंची रखें. 1.5 मिमी अधिक cadually एक ही पक्ष पर एक और कटौती करें.
  7. मध्यम तीव्रता वैक्यूम से जुड़े एक कुंद 23 जी सुई के साथ दो कटौती खंडों के बीच महाप्राण रीढ़ की हड्डी के ऊतकों. पेट के बल और laterally पूरा transection सुनिश्चित करने के लिए दृश्य सत्यापन का प्रयोग करें. यह एक पार्श्व hemisection पूरा हो जाएगा.
  8. एक पूर्ण चौड़ाई रीढ़ की हड्डी transection को घाव का विस्तार बाईं hemicord में दर्पण चीरों रखने के लिए. दो हफ्ते बाद grafted जब घाव साइट में फर्म भ्रष्टाचार / आतंच मैट्रिक्स को बनाए रखने के लिए, पहली कट के अलावा अन्य बरकरार ड्यूरा छोड़ने के लिए प्रयास करें.
  9. , मांसपेशियों सिवनी एंटीबायोटिक पाउडर और प्रधान त्वचा लागू होते हैं.
  10. Lactated घंटी (3 एमएल) इंजेक्षन, Bannamine (2.5-5 मिलीग्राम / किग्रा) और एम्पीसिलीन (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) तुरंत सर्जरी और माई के बाद (सामग्री तालिका देखें)एक गर्म इनक्यूबेटर में ntain चूहों तापमान फिर से स्थापित किया है जब तक.
  11. मूत्राशय खाली और (चित्रा 1 बी) खाली पलटा मूत्राशय की स्थापना के बारे में जब तक दो सप्ताह के लिए दिन में दो बार घंटी और एम्पीसिलीन समाधान इंजेक्षन.

3. हौसले Dissociated भ्रूण दिन की तैयारी 14 स्पाइनल कॉर्ड तंत्रिका स्टेम सेल

  1. Inbreed ट्रांसजेनिक GFP F344 चूहों चूहा संसाधन से (F344 टीजी (यूबीसी-EGFP) F455Rrrc) और अनुसंधान केंद्र, मिसौरी विश्वविद्यालय प्राप्त करते हैं.
  2. 40 माइक्रोग्राम des-Gly 10 इंजेक्षन, [डी आला 6]-Leuteinizing हार्मोन 2 के बाद 200 की एकाग्रता माइक्रोग्राम / परिपक्व महिला चूहा (8 सप्ताह या उससे अधिक उम्र) प्रति (आईपी) intraperitoneally एमएल पीबीएस में पतला हार्मोन Ethylamide (LHRH) का विमोचन भ्रूण संग्रह के तुल्यकालन के लिए -3 घंटा प्रकाश प्रेरण.
  3. 4 दिनों के इंजेक्शन के बाद एक परिपक्व GFP समयुग्मक या विषमयुग्मजी पुरुष चूहे रात भर साथ दोस्त.
  4. दिनों 13.5-14.5 postcoitus में भ्रूण लीजिएया एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप - ठंड HBSS बफर में (पीसी), एक "NightSea" टॉर्च और फिल्टर चश्मे (ब्लूस्टार टॉर्च और मॉडल VG1 बाधा फिल्टर BLS1) के तहत GFP अभिव्यक्ति की जांच.
  5. प्रत्येक GFP पॉजिटिव भ्रूण से aseptically बाहर रीढ़ की हड्डी के टुकड़े करना और overlying तानिका और iridectomy कैंची और ठीक जौहरी संदंश के साथ संलग्न रीढ़ की ganglia हटा दें.
  6. एक 15 मिलीलीटर cornical ट्यूब में 2 मिलीलीटर ठंड HBSS बफर में विच्छेदित रीढ़ की हड्डी डोरियों लीजिए और बर्फ पर रख.
  7. Dissected स्पाइनल तार अलग कर देना करने के लिए संदर्भ # 20 का पालन करें:
    1. संक्षेप में, (कई डोरियों 1 कॉर्ड एक विषय के भ्रष्टाचार के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं, एक साथ पचा जा सकता है) विच्छेदित स्पाइनल तार युक्त ट्यूब को 0.25% trypsin EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 10-12 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाने.
    2. ट्यूब और अपकेंद्रित्र 2 मिनट के लिए 2500 rpm पर ऊतक के लिए 10% FBS युक्त DMEM के 10 मिलीलीटर जोड़कर trypsin प्रतिक्रिया बंद करो.
    3. 2 मिलीलीटर neurobasal मध्यम सह में ऊतक Resuspend2% B27 ntaining, और उत्तरोत्तर छोटे आग पॉलिश पाश्चर pipets का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी के ऊतकों triturate.
    4. अपकेंद्रित्र एक 40 माइक्रोन सेल फिल्टर झरनी के साथ 2 मिनट, B27 युक्त neurobasal मध्यम 2 मिलीलीटर में Resuspend, और फिल्टर कोशिकाओं के लिए 2500 rpm पर कोशिकाओं.
  8. एक hemocytometer साथ कक्षों की गणना और समान रूप से दो Eppendorf ट्यूबों में कोशिकाओं के विभाजन.
  9. कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटाने (1-2 मिनट के लिए एक कम वैक्यूम टिप के साथ सभी सतह पर तैरनेवाला वापस लेने के लिए आवश्यक हैं) तो वृद्धि कारक कॉकटेल सेल फिर से निलंबन के बाद शेष सतह पर तैरनेवाला द्वारा पतला नहीं किया जाएगा.
  10. (लगभग ⅓ अंतिम मात्रा के लिए सेल गोली मायने रखता है) 250000 कोशिकाओं / μl की एकाग्रता में क्रमश: वृद्धि कारकों, जिसमें फाइब्रिनोजेन या थ्रोम्बिन काम कर समाधान में कोशिकाओं के प्रत्येक आधा Resuspend और (चित्रा 1 ए) बर्फ पहले प्रत्यारोपण पर उन्हें जगह है. सेल के साथ मिश्रित जब कि फाइब्रिनोजेन अनायास जेल हो सकती हैएस घाव / भ्रष्टाचार साइट पर थ्रोम्बिन के साथ संयोजन के पहले; समय से पहले gellation से बचने के लिए, तुरंत विवो में सेल ग्राफ्टिंग पहले फाइब्रिनोजेन में कोशिकाओं मिश्रण.

