Summary
増殖因子を含むフィブリンマトリクスは、完全な脊髄切断の部位に移植された神経幹細胞を維持するために使用した。移植された細胞が完全に病変空洞を満たし、長距離のホスト脊髄に軸索を延長したニューロンを含む複数の神経細胞型に分化した。
Abstract
神経幹細胞（NSCは）自己再生および神経細胞とグリアに分化することができる。移植されたNSCは、脊髄損傷（SCI）後に失われたニューロンおよびグリアを置き換えることができ、かつ病変の上下脊髄セグメントを再接続するために、機能のリレーを形成することができる。神経幹細胞を移植する以前の研究は、脊髄病変キャビティ内の不完全な移植片の生存によって制限されている。さらに、移植細胞の生存、分化、および処理延長の追跡は、最適化されていなかった。運命は、特定の細胞型に牽引された場合を除き、最終的に、これまでの研究では、培養したラットのNSCは、一般的に、むしろ神経細胞よりも、損傷した脊髄に移植された際にグリアに分化することが報告された。これらの問題に対処するために、我々は、生存率を改善するために過酷なSCIの部位へのNSCの統合および分化を新たな方法を開発した。 NSCは新たにグリーンFLを発現する安定なトランスジェニックフィッシャー344ラットラインから胎生14日目の脊髄（E14）から単離したuorescentタンパク質（GFP）および成長因子を含有するフィブリンマトリックスに埋め込まれた;病変空洞内に移植された細胞を保持し、細胞生存を支持することを目的としたこの製剤。フィブリン/成長因子カクテル中のNSC、それによって炎症のピーク期間を避けて、二週間胸椎レベル3（T3）完全な脊髄離断後に移植した。その結果移植片は完全に病変空洞を充填して著しく長い距離、およびグリアを介してホスト脊髄に軸索を拡張し、両方のニューロンに分化した。 GFPを発現する培養ヒトNSCの移植片は同様の所見が得られた。したがって、方法は、神経幹細胞移植、生存およびインビボ所見の分析を改善するために定義されている。
Introduction
脊髄損傷（SCI）は、しばしば損害だけでなく、ニューロンと運動ニューロンのセグメント損失を引き起こす脳との間で信号を運ぶ白質路ではなく、中心灰白質、。 SCIの結果、モータおよび病変以下感覚機能の両方の喪失である。残念ながら、成人の中枢神経系（CNS）は、自然発生的に恒久的な機能欠損1で、その結果、再生成されません。そのため、運動、感覚および自律神経機能で負傷し、成人脊髄および改善の再構成はSCIの研究の重要な目標である。神経幹細胞（NSC）、直接、胚または成体CNSから単離されたかどうか、失われたニューロンおよびグリアを置き換えるために魅力的な候補細胞である。さらに、これらの細胞は損傷部位の2,3横切っ軸索伝導を回復するために新たな機能のリレーを形成する可能性を有する。
今日まで、解剖学的、electrophysの詳細な解明がなされていないiological、重度の脊髄損傷後に移植するNSCによる神経の中継形成の行動への影響。これにはいくつかの理由があります。大規模な病変空洞に移植する際、最初に移植されたNSCまたは胎児CNS組織が不十分生き残る。これまでの研究では、大規模な空の嚢胞性病変キャビティ4,5を残して、かなり初期のセル損失を示しています。いくつかの研究では移植された細胞はその後分裂し、病変空洞に4,5を満たしたが、これは数日から数週間の遅延の後に発生する可能性がある、とその後の病変部位の充填は、完全または一貫性がない可能性がありますでしょう。第二に、細胞の生存、分化/成熟、および移植されたNSCの成長に音声データを提供する効率的な追跡システムが欠けていた。最も初期の研究では、移植の2,3からの軸索投射をトレースする順行と逆行性標識を利用した。しかしながら、これらの技術は、部分的にのみ、しばしば不鮮明に移植された細胞から生じる軸索投射を標識し、トレーサー法は主観である移植された細胞を超えて色素漏出に起因するアーティファクトにトン。他のグループは、負傷した齧歯類の脊髄5,6にヒト胎児NSCの移植後の軸索投射にラベルを付けるために、人間の特定のニューロンのマーカーを使用していました。