Summary
Fibrine matrices bevattende groeifactoren zijn gebruikt om geënte neurale stamcellen behouden in locaties volledig ruggenmerg doorsnijding. Geënte cellen volledig gevuld de laesie holte en gedifferentieerd in meerdere neurale celtypes, waaronder neuronen die axons verlengd gastheer ruggenmerg over lange afstanden.
Abstract
Neurale stamcellen (NSC) kan zichzelf vernieuwen en differentiëren tot neuronen en gliacellen. Getransplanteerd NSCs kan verloren neuronen en gliacellen na dwarslaesie (SCI) te vervangen, en kan functionele relais vormen opnieuw verbinding ruggenmergsegmenten boven en onder een laesie. Eerdere studies enten neurale stamcellen zijn beperkt door onvolledige transplantaatoverleving in het ruggenmerg laesie holte. Verder volgen van transplantaat celoverleving, differentiatie en werkwijze verlenging was niet geoptimaliseerd. Tot slot, in eerdere studies, gekweekte NSCs rat werden meestal gemeld om te differentiëren in glia wanneer geënt op de benadeelde ruggenmerg, in plaats van neuronen, tenzij het lot werd gedreven naar een specifiek celtype. Om deze problemen aan te pakken, hebben we nieuwe methoden ontwikkeld om de overleving, integratie en differentiatie van NSC naar sites van zelfs ernstige SCI verbeteren. NSCs werden vers geïsoleerd uit embryonale dag 14 ruggenmerg (E14) van een stabiele transgene Fischer 344 ratten tot expressie groene fluorescentie eiwit (GFP) en werden ingebed in een fibrine matrix met groeifactoren; deze formulering bedoeld om geënte cellen behouden de laesie holte en ondersteunen celoverleving. NSCs in de fibrine / groeifactor cocktail werden geïmplanteerd twee weken na thoracale niveau 3 (T3) volledige ruggenmerg doorsnijdingen, waardoor piekperiodes van ontsteking vermijden. Resulterende transplantaten volledig gevuld de laesie holte en gedifferentieerd in zowel neuronen, die axonen in de gastheer ruggenmerg dan opmerkelijk lange afstanden, en glia verlengd. Enten van gekweekte menselijke NSCs die GFP geleid tot gelijkaardige bevindingen. Aldus zijn werkwijzen vastgesteld voor het verbeteren neurale stamcel transplantatie, overleving en analyse van in vivo resultaten.
Introduction
Ruggenmergletsel (SCI) vaak schade niet alleen witte stof traktaten die signalen vervoeren van en naar de hersenen, maar ook de centrale grijze stof, waardoor segmentale verlies van interneuronen en motorische neuronen. Het gevolg van SCI is het verlies van zowel motorische en sensorische functie onder de laesie. Helaas heeft het volwassen centraal zenuwstelsel (CZS) niet spontaan regenereren, waardoor permanente functionele tekorten 1. Daarom reconstructie van het ruggenmerg gewonde volwassen en verbetering van de motorische, sensorische en autonome functie is een belangrijk doel van SCI onderzoek. Neurale stamcellen (NSC), hetzij direct geïsoleerd van embryonale of volwassen CZS, zijn dwingend kandidaat cellen om verloren neuronen en gliacellen te vervangen. Bovendien zijn deze cellen de potentie om nieuwe functionele relais te vormen om axonale geleiding door een laesie 2,3 herstellen.