4. ट्रांसप्लांटेशन

  1. दो सप्ताह के लिए रीढ़ की हड्डी transection के बाद lesioned T3 / 4 रीढ़ की हड्डी Reexpose.
  2. 5 μl फाइब्रिनोजेन कोशिकाओं और 5 μl थ्रोम्बिन कोशिकाओं सीधे घाव साइट को फिर से खोलने के बिना सील निशान ऊतक और बरकरार ड्यूरा के माध्यम से घाव साइट के नौ अंक में इंजेक्ट किया जा सकता है.
  3. केंद्र में 3 (मध्य बिंदु में एक और लेटरल में दो, और अलग 0.5 मिमी दूरी पर) और विजय - स्तम्भ दोनों में 3: निशान ऊतक और बरकरार ड्यूरा 1-2 सप्ताह के बाद घाव की सतह पर 9 छेद बनाने के लिए एक 27 जी सुई का प्रयोग करें और दुम इंटरफेस (घाव के केंद्र के बारे में 0.5 मिमी विजय - स्तम्भ या दुम) में 3.
  4. तब विजय - स्तम्भ इंटरफेस और वायु के 3 अंक में घाव साइट और एक चौथाई मात्रा का तीन केंद्रीय अंक में फाइब्रिनोजेन सेल समाधान की आधी मात्रा इंजेक्षनदुम इंटरफेस के 3 अंक में uarter मात्रा.
  5. फिर तुरंत ही स्पॉट में throbmbin कोशिकाओं इंजेक्षन. फाइब्रिनोजेन कोशिकाओं और घाव साइट के अंदर थ्रोम्बिन कोशिकाओं के मिश्रण घाव साइट में कोशिकाओं पकड़ को आतंच जेल बनेगी और विकास का पहलू कॉकटेल कोशिकाओं के अस्तित्व का समर्थन करेंगे. कोशिकाओं एक Picospritzer (जनरल वाल्व, Inc) से जुड़े खींच लिया गिलास pipettes का उपयोग इंजेक्ट कर रहे हैं.
  6. प्रत्यारोपण सुसंस्कृत मानव एनएससी ऊपर वर्णित एक ही प्रक्रिया में 21, और मानव अभिकर्मकों से बनाया आतंच और वृद्धि कारक कॉकटेल का उपयोग करें.

