Summary
Büyüme faktörlerini içeren fibrin matrisi tam omurilik kesisi sitelerine aşılı nöral kök hücrelerini korumak için kullanılmıştır. Aşılı hücreler tamamen lezyon boşluğu doldurdu ve uzun mesafelerde konak omuriliğe aksonlarını uzatıldı nöronlar da dahil olmak üzere birden fazla nöral hücre tipleri, ayrışmıştır.
Abstract
Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve nöronlar ve glia içine ayırt edebilirsiniz. Nakledilen NSC'lerde spinal kord yaralanması (SKY) sonra kaybolan nöronlar ve glia değiştirebilirsiniz, ve bir lezyon üzerinde ve altında omurilik segmentleri yeniden bağlamak için fonksiyonel röleleri oluşturabilir. Nöral kök hücreler aşılama Önceki çalışmalar, spinal kord lezyon boşluğuna içinde eksik greft sağ kalımı ile sınırlı kalmıştır. Ayrıca, greft hücre canlılığı, farklılaşması, ve süreç uzatma izleme optimize olmasaydı. Son olarak, önceki çalışmalarda, kültürlü sıçan NSC'lerde genellikle kader belirli bir hücre tipine sürüldü sürece, yerine nöronların daha yaralı omurilik, aşılı zaman Gliadaki içine ayırt etmek bildirildi. Bu sorunları çözmek için, hatta şiddetli SCI sitelerine NSC'lerde yaşam, entegrasyon ve farklılaşmayı artırmak için yeni yöntemler geliştirdi. NSC'lerde taze yeşil fl eksprese eden stabil bir transgenik Fischer 344 sıçan çizgisinden embriyonik gün 14 omurilik (E14) izole edilmiştiruorescent protein (GFP) ve büyüme faktörlerini içeren bir fibrin matrisi içine gömülü edildi; Lezyon boşluğunda aşılı hücreleri korumak ve hücre yaşamını destekleyen amaçlanmıştır, bu formülasyon. Fibrin / büyüme faktörü kokteylinde NSC'lerde böylece inflamasyon tepe sürelerinin önüne, iki hafta torasik seviye-3 (T3) tam omurilik kesilerde sonra implante edildi. Ortaya çıkan greft tamamen lezyon boşluğu doldurdu ve konak spinal oldukça uzun mesafelerde kablosu ve glia içine aksonlarını genişletilmiş hem de nöronların, ayrışmıştır. GFP ifade kültürlü insan NSC'lerde greft benzer bulgularla sonuçlanmıştır. Bu nedenle, yöntem nöral kök hücre aşılama, hayatta kalmasını ve in vivo bulguların analiz geliştirmek için tanımlandığı gibidir.
Introduction
Spinal kord yaralanması (SKY) genellikle zarar değil sadece internöronlar ve motor nöronların segmental kaybına neden beyne ve sinyaller taşıyan beyaz madde yolları, aynı zamanda merkezi gri madde. SCI sonucu motor ve lezyon altındaki duyusal fonksiyonu hem kaybıdır. Ne yazık ki, yetişkin merkezi sinir sistemi (CNS) kendiliğinden sürekli işlevsel bozukluklarının 1 'de elde edilen, yeniden değildir. Bu nedenle, yaralı yetişkin omurilik ve iyileştirme motor, duyusal ve otonomik fonksiyon yeniden SCI araştırmanın önemli bir hedeftir. Nöral kök hücreler (NSC'lerde), doğrudan embriyonik veya yetişkin CNS izole edip, kayıp nöronlar ve glia değiştirmek için zorlayıcı aday hücrelerdir. Ayrıca, bu hücreler, lezyon Alanı 2,3 arasında aksonal yeniden iletimi için yeni bir fonksiyonel röleleri oluşturmak için potansiyele sahiptir.