Tot op heden is er geen gedetailleerde toelichting van de anatomische, electrophys geweestiological en gedragseffecten van neuronale relais vorming door getransplanteerde NSC na ernstige SCI. Er zijn verschillende redenen voor: ten eerste, getransplanteerde NSCs of foetale CNS weefsel overleven slecht wanneer geënt op grote laesie holtes. Eerdere studies tonen aanzienlijke vroege cel verlies, waardoor grote lege cystic laesie holten 4,5. In sommige studies zou de geënte cellen vervolgens verdelen en vullen de laesie holte van 4,5, maar dit kan later een vertraging van dagen tot weken en vervolgens laesie vulling misschien niet volledig of consistent zijn. Ten tweede, een efficiënte tracking systeem dat correcte gegevens op cellulaire overleving, differentiatie / rijping, en uitgroei van getransplanteerde NSCs biedt ontbrak. De meeste vroege studies gebruikt antegrade en retrograde etikettering axonale projecties van transplantaties 2,3 traceren. Echter, deze technieken slechts gedeeltelijk en vaak onduidelijk gelabelde axonale projecties die voortvloeien uit geënte cellen en tracer methoden zijn subjectievet artefacten veroorzaakt door kleurstof lekkage voorbij de geïmplanteerde cellen. Andere groepen gebruikt humaan specifieke neuronale markers om axonale projecties na transplantatie van menselijke foetale NSCs in gewonden knaagdier ruggenmerg 5,6 labelen. Echter, in die studies, de xenotransplantaten niet consequent goed overleven. Onlangs, virale aflevering van het GFP reportergen werd gebruikt om gekweekte NSCs 7,8 labelen. Echter, was GFP expressie vaak inconsistent en kan worden downgereguleerd 7. Onlangs is het gebruik van transgene donor muizen of ratten op stabiele wijze het reportergen GFP of de menselijke placenta alkalische fosfatase, is sterk verbeterd het volgen van getransplanteerde neurale stamcellen / voorlopercellen in vivo 9,11. Ten derde, een aantal studies blijkt dat in vitro gekweekte rat NSCs verkregen uit embryonale of volwassen CZS uitsluitend differentiëren in gliacellen geslachten wanneer getransplanteerd in het milieu van de wervelkolom cor intact of gewonde volwassend 7,12,13, hoewel deze neurale stamcellen kunnen differentiëren tot neuronen en glia zowel in vitro, wat aangeeft dat lokale omgeving het lot van stamcellen dicteren. Alternatief kan gekweekt NSCs, met name afkomstig uit volwassen CZS, defaulty intrinsieke eigenschap te differentiëren in gliale lineages in vivo 13.
Vanwege de beperkingen hierboven besproken, heeft onze groep recent een nieuw protocol ontwikkeld om embryonale NSC tracking, de overleving en differentiatie / rijping in de ernstig gewonde volwassen ruggenmerg verbeteren. Samengevat, zijn we begonnen met een stabiele transgene Fischer 344 ratten inteelt lijn uitdrukken van een GFP reporter gen dat GFP expressie in stand houdt na in vivo transplantatie 14. Vervolgens gebruikten we vers geïsoleerde NSCs uit embryonale dag 14 Fischer 344 ruggenmerg, een stadium van ontwikkeling die het potentieel om zowel neuronen en gliacellen genereren behoudt. Ten slotte hebben we ingebednet losgemaakte NSCs in een fibrine matrix met groeifactoren 15-17 om de cellen te behouden en gelijkmatig te verspreiden binnen een grote laesie holte, gericht op het transplantaat overleving van de cel, differentiatie en integratie te ondersteunen. Transplantaten werden geplaatst in locaties van T3 volledige doorsnijding, twee weken na dwarslaesie. Deze geënte cellen consequent gevuld volledige doorsnijding sites en gedifferentieerd in voorkomende neuronen dat grote aantallen axonen uitgebreid naar gastheer ruggenmerg over lange afstanden 18. Soortgelijke resultaten werden verkregen met gekweekte menselijke neurale stamcel transplantaten immuno-deficiënte ratten 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke protocollen worden goedgekeurd door VA-San Diego Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). NIH richtlijnen voor proefdier zorg en veiligheid worden strikt opgevolgd. Dieren hebben vrije toegang tot voedsel en water gedurende de studie en adequaat worden behandeld voor het minimaliseren van pijn en ongemak.