しかし、これらの研究では、 異種移植は一貫してうまく生存しなかった。最近では、GFPレポーター遺伝子のウイルス送達は、培養されたNSCの7,8を標識した。しかし、GFP発現は、しばしば矛盾していたと7をダウンレギュレートすることができる。近年、安定してレポーター遺伝子、GFP、又はヒト胎盤アルカリホスファターゼを発現するトランスジェニックドナーマウスまたはラットの使用は、劇的にインビボ 9,11 における移植神経幹細胞/前駆細胞のトラッキングを改善した。第三に、いくつかの研究は、そのまま、または負傷した成人の脊髄CORの環境に移植されたときのどちらか胚または成体CNSから派生したin vitroで培養したラットのNSCは、独占的にグリア系統に分化することを示すdは7,12,13、これらの神経幹細胞は、ローカル環境が幹細胞の運命を決定することができることを示す、 インビトロの両方でニューロンおよびグリアに分化することができるという事実にもかかわらず。あるいは、培養されたNSCは、成体CNS由来特には、 インビボ 13 におけるグリア系譜に分化する固有のdefaulty性を有していてもよい。
そのため、上述の制限のため、我々のグループは最近、重傷を負った成人の脊髄の胚性NSCの追跡、生存および分化/成熟を改善するために新しいプロトコルを開発しました。簡単に言えば、我々は、生体内移植後の14 GFPの発現を維持GFPレポーター遺伝子を発現する安定なトランスジェニックフィッシャー344ラットの近親交配するラインから始まりました。次に、我々は日胚から14フィッシャー344脊髄、神経細胞とグリアの両方を生成する可能性を保持している開発の段階を新たに単離したNSCを使用していました。最後に、組み込み増殖を含むフィブリンマトリックス中へ新たに解離されたNSCは、移植細胞の生存、分化および統合をサポートすることを目指し、細胞を保持し、均一に大きな病変キャビティ内にそれらを配布する15-17因子 。移植片は、完全な離断T3、脊髄損傷後2週間の部位に配置した。これらの移植された細胞は、一貫して完全な離断サイトを満たし、長い距離18を介してホスト脊髄への軸索の多数を拡張し、豊富な神経細胞に分化した。同様の結果は、免疫不全ラット18まで培養ヒト神経幹細胞移植片を用いて得た。
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Protocol
全ての動物プロトコルは、VA-サンディエゴ機関動物実験委員会（IACUC）によって承認されています。実験動物のケアと安全のためのNIHガイドラインを厳格に従っている。動物は、試験期間を通して食物と水を自由にアクセスし、適切に痛みや不快感を最小限にするために処理される。
1。フィブリン成分の製造は、成長因子カクテルを含む
- （材料の表を参照）50 mg / mlの2倍の原液を得るために、0.5ミリリットルのPBSに25 mgのラットフィブリノゲンを溶解する。フィブリノゲンは溶解が困難であり、37℃のインキュベーターまたは水浴中に入れ、1〜2時間毎に5〜10分間振盪されるべきである。
- 50 U / mlの2×ストック溶液を得10mMの無菌のCaCl 2 2mlに100 UNラットトロンビンを溶解する。
- 100μlのストック溶液を得るために、以下の濃度でPBS中の増殖因子を溶解する：1 mg / mlの：BDNF; 生体内での髄腔内注入などのNT-3（高ストック濃度
- 50mMのDMSOストック溶液を得るために1.3ミリリットルDMSO中に25mgのMDL28170（カルパイン阻害剤）を溶解し、次いで、1mMのストック溶液を得るためにPBSで50倍希釈する。
- 1,000μ成長因子カクテル溶液（ 図1）を生成するために各増殖因子成分を100μlとMDL28170（1mMストック溶液）100μLを混合する。
- -70℃で保存するため10または20μLに成長因子および分量を含む25 mg / mlのフィブリノゲンワーキング溶液を得500μlの成長因子カクテルで500μlのフィブリノゲン2Xストック溶液を混ぜるソリューションは、-70℃で最大12ヶ月間安定している