Bugüne kadar, anatomik ayrıntılı bir aydınlatılması, electrophys olmamıştıriological ve ağır yaralanmasından sonra nakledilen NSC'lerde nöronal röle oluşumu davranışsal etkileri. İlk, nakledilen NSC'lerde veya fetal MSS doku geniş lezyon boşlukları içine aşılı zaman kötü hayatta: Bunun birkaç nedeni vardır. Önceki çalışmalar büyük boş kistik lezyon boşluklannın, 4,5 bırakarak, önemli bir erken hücre kaybı göstermektedir. Bazı çalışmalarda aşılanan hücrelerin sonradan bölmek ve lezyon oyuk, 4,5 doldurun, ama bu hafta gün gecikmeden sonra oluşabilir ve sonraki lezyon sitesi dolum tam veya tutarlı olmayabilir olacaktır. İkincisi, hücresel hayatta kalma, farklılaşma / olgunlaşması ve nakledilen NSC'lerde akıbet ses verileri sağlar verimli bir izleme sistemi yoktu. En erken çalışmalar antegrad ve nakilleri 2,3 dan aksonal projeksiyonlar iz retrograd etiketleme kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu teknikler sadece kısmen ve çoğu zaman açık olmayan işaretli aksonal aşılanmış hücrelerden kaynaklanan çıkıntılar ve izleme yöntemleri vardır subjekimplante hücrelerin ötesine boya sızıntıdan kaynaklanan eserler için t. Diğer gruplar yaralı kemirgen omurilik 5,6, insan fetal NSC'lerde naklinden sonra aksonal projeksiyonlar etiketlemek için insan spesifik nöronal belirteçler kullanılır. Ancak, bu çalışmalarda, ksenogratflardır sürekli iyi hayatta değildi. Son zamanlarda, GFP raportör genin viral teslim kültürlenmiş NSCs 7,8 etiketlemek için kullanıldı. Bununla birlikte, GFP ifade genellikle tutarsız ve 7, aşağı-regüle edilebilir. Son zamanlarda, stabil bir şekilde, raportör geni, GFP veya insan plasental alkali fosfataz ifade eden transjenik fareler ya da donör sıçanların kullanılması önemli ölçüde, in vivo 9,11 transplante nöral kök hücre / progenitörlerin izleme geliştirdi. Üçüncü olarak, bazı çalışmalar, dokunulmamış ya da yaralı yetişkin omurilik cor ortamına transplante zaman embriyo veya yetişkin ya da CNS türetilen in vitro kültürlenmiş sıçan NSC'lerde sadece glial soy içinde farklılık gösterirBu nöral kök hücreler, yerel ortamlarında kök hücrelerin kaderini belirleyebilir belirten nöronların ve in vitro glial hem de farklılaşma yeteneğine sahip olmasına rağmen d 7,12,13. Alternatif olarak, kültürlü NSC'lerde, yetişkin CNS türetilmiş özellikle, in vivo 13 glial soy içine ayırt etmek için içsel defaulty özelliğine sahip olabilir.
Çünkü yukarıda tartışılan sınırlamaları, bizim grup son zamanlarda ağır yaralı erişkin omurilik embriyonik MGK izleme, hayatta kalma ve farklılaşma / olgunlaşmasını geliştirmek için yeni bir protokol geliştirdi. Kısaca, bizler, in vivo nakli 14 sonra GFP ifade sürdüren bir GFP raportör geni ifade eden stabil bir transgenik fare Kendilenmiş Fischer 344 hattı ile başladı. Sonra, embriyonik günden itibaren 14 Fischer 344 omurilik, nöronlar ve glia üretmek hem de potansiyelini koruyan bir gelişme aşamasına taze izole NSCs kullanılır. Son olarak, gömülübüyümeyi içeren bir fibrin matriks içine taze ayrışmış NSC'lerde hücrelerini korumak ve eşit greft hücre yaşama, farklılaşma ve entegrasyonu desteklemek amacıyla, büyük bir lezyon boşluğuna içinde onları dağıtmak için 15-17 faktörleri. Greftler T3 tam Transeksiyon, omurilik yaralanması sonrası iki haftalık sitelerine yerleştirildi. Bu aşılı hücreler sürekli tam transeksiyonu siteleri dolu ve uzun mesafelerde 18 üzerinden barındıran omurilik içine akson çok sayıda genişletilmiş bol nöronların içine farklılaşmış. Benzer sonuçlar bağışıklık-eksikli fareler 18 kültürlenmiş insan nöral kök hücre nakli kullanılarak elde edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokoller VA-San Diego Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Laboratuvar hayvan bakımı ve güvenliği için NIH kurallar sıkı takip edilir. Hayvanlar, çalışma boyunca gıda ve suya serbest erişimi vardır ve yeterli ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için tedavi edilir.