1. Voorbereiding van fibrine onderdelen die Growth Factor Cocktails
- Los 25 mg rat fibrinogeen in 0,5 ml PBS tot 50 mg / ml 2x voorraad oplossing te verkrijgen (zie ook Materiaal tabel). Fibrinogeen is moeilijk op te lossen en in een 37 ° C incubator of waterbad geplaatst en geschud elke 5-10 min gedurende 1-2 uur.
- Los 100 VN trombine rat in 2 ml steriel 10 mM CaCl2 tot 50 U / ml 2x stock oplossing.
- Los groeifactoren in PBS bij de volgende concentraties tot 100 pl voorraadoplossing te vinden: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (hoog voorraad concentratie als intrathecale infusie in vivo
- Los 25 mg MDL28170 (calpaïneremmer) in 1,3 ml DMSO tot 50 mM DMSO voorraad oplossing te verkrijgen, en verdun vervolgens 50x in PBS tot 1 mM voorraad oplossing te verkrijgen.
- Meng 100 pi van elke groeifactor component en 100 ui MDL28170 (1 mM voorraadoplossing) tot 1.000 III groeifactor cocktail oplossing (figuur 1) te produceren.
- Meng 500 pi fibrinogeen 2x voorraadoplossing met 500 ul groeifactor cocktail tot 25 mg / ml fibrinogeen werkoplossing vinden die groeifactoren en aliquot in 10 of 20 ul voor opslag bij -70 ° C. De oplossing is stabiel tot 12 maanden bij -70 ° C.
- Evenzo, meng 500 ul trombine 2x stockoplossing met 500 ul groeifactor cocktail tot 25 U / ml trombine werkende oplossing te verkrijgen met groeifactoren en aliquot in soortgelijke 10 of 20 ul volumes voor opslag eent -70 ° C gedurende maximaal 12 maanden.
- Op de dag van enting plaats fibrinogeen-en-trombine bevattend groeifactor cocktails op ijs tot gemengd met cellen.
2. T3 Spinal Cord doorsnijding
- Verdoven volwassen vrouwelijke Fischer 344 ratten of athymische naakt ratten met behulp van aanvaardbare methoden. Onderwerpen zijn diep onder narcose, wanneer respons op staart en poot knijpen zijn volledig afwezig. Opmerking: Wij gebruiken meestal 150-200 g Fischer-ratten of 180-220 g athymische ratten en een anesthesie cocktail (2 ml / kg) van ketamine (25 mg / ml), xylazine (1,3 mg / ml) en acepromazine (0,25 mg / ml).
- Solliciteer oogzalf tot droog of letsel van de ogen te voorkomen, terwijl de dieren onder narcose.
- Scheren de bovenste thoracale gebied en reinig de huid met Betadine.
- Snijd de huid en spieren met behulp van # 15 blade, T3 wervel bloot met behulp van een chirurgische retractor, en het uitvoeren van een laminectomie op T3 wervel tot T3 / 4 ruggenmerg bloot met een rongeur.
- Maak een longitudinal middellijn incisie in de dura van ongeveer 2 mm lengte met behulp van een # 11 blad.
- Plaats iridectomiescharen onder de dura rechts laterale gehele ruggemerg snijden. Maak nog een snede aan dezelfde kant 1,5 mm meer cadually.
- Aspireren ruggenmerg weefsel tussen de twee gesneden segmenten met een stompe 23 G naald aangesloten op matige intensiteit vacuüm. Gebruik visuele verificatie om volledige doorsnijding ventraal en lateraal zorgen. Dit zal een laterale hemisectie voltooien.
- Om de laesie uit te breiden tot een volledige breedte ruggenmerg doorsnijding, plaatst spiegel insnijdingen in de linker hemicord. Poging om de dura intact laten, anders dan de eerste snede, om de firma graft / fibrine matrix behouden in de laesie site wanneer geënt twee weken later.