- 同様に、ストレージAの類似の10または20μlのボリュームに成長因子および分量を含む25単位/ mlのトロンビン作用溶液を得るために、500μlの成長因子カクテルで500μlのトロンビン2Xストック溶液を混ぜるT -70℃〜最大12ヶ月間。
- 細胞と混合するまで、移植の日に、氷上でフィブリノゲンとトロンビン含有成長因子カクテルを配置。
2。T3脊髄切断
- 許容できる方法を使用して、成熟雌のフィッシャー344ラットまたは無胸腺ヌードラットを麻酔。尾や足のピンチに対する応答性が完全に存在しないとき、被験者は深く、麻酔する。注意：我々は、通常、150〜200グラムFischerラットまたは180〜220グラム無胸腺ラット、およびケタミンの麻酔カクテル（2ミリリットル/キログラム）（25 mg / ml）を、キシラジン（1.3 mg / ml）をし、アセプロマジン（0.25 mgの使用/ mlで）。
- 動物が麻酔下にある間、目の乾きやけがを防ぐために、眼軟膏を適用します。
- 胸部上部エリアを剃るとベタジンで皮膚を洗浄してください。
- 、＃15ブレードを使用して皮膚や筋肉を切る手術用リトラクターを使用したT3脊椎骨を露出させて、骨鉗子を使用して、T3 / 4脊髄を露出させ、T3椎骨の椎弓切除を行う。
- LONを作る＃11ブレードを使用して、約2ミリメートルの長さの硬膜内gitudinal正中切開。
- 右横脊髄全体をカットする硬膜の下に虹彩切除はさみを入れます。 1.5ミリメートル以上cadually同じ側に別のカットを作る。
- 中等度の強度の真空に接続鈍い23Gの針で2カットセグメント間の吸引除去脊髄組織。腹側および横方向に完全な離断を確実にするために視覚的な検証を使用してください。これは横方向の片側切断を完了します。
- 左hemicordに全角の脊髄切断、場所ミラー切開に病変を拡張することができます。 2週間後に移植された際に、損傷部位にしっかりと移植/フィブリンマトリックスを保持するには、最初のカット以外に、そのまま硬膜を残してしようとします。
- 筋肉を縫合、抗生物質粉末と主食スキンを適用。
- Bannamine（2.5-5 mg / kg）を、アンピシリン（80〜100 mg / kg）を（材料の表を参照）、すぐに手術後やチェンマイ、乳酸リンゲル（3ミリリットル）を注入暖かいインキュベーターでntainラット体温調節が再確立されるまで。
- 膀胱を空にして（ 図1B）を空に反射的膀胱の設立まで、約2週間の一日二回リンゲル、アンピシリンソリューションを注入する。
新鮮解離日胚の3。準備14脊髄神経幹細胞
- ラット資源研究センター、ミズーリ大学から（F344-TG（UBC-EGFP）F455Rrrc）近親交配させるトランスジェニックGFP F344ラットを入手します。
- 2の後に成熟した雌ラット（8週齢以上）あたり（IP）200μgの/腹腔mLの濃度でPBS中に希釈し40μgのDES-Glyの10、ホルモンエチルアミドの解除[D-アラ6] -黄体形成ホルモン（LHRH）を注入胚コレクションの同期のための-3時間の明誘導。
- 4日間の注射後、成熟したGFPホモ接合またはヘテロ接合雄のラットを一晩シートつき。
- 日13.5から14.5性交後の胚を収集（ - 藍星懐中電灯とモデルVG1バリアフィルタBLS1）または蛍光顕微鏡冷HBSS緩衝液（PC）は、「NightSea "懐中電灯とフィルタメガネの下でGFPの発現を調べる。
- 各GFP陽性の胎児から無菌的に脊髄を解剖し、虹彩切除はさみや細かい宝石商の鉗子で覆う髄膜および添付脊髄神経節を削除する。
- 15ミリリットルcornical試験管内の2ミリリットル冷HBSSバッファに解剖した脊髄を収集し、氷上に保つ。
- 解剖脊髄を解離するために、基準＃20は、次のとおりです。
- 簡単に言うと、（いくつかのコードは1コードは1被写体の移植に十分な細胞を生成することができ、一緒に消化することができる）を解剖脊髄を含むチューブに、0.25％トリプシン-EDTAの2ミリリットルを追加し、10月12日分、37℃で消化する。
- 遠心管で2分間2,500 rpmで組織に10％FBSを含むDMEM 10mlのトリプシンを添加することにより反応を停止する。