1.. Fibrin Bileşenleri hazırlanması Büyüme Faktörü Kokteyller İçeren
- (Malzemeler tabloya bakınız) 50 mg / ml 2x stok çözelti elde etmek için 0.5 ml PBS içinde 25 mg fare fibrinojen çözülür. Fibrinojen çözünmesi zor olan ve bir 37 ° C su banyosu veya inkübatör içine yerleştirildi ve 1-2 saat boyunca her 5-10 dakikada çalkalanmalıdır.
- 50 U / ml 2x stok çözelti elde etmek için 10 mM steril CaCl2 içinde 2 ml 100 BM sıçan trombin çözülür.
- 100 ul stok solüsyonu elde etmek için, aşağıdaki konsantrasyonlarda PBS içinde çözülür büyüme faktörleri: 1 mg / ml: BDNF; In vivo intratekal infüzyon olarak NT-3 (yüksek stok konsantrasyonu
- 50 mM DMSO stok çözelti elde etmek için 1.3 ml DMSO'da 25 mg MDL28170 (kalpain inhibitörü) çözülür ve daha sonra 1 mM stok çözeltisi elde etmek için PBS içinde 50x seyreltin.
- 1000 ul büyüme faktörü kokteyl çözeltisi (Şekil 1) üretilmesi için her büyüme faktörü bileşenin 100 ul ve MDL28170 (1 mM stok çözelti) 100 ul karıştırın.
- -70 ° C de depolama için 10 ya da 20 ul içine büyüme faktörleri ve kısım içeren 25 mg / ml fibrinojen çalışma çözelti elde etmek için 500 ul büyüme faktörü kokteyli ile 500 ul 2x fibrinojen stok solüsyonu karıştırın Çözelti, -70 ° C'de 12 aya kadar stabildir
- Benzer şekilde, depolama a benzer 10 veya 20 ul hacimleri içine büyüme faktörleri ve kısım içeren 25 U / ml trombin çalışma çözüm elde etmek için 500 ul büyüme faktörü kokteyl ile 500 ul trombin 2x stok çözüm karıştırmakt -70 ° C için 12 aya kadar.
- Hücrelerle karıştırılır kadar aşılama gününde, buz üzerinde fibrinojen ve trombin içeren büyüme faktörü kokteyl yerleştirin.
2.. T3 Omurilik Kesisi
- Olarak kabul edilebilir bir yöntem kullanılarak yetişkin dişi Fischer 344 fareleri veya atimik çıplak sıçan anestezisi. Kuyruk ve pençe tutam yanıt tamamen yok olduğunda Konular derin anestezi uygulanır. Not: tipik haliyle 150-200 g Fischer sıçan ya da 180-220 g atimik sıçan ve ketamin anestezisi bir kokteyl (2 ml / kg) (25 mg / ml), ksilazin (1.3 mg / ml) ve asepromazin (0.25 mg kullanın / ml).
- Hayvanlar anestezi altında iken kuruluk veya gözlerde yaralanmayı önlemek için göz merhemi sürün.
- Üst torakal bölgeyi tıraş ve Betadine ile cildi temizleyin.
- , # 15 bıçak kullanarak cilt ve kas kesmek cerrahi ekartör kullanılarak T3 vertebra maruz ve bir rongeur kullanarak T3 / 4 omurilik maruz T3 vertebra bir laminektomi gerçekleştirmek.
- Bir lon yapın11. Bir bıçak kullanılarak yaklaşık olarak 2 mm uzunluğunda, dura içinde gitudinal orta hat kesimi.
- Sağ lateral tüm omurilik kesmek için dura altına iridektomi makas yerleştirin. 1.5 mm daha fazla cadually aynı tarafta başka bir kesim olun.
- Orta şiddette vakum bağlı bir künt 23 G iğne ile iki kesim kesimleri arasındaki aspire omurilik dokusu. Ventrale ve yanal tamamen kesilmesini sağlamak için görsel doğrulama kullanın. Bu yanal Hemiseksiyon tamamlayacak.
- , Tam genişlikte omurilik kesisi için lezyon uzatmak sol hemicord içine ayna kesiler yerleştirmek için. İki hafta sonra aşılı zaman lezyon sitede firma greft / fibrin matrisi korumak için, ilk kesim dışında, sağlam dura bırakmak deneyin.
- , Kas dikin antibiyotik tozu ve elyaf deri uygulanır.