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Representative Results

GFP immunohistological लेबलिंग grafted चूहा एनएससी ही घाव / मेजबान मार्जिन के लिए संलग्न करने और बिना खाली घाव साइट के अधिकांश जा T3 transection साइट में खराब बच फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) (एक आतंच मैट्रिक्स और वृद्धि कारकों की कमी) में resuspended यह दर्शाता है कि grafted कोशिकाओं (2A चित्रा). अकेले आतंच matrices के साथ सह grafted जब एनएससी के अस्तित्व में सुधार, लेकिन भ्रष्टाचार को पूरी तरह से एक बड़ा घाव गुहा (नहीं दिखाया डेटा) को भरने नहीं दिया. इसलिए, हम रीढ़ की हड्डी transection 15-17 के बाद न्यूरॉन्स और glia में बड़े घाव cavities और भेदभाव से भरने, अपने अस्तित्व को बढ़ाने के लिए वृद्धि कारक कॉकटेल युक्त आतंच matrices में एनएससी एम्बेडेड. 18 (आंकड़े 2 बी सी) के बाद कलम बांधने का काम सात सप्ताह का मूल्यांकन जब चूहे या मानव एनएससी या तो की Grafts लगातार और पूरी तरह से घाव गुहा भरें.

हम जल्दी से जांच करने के लिए एक समय पाठ्यक्रम अध्ययन का प्रदर्शनअस्तित्व और विकास के कारक कॉकटेल के साथ आतंच matrices में एम्बेडेड एनएससी की ग्राफ्टिंग के बाद घाव गुहा के भरने. ऊतकीय विश्लेषण GFP व्यक्त एनएससी प्रत्यारोपण (आंकड़े 3 ए बी) के बाद अच्छी तरह से 24 घंटे बच गया कि पता चला. कलमी एनएससी धीरे - धीरे पूरी तरह से शायद की वजह से प्रसार 21 (आंकड़े -3 सी एच) के प्रत्यारोपण के बाद पहले सप्ताह से transected घाव गुहा को भरने के लिए समय के साथ और अधिक सघन हो गया. इसके अलावा, कलमी एनएससी मेजबान / घाव इंटरफेस में अच्छी तरह से एकीकृत और घाव गुहा (चित्रा 3) के हाशिये पर GFAP immunoreactivity के क्षेत्रों को कम करने के लिए दिखाई दिया.

कलमी एनएससी के एक हिस्से को सात सप्ताह प्रत्यारोपण (आंकड़े -4 ए बी) के बाद NeuN व्यक्त न्यूरॉन्स में विभेदित. इसके अलावा, भ्रष्टाचार व्युत्पन्न रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स लंबी दूरी 18 से अधिक विजय - स्तम्भ और दुम दिशाओं <दोनों में मेजबान रीढ़ की हड्डी में axons की बड़ी संख्या को बढ़ाया / Sup> (चित्रा 4C). कलमी व्युत्पन्न axons सफेद पदार्थ और मेजबान रीढ़ की हड्डी (आंकड़े 4D-ई) में ग्रे बात दोनों के माध्यम से rostrally और दुमदारी बढ़ाया.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रायोगिक योजनाबद्ध और समय रेखा. ए) Popovich 22 (सेल, 2012) से अनुकूलित योजनाबद्ध ड्राइंग आतंच जेल पूरी तरह से transected रीढ़ की हड्डी. बी) प्रायोगिक समय लाइन में वृद्धि कारक कॉकटेल को रोकने के साथ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यारोपण को दिखाता है. व्यवहार और electriophysiological विश्लेषण सेल ग्राफ्टिंग के बाद और छिड़काव से पहले किया जा सकता है. विषयों के अस्तित्व के समय चर हो सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