- 2ミリリットル神経基礎培地中のCOの組織を再懸濁2％のB27をntainingし、徐々に小さく火造りパスツールピペットを用いて、脊髄組織を粉砕する。
- 遠心40μmのセルストレーナーフィルターで2分間、B27を含有するNeurobasal培地2ml中に再懸濁し、フィルタセルのために2,500 rpmでの細胞。
- 血球計数器を用いて細胞をカウントし、均等に2エッペンドルフチューブに細胞を分割します。
- 細胞を遠心分離し、完全に上清を除去（1〜2分は、低真空の先端を持つすべての上清を撤回する必要がある）ので、成長因子カクテルがセル再懸濁した後に残った上清によって希釈されることはありません。
- （約⅓最終容量のための細胞ペレット数）250,000細胞/μLの濃度で、それぞれの成長因子を含むフィブリノゲンまたはトロンビン作用溶液中の細胞の再懸濁各半分、そして氷移植前（ 図1A）の上に置きます。細胞と混合した際、フィブリノゲンが自然にゲル化できることに注意してください病変/移植部位でトロンビンと組み合わせる前に、S;時期尚早のゲル化を回避するために、 インビボでの細胞移植の直前にフィブリノーゲンで細胞を混合する。
4。移植
- 二週間脊髄離断後の病変T3 / 4脊髄をReexpose。
- 5μlのフィブリノゲン細胞および5μlのトロンビン細胞が直接病変部位を再度開かずに密封された瘢痕組織および完全な硬膜を通して病変部の9点に注入することができた。
- 中心部にある3（中間点に1つ、中途での2、そして離れて0.5ミリメートルの間隔）と吻側の両方で3：瘢痕組織および完全な硬膜1〜2週間後の病変の表面の9ホールを作成するために27のGの針を使用して、および尾側インターフェース（病変の中心から約0.5ミリメートル吻側または尾側）にある3。
- その後、吻側インターフェイスと水溶液の3点に病変部位や四半期ボリュームの3つの中心点にフィブリノゲン細胞溶液の半分の容積を注入尾側インタフェースの3点にuarter量。
- その後、すぐに同じスポットにthrobmbin細胞を注入する。病変部位内部のフィブリノーゲンおよびトロンビン細胞細胞の混合物が病変部位に細胞を保持するために、フィブリンゲルを形成し、成長因子のカクテルは、細胞の生存を支援する。細胞をPicoSpritzer（一般バルブ社）に接続された引き上げたガラスピペットを用いて注入される。
- 上記と同様の手順で移植培養したヒトのNSC 21、および人間の試薬 から作られたフィブリンおよび増殖因子カクテルを使用しています。
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Representative Results
GFP免疫組織学的標識は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（フィブリンマトリックスおよび増殖因子を欠く）中に再懸濁グラフトラットのNSCのみ病変/宿主マージンに付着しない空の病変部位の大部分を残し、T3離断部位に乏しい生存したことを実証移植された細胞（ 図2A）。単独のフィブリンマトリックスとの共同移植されたとき、NSCの生存率は改善したが、移植は完全に大規模な病変空洞（データは示されていない）をいっぱいにしませんでした。そこで、脊髄離断後15-17ニューロンおよびグリアに大きな病変空洞および分化の充填、それらの生存を増強する成長因子カクテルを含有するフィブリンマトリクス内にNSCを埋め込 ま。 18（ 図2B-C）を移植後7週間評価した場合、ラットまたはヒトのNSCのどちらかの移植片は、一貫して完全に病変空洞を埋める。
我々は早期に検討する時間的経過の研究を行った生存および成長因子カクテルとフィブリンマトリクスに埋め込まれたNSCの移植後の病変空洞の充填。組織学的分析は、GFPを発現するNSCは、移植（ 図3A-B）後にウェル24時間を生き延びたことを明らかにした。移植されたNSCは、徐々に完全におそらく増殖21（ 図3C-H）に移植後最初の週で離断病変空洞を埋めるために時間をかけてより密になりました。また、グラフトされたNSCは、ホスト/病変の界面でよく統合され、病変の空洞（ 図3）の縁においてGFAP免疫反応性の領域を減少させるように見えた。