- Hecht de spier, antibioticum poeder en nieten de skin.
- Injecteren lactaatbevattende Ringer (3 ml), Bannamine (2.5-5 mg / kg) en ampicilline (80-100 mg / kg) (zie ook Materiaal tabel) direct na de operatie en maintain ratten in een warme couveuse tot thermoregulatie wordt hersteld.
- Leeg de blaas en injecteer de Ringer-oplossing en ampicilline twee keer per dag voor ongeveer twee weken tot de oprichting van reflex blaas legen (Figuur 1B).
3. Voorbereiding van de net losgemaakte Embryonale Dag 14 Spinal Cord neurale stamcellen
- Verkrijgen inteelt transgene GFP F344 ratten (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) van Rat Resource and Research Center, University of Missouri.
- Injecteer 40 ug des-Gly 10, [D-Ala 6]-Leuteinizing Hormone Releasing Hormone ethylamide (LHRH) verdund in PBS bij een concentratie van 200 ug / ml intraperitoneaal (IP) per volwassen vrouwelijke ratten (8 weken of ouder) na 2 -3 uur licht inductie voor de synchronisatie van het embryo.
- Mate met een volwassen GFP homozygote of heterozygote mannelijke ratten 's nachts 4 dagen na de injectie.
- Verzamel embryo's in dagen 13,5-14,5 postcoitus(Pc) in koud HBSS buffer, onderzoeken GFP expressie onder een "NightSea" zaklamp en filter glazen (BLS1 - BlueStar zaklamp en Model VG1 barrière filter) of een fluorescentiemicroscoop.
- Ontleden ruggenmerg aseptisch uit elk GFP-positieve foetus en verwijder bovenliggende hersenvliezen en de bijgevoegde spinale ganglia met iridectomiescharen en fijne juweliers tang.
- Verzamel de ontleed ruggenmerg in 2 ml koud HBSS buffer in een 15 ml Cornical buis en blijf op ijs.
- Volg referentie # 20 naar ontleed ruggenmerg distantiëren:
- In het kort, 2 ml van 0,25% trypsine-EDTA op de buis met ontleed ruggenmerg (meerdere koorden samen worden gedigereerd, 1 snoer kan genoeg te genereren voor het kweken van een onderwerp) en verteren bij 37 ° C gedurende 10-12 minuten.
- Stop de reactie door toevoeging van trypsine 10 ml DMEM dat 10% FBS aan de buis en centrifugeer het weefsel bij 2500 rpm gedurende 2 minuten.
- Resuspendeer weefsel in 2 ml Neurobasal medium containing 2% B27, en vermaal het ruggenmerg weefsel met behulp van steeds kleinere brand gepolijst Pasteur pipetten.
- Centrifugeer cellen bij 2500 rpm gedurende 2 minuten, resuspendeer in 2 ml Neurobasal medium met B27 en filter cellen met een 40 um cel filterkorf.
- Tel de cellen met een hemocytometer en verdelen de cellen gelijkmatig in twee Eppendorf buizen.
- Centrifugeer de cellen en supernatant volledig te verwijderen (1-2 minuten zijn nodig om alle bovenstaande trekken met een laag vacuüm tip) dus de groeifactor cocktails zullen niet worden verdund door de resterende supernatant na cel re-suspensie.
- Resuspendeer elke helft van de cellen in de fibrinogeen of trombine werkoplossing die groeifactoren, respectievelijk, in een concentratie van 250.000 cellen / ul (celpellet telt voor ongeveer ⅓ eindvolume) en plaats ze op ijs vóór transplantatie (Figuur 1A). Merk op dat fibrinogeen kan spontaan gel wanneer gemengd met cels voor combinatie met trombine op de laesie / graftlocatie; om voortijdige gelering vermijden, meng cellen in fibrinogeen onmiddellijk vóór cel enten in vivo.