ntent "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 2
.. चित्रा 2 जीवन रक्षा और तंत्रिका के भरने T3 पूरी transection साइटें में सेल Grafts स्टेम क्षैतिज वर्गों में GFP और GFAP फ्लोरोसेंट immunolabeling वृद्धि कारक है और आतंच मैट्रिक्स कमी चूहे E14 एनएससी (हरा) पीबीएस में फिर से निलंबित (ए) गरीब अस्तित्व को दर्शाता है; ईसा पूर्व) उत्कृष्ट अस्तित्व और (बी) चूहा या (सी) मानव एनएससी वृद्धि कारक कॉकटेल युक्त आतंच matrices में एम्बेडेड थे जब घाव गुहा की पूरी भरने. सेल 7 सप्ताह के लिए T3 transection साइटों में grafted थे. स्केल बार, 310 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 3. भ्रष्टाचार अस्तित्व प्रारंभिक समय बिंदुओं पर. एबी) GFP और GFAP डबल immunolabeling शो अस्तित्व और transection साइट, एक आतंच मैट्रिक्स में 1 दिन के बाद आरोपण में grafted चूहा एनएससी का वितरण. एक में बॉक्सिंग क्षेत्र पैनल बी सीडी) सेल अस्तित्व और वितरण में उच्च वृद्धि में दिखाया गया है 7 दिनों तक दिन 2 में भी स्पष्ट है और (एफई) 3 दिन बाद ग्राफ्टिंग. जीएच), कोशिकाओं घाव साइट को भरने और सघन कर रहे हैं. स्केल पट्टी: ए, सी, ई, जी, 300 माइक्रोन; बी, डी, एफ, एच, 62 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
तंत्रिका Ste के चित्रा 4. भेदभाव और परिणामT3 पूरी transection साइट में एम सेल Grafts. एबी) GFP और NeuN लेबलिंग 7 सप्ताह ग्राफ्टिंग. सी) GFP के बाद और NeuN immunolabeling GFP-व्यक्त तंत्रिका स्टेम सेल grafts मेजबान रीढ़ की हड्डी की विजय - स्तम्भ में axons की बड़ी संख्या का विस्तार और पता चलता है कि grafted चूहा तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के व्यापक neuronal भेदभाव / परिपक्वता की पुष्टि transection साइट (दुम) दिखाया गया है, दो सप्ताह बाद ग्राफ्टिंग. डे) मेजबान रीढ़ की हड्डी के व्यापक क्षेत्रों सफेद पदार्थ और ग्रे बात दोनों में भ्रष्टाचार व्युत्पन्न axonal अनुमानों होते हैं कि पैनल सी शो के बॉक्सिंग क्षेत्रों से हायर बढ़ाई दुम. स्केल पट्टी: एबी, 62 माइक्रोन; सी, 700 माइक्रोन; डे, 62 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

घायल रीढ़ की हड्डी में एनएससी प्रत्यारोपण के लिए प्रमुख बाधाओं में से एक घाव केंद्र में गरीब अस्तित्व है. घाव साइट में कोई कमी या cavities संभवतः कम या supraspinal axons और चोट नीचे अलग रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों के बीच कार्यात्मक neuronal रिले के गठन को कमजोर कर सकता. इसके अलावा, कलमी एनएससी की गरीब अस्तित्व मेजबान ऊतक के साथ अपने एकीकरण प्रभावित है, और इसलिए मेजबान न्यूरॉन्स के साथ grafted न्यूरॉन्स की कनेक्टिविटी को कम कर सकते हैं. सेल नुकसान समझाने के लिए संभावित तंत्र साइटोटोक्सिक तीव्र एससीआई के द्वारा बनाई गई वातावरण, मेजबान रीढ़ की हड्डी के माध्यमिक अध: पतन, और घायल क्षेत्र 4 की अपर्याप्त vascularization शामिल हैं.