移植されたNSCの部分は7週移植（ 図4A-B）の後のNeuNを発現する神経細胞に分化した。また、移植片由来の脊髄ニューロンは、長距離18 <にわたって吻側および尾側の両方向に宿主脊髄への軸索の多数の拡張 / SUP>（ 図4C）。移植された派生軸索は、ホスト脊髄（ 図4D-E）に白質と灰白質の両方を通って吻側および尾側に拡張。
図1実験回路図と時刻ライン。 A）ポポビッチ22（ セル2012）から適合模式図は、フィブリンゲルが完全に離断脊髄。B）実験のタイムラインに成長因子カクテルを含有すると、神経幹細胞の移植を示す。行動およびelectriophysiological分析は、細胞移植後および灌流の前に行うことができる。対象者の生存時間を可変とすることができます。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
。図2の生存と神経の充填は、T3の完全な離断サイト内の細胞移植片幹水平部におけるGFPおよびGFAP蛍光免疫標識は、ラットE14 NSCの（A）の低い生存率（緑）、PBSに再懸濁する方法を示し、増殖因子およびフィブリンマトリックスを欠いた。 BC）素晴らしい生存および病変空洞の完全な充填（B）ラットまたは（C）ヒトNSCは、成長因子のカクテルを含有するフィブリンマトリックスに包埋した。セルは、7週間のT3離断部位へ移植した。スケールバー、310ミクロンは。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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図3。グラフト生存初期の時点で。 A-B）、GFPおよびGFAP二重免疫標識ショーの生存と離断サイト、フィブリンマトリックス中の1日の移植後における移植されたラットのNSCの分布。 Aの四角で囲んだ領域は、細胞の生存および分布は2日目と（E-F）3日後の移植でも明らかである）パネルB のCDでより高い倍率で表示されます。GH）の 7日までに、細胞が損傷部位を記入し、密度が高い。スケールバー：A、C、E、G、300ミクロン; B、D、F、H、62ミクロンは。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図4。分化と神経マリーの副産物T3の完全な離断サイト内のM細胞移植片。 AB）GFPとNeuNの標識は、7週グラフト。C）GFP後のNeuN免疫標識は、GFP-発現神経幹細胞移植片が宿主脊髄吻側に軸索を大量に延びていることを明らかに移植されたラットの神経幹細胞の豊富な神経分化/成熟を 確認離断サイト（尾側を図示）、2週間後の移植。DE）ホスト脊髄の広範な領域が、白質と灰白質の両方における移植片由来の軸索投射が含まれているパネルCショーの箱入りの領域から高倍率まで尾。スケールバー：A-B、62ミクロン; C、700ミクロン; DE、62程度である。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
損傷した脊髄内のNSC移植のための主要な障害の1つは、病変の中心部での低い生存率である。病変部位にギャップまたはキャビティは、潜在的に軽減または脊柱上軸索と傷害下の分離された脊髄セグメント間の機能的神経細胞のリレーの形成を弱める可能性があります。また、グラフトされたNSCの生存率不良が宿主組織との統合に影響を与えるので、ホストニューロンとニューロンのグラフトされた接続性を低減することができる。セル損失を説明するための潜在的なメカニズムは、細胞毒性急性SCIによって作成された環境で、ホスト脊髄の二次的変性、および損傷領域4の不十分な血管新生が含まれています。