4. Transplantatie
- Reexpose de laesie T3 / 4 ruggenmerg twee weken na ruggenmerg doorsnijding.
- 5 pi fibrinogeen-cellen en 5 ul trombine-cellen kunnen direct worden geïnjecteerd in negen punten van de laesie site via verzegeld littekenweefsel en intacte dura zonder heropening van de laesie.
- Gebruik een 27 G naald 9 gaten op het oppervlak van het littekenweefsel en intacte dura 1-2 weken na lesie maken: 3 in het centrum (een middelpunt en twee in laterals en afstand van 0,5 mm van elkaar) en 3 zowel rostraal en 3 caudale interface (ongeveer 0,5 mm rostraal en caudaal van het midden van de laesie).
- Injecteren dan helft van het volume van fibrinogeen cel oplossing in drie centrale punten van de laesie en een kwart volume in 3 punten van de rostrale interface en aquarter volume in 3 punten van de staartvin interface.
- Vervolgens onmiddellijk injecteren throbmbin cellen in dezelfde plekken. Het mengsel van fibrinogeen en trombine cellen cellen in de laesie zal fibrine gel cellen houden in laesie vormen en groeifactor cocktails de overleving van cellen te ondersteunen. Cellen worden geïnjecteerd met getrokken glazen pipetten verbonden met een PicoSpritzer (General Valve, Inc).
- Transplant gekweekte menselijke NSCs 21 in de bovenstaande procedure en gebruik fibrine en groeifactor cocktails van menselijke reagentia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP immunohistochemisch etikettering blijkt dat NSC geënte rat opnieuw gesuspendeerd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (bij gebrek aan een fibrine matrix en groeifactoren) overleefden slecht in de T3 doorsnijding plaats, alleen verbonden aan de laesie / gastheer marge en terwijl de meeste van de laesie leeg zonder geënte cellen (Figuur 2A). De overleving van NSCs verbeterd wanneer samen geënt met fibrine matrices alleen maar het transplantaat niet volledig vullen grote laesie holte (gegevens niet getoond). Daarom hebben we ingebed NSCs in fibrine matrices met groeifactor cocktails om hun overlevingskansen te vergroten, het vullen van grote laesie holten en differentiatie in neuronen en gliacellen na ruggenmerg doorsnijding 15-17. Enten van een van beide ratten of mensen NSCs consequent en volledig vullen van de laesie holte wanneer beoordeeld zeven weken na de enting 18 (figuren 2B-C).
We voerden een tijdsverloop studie naar vroege onderzoekenoverleving en vullen van de laesie holte na enten van NSCs ingebed in fibrine matrices met groeifactor cocktails. Histologische analyse bleek dat GFP-expressie NSCs overleefd goed 24 uur na transplantatie (Figuren 3A-B). De geënte NSCs allengs dichte tijd om de doorsneden laesie holte volledig vullen van de eerste week na transplantatie waarschijnlijk door proliferatie 21 (Figuren 3C-H). Bovendien geënt NSC goed geïntegreerd in het gastheer / laesie interface en bleek gebieden van GFAP immunoreactiviteit te verminderen bij de randen van de laesie holte (figuur 3).
Een gedeelte geënt NSCs gedifferentieerd in NeuN-expressie neuronen zeven weken na transplantatie (figuren 4A-B). Bovendien,-graft afgeleid ruggenmerg neuronen uitgebreid grote aantallen axonen in de gastheer ruggenmerg in zowel rostrale en caudale richtingen over lange afstanden 18 < / Sup> (Figuur 4C). Geënt afgeleid axonen rostraal en caudaal uitgebreid door zowel de witte stof en grijze stof in de ontvangende ruggenmerg (figuren 4D-E).