आतंच यह polymerized 23 हो जाता है जब यह कोशिकाओं और अणुओं रखने कर सकते हैं, के बाद से विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडल और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में कोशिकाओं, दवाओं और वृद्धि कारकों देने के लिए इस्तेमाल किया गया है. पिछले एक अध्ययन दिखा दिया है कि मानव आतंच सीलेंटdetectable प्रतिकूल प्रभाव 24 eliciting बिना रीढ़ की हड्डी transected subtotally में axonal उत्थान को बढ़ाने के लिए एक BioMatrix के रूप में सेवा कर सकते हैं. हम पहले से चिरकाल घायल रीढ़ की हड्डी 17 में प्रत्यारोपण के लिए अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं एम्बेड करने आतंच matrices इस्तेमाल किया. Grafted कोशिकाओं जीर्ण घाव साइट में अच्छी तरह से बच गया और मेजबान रीढ़ की हड्डी पैरेन्काइमा 17 के साथ अच्छी तरह से एकीकृत. इसलिए, हम transected रीढ़ की हड्डी में बड़े खुले घाव साइटों में प्रत्यारोपण के लिए एनएससी एम्बेड करने आतंच का उपयोग बढ़ाया. Grafted एनएससी के अस्तित्व आतंच के साथ सुधार किया है, grafted एनएससी के अस्तित्व के लिए कुछ हद तक चर बने रहे और एनएससी शायद ही कभी पूरी तरह से बड़े घाव गुहा भरा grafted.

इसलिए हम घाव साइट में एनएससी के अस्तित्व और प्रसार बढ़ाने के प्रयास में वृद्धि कारकों की एक कॉकटेल गयी. वृद्धि कारकों विट्रो 25 में एनएससी का समर्थन करने के लिए कई अध्ययनों में दिखाया गया है. WhiLe एनएससी की संस्कृतियों के लिए वृद्धि कारकों के अलावा, उनके भाग्य बदल सकते हैं वृद्धि कारक कॉकटेल वृद्धि कारकों के बिना उन आंशिक रूप से बच भ्रष्टाचार की तुलना करने के भ्रष्टाचार में जोड़ा जब हम गुणात्मक neuronal घनत्व में स्पष्ट परिवर्तन का पता नहीं चला. हम निश्चितता के साथ सेल भाग्य पर वृद्धि कारक कॉकटेल के प्रभाव की सराहना कर सकते से पहले एक अधिक विस्तृत विश्लेषण आवश्यक है. सामान्य तंत्रिका विकास के दौरान, न्यूरॉन्स के अस्तित्व और विकास अक्सर लक्ष्य ऊतक गाइड axonal विकास द्वारा जारी की है और, कुछ मामलों में, neuronal अस्तित्व 26 को प्रभावित कर रहे हैं कि neurotrophic कारकों पर निर्भर करती है.

इसी प्रकार सरल वृद्धि कारक कॉकटेल विट्रो और इन विवो 15,16 में दोनों एनएससी के अस्तित्व और भेदभाव को बढ़ाने के लिए अन्य समूहों द्वारा उपयोग किया गया है. इन प्रयासों में आम तौर पर हम गोद लिया है कि कई कारक दृष्टिकोण से भी कम व्यापक एनएससी अस्तित्व में हुई है. इस विकास में एक अनिवार्य अगले कदमप्रयास एनएससी अस्तित्व, चल रहा है कि एक प्रयास का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं कि कॉकटेल में वृद्धि कारकों की सूची को कम करने के लिए है. यह वृद्धि कारकों की एक और अधिक सीमित संख्या भ्रष्टाचार अस्तित्व, मानव अध्ययन करने के लिए इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण और अपने संभावित अनुवाद सरल होता है कि एक खोज के बराबर डिग्री का समर्थन करेंगे कि पूरी तरह से संभव है.

आतंच matrices और वृद्धि कारक कॉकटेल का उपयोग करने के अलावा, गंभीर घाव साइट के लिए vivo में ग्राफ्टिंग की सफलता घाव साइट में यांत्रिक कारकों पर निर्भर हो सकता है. हम यंत्रवत् घाव साइट में grafted कोशिकाओं को बनाए रखने के प्रयास में घावों और कलम बांधने का काम के बाद कृंतक रीढ़ की हड्डी, overlies कि अत्यंत पतली dural झिल्ली की अखंडता को बनाए रखने के लिए हर संभव प्रयास करते हैं. इस प्रकार, हम घाव साइट की संगत सेल भरने का अनुकूलन करने के लिए सावधान और मेहनती प्रयास करने की. इन कई प्रयासों के बिना, भ्रष्टाचार भरने अधूरा है. इन तकनीकों में व्यापक व्यावहारिक आवश्यकताCE.