フィブリンは重合し23になったときは、細胞および分子を保持することができるので、様々な実験モデルおよび臨床用途における細胞、薬物および成長因子を送達するために使用されている。以前の研究では、ヒトフィブリンシーラントを実証検出可能な悪影響24を誘発することなく、脊髄離断亜全における軸索再生を増強するための生体マトリクスとして機能することができる。我々は以前に慢性的に損傷した脊髄17への移植のための骨髄間質細胞を埋め込 むために、フィブリンマトリックスを用いる。移植された細胞は、慢性病変部位ではよく生存し、ホスト脊髄実質17とうまく統合されています。したがって、我々は離断脊髄中の大規模なオープン病変部位への移植のためにNSCを埋め込むために、フィブリンの使用を拡張しました。移植されたNSCの生存率は、フィブリンで改善したが、移植されたNSCの生存率は幾分可変ままでのNSCはほとんど完全に、大きな病変空洞を埋めていない移植された。
したがって、我々は、病変部位におけるNSCの生存および増殖を促進する目的で、成長因子のカクテルを添加する。成長因子は、インビトロ 25 に NSCをサポートするために、数多くの研究において示されている。 WHIルNSCの培養物への成長因子の添加は、彼らの運命を変えることができ、成長因子カクテルが部分的に成長因子なしで移植を生き残ったものに比較して、移植片に添加したとき、我々は定性的に、神経密度の明らかな変化を検出しませんでした。我々は確実に細胞の運命に対する増殖因子のカクテルの影響を理解することができる前に、より詳細な分析が必要である。正常な神経の発達の間、ニューロンの生存および増殖は、しばしば、標的組織案内軸索成長によって放出され、いくつかのケースでは、ニューロンの生存に影響を与えている26神経栄養因子に依存する。
類似しているが、単純な成長因子カクテルは、 インビトロおよびインビボの両方で 15,16 NSCの生存および分化を増強するために他のグループによって利用されてきた。これらの努力は、一般的に我々が採用している複数の要因によるアプローチよりも少ない大規模なNSCの生存をもたらした。この開発に不可欠な次のステップ努力が、NSCの生存、進行中である努力を支援するために不可欠であるカクテルの成長因子のリストを絞り込むことです。これは、成長因子のより限定された数は、ヒトでの研究は、この実験的アプローチとその潜在的な変換を単純化する発見を移植片の生存を同程度をサポートすることは完全に可能である。
フィブリンマトリックスおよび成長因子カクテルの使用に加えて、重度の病変部位にインビボで移植の成功は、病変部位における機械的要因に依存し得る。私たちは、機械的に病変部位に移植された細胞を保持する目的で、病変および移植後の齧歯類の脊髄の上に位置する非常に薄い硬膜の完全性を維持するためにあらゆる努力をする。したがって、我々は、病変部位の一貫したセル充填を最適化するための慎重かつ勤勉な努力をする。これらの複数の努力がなければ、移植片の充填が不完全です。これらの技術は、大規模なpractiが必要ですCE。
他の人にこのテクニックを教えるしようと、我々はいくつかの課題を特定した。宿主細胞は、脊髄病変の代わりにキャビティ内に注入される場合、細胞は、優先的にグリアに分化することができる。この場合には、新興の軸索の数が大幅に削減される。細心の注意と努力を先行する段落に記載の複数の技術およびアプローチを用いて、病変空洞を充填するために行われていない場合、細胞生存はあまり一致しており、軸索伸長を含む生物学的応答は、限られている。このように、成功して、これらのメソッドを使用するように、かなりの時間、勤勉さと細心の技法を捧げることが不可欠である。技術が取得されると、結果は、中枢神経系病変部位におけるこれらのNSCの顕著な生物学的特性を研究する能力を得て、動物から動物に非常に一致している。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、GFPラットを提供するために、ミズーリ州、ミズーリ州、コロンビア大学、ラット資源研究センターに感謝。 Neuralstem社ヒト神経幹細胞を提供する。この作品は、退役軍人、NIH（NS09881）、カナダの脊髄研究機構、クレイグ·H·ニールセン財団、バーナード、アンネスピッツァー公益信託によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
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