Figuur 1. Experimentele Schema en Time Line. A) Schematische tekening aangepast van Popovich 22 (Cell, 2012) illustreert transplantatie van neurale stamcellen met fibrine gel met groeifactor cocktail in volledig doorgesneden ruggenmerg. B) Experimentele tijdslijn. Gedrags-en electriophysiological analyses kunnen worden uitgevoerd na cel enten en voor perfusie. De overlevingstijd van onderwerpen kunnen variabel zijn. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
.. Figuur 2 Survival en vullen van neurale stamcellen Enten in T3 Compleet doorsnijding sites GFP en GFAP fluorescerende immunolabeling in horizontale secties toont (A) slechte overleving van rat E14 NSCs (groen) opnieuw gesuspendeerd in PBS ontbreekt groeifactoren en fibrine matrix; BC) Uitstekend overleving en de volledige vulling van de laesie holte wanneer (B) rat of (C) menselijke NSCs werden ingebed in fibrine matrices met groeifactor cocktails. Cel werden geënt in T3 doorsnijding sites voor 7 weken. Schaal bar, 310 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
6,5 in "src =" / files/ftp_upload/50641/50641fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 3. Graft Overleven op Vroege Tijd Points. AB) GFP en GFAP dubbele immunolabeling tonen overleving en verspreiding van geënte rat NSCs in de doorsnijding plaats, 1 dag na de implantatie in een fibrine matrix. Boxed gebied A wordt getoond bij hogere vergroting in paneel B. CD) Celoverleving en distributie is ook duidelijk op dag 2 en (EF) Dag 3 na de enting. GH) Door 7 dagen, cellen te vullen laesie en zijn dichter. Schaalbalk: A, C, E, G, 300 um; B, D, F, H, 62 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Differentiatie en uitgroei van neurale Stem celtransplantaten in T3 Compleet doorsnijding Site. AB) GFP en NeuN etikettering bevestigen uitgebreide neuronale differentiatie / rijping van geënte rat neurale stamcellen 7 weken na de transplantatie. C) GFP en NeuN immunolabeling blijkt dat GFP-expressie neurale stamcellen enten breiden grote aantallen axonen in de gastheer ruggenmerg rostrale en caudaal van de transsectie website (caudale getoond), twee weken na de enting. DE) Hogere vergroting van boxed gebieden van paneel C blijkt dat uitgebreide gebieden van de gastheer ruggenmerg bevatten-graft afgeleid axonale projecties zowel in de witte stof en grijze stof. Schaalbalk: AB, 62 micrometer; C, 700 micrometer; DE, 62 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een van de belangrijkste hindernissen voor NSC transplantatie in het ruggemerg slecht overleving in de laesie centrum. Eventuele lacunes of holten in de laesie zou kunnen verminderen of verzwakken de vorming van functionele neuronale relais tussen supraspinale axonen en gescheiden ruggenmergsegmenten onder het letsel. Bovendien kan een slechte overleving van geënte NSCs hun integratie met gastheer weefsel beïnvloeden, en dus verminderen connectiviteit van geënt neuronen met de ontvangende neuronen. Mogelijke mechanismen naar cel verlies te verklaren zijn de cytotoxische omgeving gecreëerd door acute SCI, secundaire degeneratie van de gastheer ruggenmerg, en onvoldoende vascularisatie van de benadeelde regio 4.
Fibrine is gebruikt om cellen, drugs en groeifactoren te leveren in diverse experimentele modellen en klinische toepassingen, omdat cellen en moleculen kunnen behouden wanneer het gepolymeriseerde 23. Een eerdere studie toonde aan dat menselijke fibrinelijmkan dienen als een biomatrix om axonale regeneratie te verbeteren in de subtotally doorsneden ruggenmerg zonder uitlokken waarneembare schadelijke effecten 24. Hiervoor gebruikten we fibrine matrices beenmerg stromale cellen voor transplantatie te bedden in chronisch ruggemerg 17. Geënte cellen overleefden goed in de chronische laesie en goed geïntegreerd met gastheer ruggenmerg parenchym 17. Daarom hebben we uitgebreid het gebruik van fibrine te NSCs insluiten voor transplantatie in grote open laesie sites in de doorsneden ruggenmerg. Hoewel het voortbestaan van geënte NSCs verbeterd met fibrine, het voortbestaan van geënte NSCs bleef enigszins variabel en geënt NSCs zelden volledig gevuld grote laesie holte.