दूसरों के लिए इस तकनीक सिखाने के प्रयास में, हम कुछ चुनौतियों की पहचान की है. कोशिकाओं मेजबान रीढ़ की हड्डी के बजाय घाव गुहा में इंजेक्ट कर रहे हैं, तो कोशिकाओं preferentially glia में अंतर हो सकता है. इस मामले में, उभरते axons की संख्या बहुत कम है. महान देखभाल और परिश्रम से ठीक पहले पैराग्राफ में वर्णित कई तकनीकों और तरीकों का उपयोग घाव गुहा को भरने के लिए नहीं बने हैं, तो सेल अस्तित्व कम अनुरूप है और अक्षतंतु परिणाम सहित जैविक प्रतिक्रियाओं, सीमित हैं. इस प्रकार, यह सफलतापूर्वक इन तरीकों का उपयोग करने के लिए काफी समय, परिश्रम और सूक्ष्म तकनीक समर्पित करने के लिए आवश्यक है. तकनीक का अधिग्रहण कर रहे हैं, परिणाम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र घाव साइटों में इन एनएससी की उल्लेखनीय जैविक गुणों का अध्ययन करने की क्षमता से बेदखल, जानवर से जानवर को अत्यधिक संगत कर रहे हैं.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम चूहा संसाधन और अनुसंधान केंद्र धन्यवाद, मिसौरी विश्वविद्यालय, कोलंबिया, मिसौरी, GFP चूहों प्रदान करने के लिए; मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए Neuralstem इंक. इस काम के दिग्गजों प्रशासन, एनआईएच (NS09881), कनाडा के रीढ़ की हड्डी में अनुसंधान संगठन, क्रेग एच. Neilsen फाउंडेशन, और बर्नार्ड और ऐनी स्पिट्जर चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen (rat) Sigma F6755-25MG 2 hr at 37 °C to dissovle
Stock Concentration: 50 mg/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat) Sigma T5772-100UN Dissovle in 10 mM CaCl2
Stock Concentration: 50 U/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human) Sigma F0291 (25 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine) Sigma E1257 (0.1 mg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human) Peprotech 452-02 (1 mg) Stock Concentration: 1,000 ng/μl
Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human) Peprotech 452-03 (1 mg) Stock Concentration: 1,000 ng/μl
Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat) Sigma G1401 (10 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse) Sigma I8779 (50 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human) Sigma F5542 (25 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human) Sigma P3076 (10 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human) Sigma H9661 (5 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170 Sigma M6690 (25 mg) Stock in DMSO
Stock Concentration: 1 mM
Final Concentration: 50 μM
PBS Millipore BSS-1005-B Stock Concentration: 1x
Final Concentration: 1x
DMSO Sigma D2650
Ketamine Putney 26637-411-01 40-80 mg/kg
Stock Concentration: 100 mg/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine Lloyd 0410, 2.5-8 mg/ml
Stock Concentration: 100 mg/ml
Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine Butler 003845 0.5-4 mg/ml
Stock Concentration: 10 mg/ml
Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine Healthpets BET16OZ
Ringers Abbott 04860-04-10 2-3 ml/inj
Banamine Schering-Plough 0061-0851-03 2.5-5 mg/kg
Stock Concentration: 50 mg/ml
Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin Sandoz 0781-3404-85 80-100 mg/kg
Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH Sigma L4513 200 μg/kg
Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS Gibco 14175-096
Trypsin Gibco 25200056 Stock Concentration: 0.25 %
Final Concentration: 0.125 %
DMEM Gibco 11995073
FBS Gibco 16000044 Stock Concentration: 100 %
Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium Gibco 21103049
B27 Gibco 17504044 Stock Concentration: 100x
Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs

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References

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गंभीर रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद आतंच और वृद्धि कारक कॉकटेल के साथ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अस्तित्व और भेदभाव की पदोन्नति
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Lu, P., Graham, L., Wang, Y., Wu, D., Tuszynski, M. Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (89), e50641, doi:10.3791/50641 (2014).

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