Daarom voegde een cocktail van groeifactoren in een poging om de overleving en proliferatie van NSCs verbeteren op de laesie. Groeifactoren zijn in talrijke studies aangetoond dat NSC's te ondersteunen in vitro 25. While toevoeging van groeifactoren aan culturen van NSCs kunnen hun lot te veranderen, hebben we niet kwalitatief schijnbare verandering te detecteren in neuronale dichtheid wanneer groeifactor cocktails toegevoegd aan het transplantaat te vergelijken met die gedeeltelijk overleefd ent zonder groeifactoren. Een meer gedetailleerde analyse is nodig voordat we kunnen waarderen met zekerheid de invloed van de groeifactor cocktails op lot van de cel. Tijdens de normale neurale ontwikkeling, de groei en overleving van neuronen afhankelijk neurotrofe factoren die vaak worden vrijgegeven door doelweefsel gids axonale groei en in sommige gevallen invloed neuronale overleving 26.
Soortgelijke maar eenvoudiger groeifactor cocktails zijn gebruikt door andere groepen om overleving en differentiatie van NSCs verbeteren zowel in vitro als in vivo 15,16. Deze inspanningen hebben geresulteerd in het algemeen minder uitgebreid NSC overleving dan de multiple factor aanpak die we hebben aangenomen. Een volgende belangrijke stap in deze ontwikkelinginspanning is om een beperking van de lijst van de groeifactoren in de cocktail die essentieel zijn om te ondersteunen NSC overleven, een inspanning die aan de gang is zijn. Het is heel goed mogelijk dat een beperkter aantal groeifactoren gelijke mate van overleving van het transplantaat, een bevinding die deze experimentele aanpak en de mogelijke vertaling naar menselijke studies zou vereenvoudigen zal ondersteunen.
Naast het gebruik van fibrine matrices en groeifactor cocktails, kan het succes van transplantatie in vivo de ernstige laesie afhankelijk mechanische factoren in de laesie. We doen er alles aan om de integriteit van de extreem dunne durale membraan dat het knaagdier ruggenmerg na letsels en enten, in een poging om mechanisch te behouden geënte cellen in plaats van de laesie ligt over te houden. Zo maken we een zorgvuldige en ijverige pogingen om consistente cel vullen van de laesie site te optimaliseren. Zonder deze verschillende inspanningen graft vulling onvolledig. Deze technieken vereisen uitgebreide praktischece.
In een poging om deze techniek te leren aan anderen, hebben we een aantal uitdagingen geïdentificeerd. Als cellen worden geïnjecteerd in de gastheer ruggenmerg plaats van de laesie holte, dan cellen voorkeur differentiëren tot glia. In dit geval wordt het aantal opkomende axonen sterk verminderd. Als grote zorg en toewijding niet zijn gemaakt om de laesie holte vullen met behulp van de verschillende technieken en benaderingen in de voorgaande paragrafen beschreven, overleving van de cel is minder consistent en biologische reacties, waaronder axon uitgroei, zijn beperkt. Daarom is het essentieel om veel tijd, toewijding en zorgvuldige techniek besteden aan deze methoden succes gebruik. Zodra de technieken zijn verkregen, zijn de resultaten zeer consistent van dier tot dier, waardoor het vermogen om de opmerkelijke biologische eigenschappen van deze NSCs in CZS plaatsen bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Rat Resource and Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, voor het verstrekken van GFP ratten; Neuralstem Inc verschaffen van humane neurale stamcellen. Dit werk werd ondersteund door de Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadese Spinal Research Organization, The Craig H. Neilsen Foundation en de Bernard en Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