- Laktatlanmış Ringer (3 mi) enjekte edilir, Bannamine (2.5-5 mg / kg) ve ampisilin (80-100 mg / kg) ameliyattan hemen sonra ve mai (Malzemeler tabloya bakınız)sıcak bir inkübatör ntain fareler thermoregulation yeniden kuruluncaya kadar.
- Mesane boşaltın ve (Şekil 1B) boşalma refleks mesane kurulana kadar yaklaşık iki hafta boyunca günde iki kez Ringer ve Ampisilin çözüm enjekte.
3.. Taze Disosiye Embriyonik Günü Hazırlık 14 Omurilik Sinir Kök Hücre
- Kendilenmiş transgenik GFP F344 sıçan Rat Kaynağınızdan (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) ve Araştırma Merkezi, University of Missouri edinin.
- 40 ug des-Gly 10 enjekte edilir, [D-Ala 6]-lötenize edici hormon sonra 2 200 'lik bir konsantrasyonda ug / olgun dişi fare (8 hafta veya daha büyük) başı (IP) intraperitonal ml' de PBS içinde seyreltilmiş etilamid hormon (LHRH) Releasing Embriyo toplama senkronizasyonu için -3 saat ışık indüksiyon.
- 4 gün enjeksiyonundan sonra olgun bir GFP homozigot veya heterozigot erkek sıçan gecede çiftleşmek.
- Gün 13,5-14,5 postcoitus embriyolar toplamakYa da bir floresan mikroskop - soğuk HBSS tamponu (pc), bir "NightSea" el feneri ve filtre gözlük (BlueStar El feneri ve Model VG1 bariyer filtre BLS1) altında GFP ifade inceleyin.
- Her GFP pozitif fetus aseptik omurilik incelemek ve örten meninks ve iridektomi makas ve ince forseps ile bağlı spinal ganglionlar kaldırın.
- 15 ml cornical tüp içinde 2 ml soğuk HBSS tampon içine disseke omurilik toplayın ve buz üzerinde tutmak.
- Disseke omurilik ayırmak için referans # 20 izleyin:
- Kısaca, (birkaç kabloları 1 kablosu, bir öznenin graft için yeterli hücreleri oluşturabilir birlikte sindirilebilir) parçalara ayrılmış omuriliklerden kablolarını içeren tüpe% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve 2 ml, 10-12 dakika boyunca 37 ° C 'de özet.
- Tüp ve santrifüj 2 dakika boyunca 2500 rpm'de doku için% 10 FBS ihtiva eden DMEM içinde 10 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun tripsin.
- 2 mi, Neuro temelli vasat co doku yeniden süspanse% 2 B27 ntaining, ve giderek daha küçük yangın cilalı Pasteur pipetlerini kullanarak omurilik dokusu çiğnemek.
- Santrifüj, bir 40 mikron hücre filtre süzgeci ile 2 dakika, B27 içeren, Neuro temelli vasat 2 ml tekrar süspansiyon ve filtre hücreleri için 2500 rpm'de hücreler.
- Bir hemositometreyle ile hücrelerin sayısı ve eşit iki Eppendorf tüpleri içine hücreleri bölmek.
- Hücreleri santrifüj ve tamamen süpernatan (1-2 dakika düşük vakum ucu ile tüm süpernatant geri gerekmektedir) bu nedenle büyüme faktörü kokteyl hücre yeniden süspansiyon sonra kalan yüzer seyreltilir olmayacaktır.
- (Yaklaşık ⅓ son hacim için, hücre topağı kere) 250,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda, büyüme faktörleri, ihtiva eden fibrinojen ya da trombin çalışma çözeltisi içindeki hücrelerin her yarım yeniden süspanse edin ve (Şekil 1A), transplantasyon öncesinde buz üzerine yerleştirin. Hücre ile karıştırıldığında bu fibrinojen kendiliğinden jel Nots lezyon / greft yerinde trombin ile birleştirerek önce; erken jelleşmeye önlemek için hemen in vivo hücre aşılanma öncesi fibrinojen hücreleri karıştırın.
4. Transplantasyon
- İki hafta sonra, omurilik transeksiyonu lezyonlu T3 / 4 omurilik Reexpose.
- 5 ul fibrinojen-hücreleri ve 5 ul trombin hücreler, doğrudan doğruya lezyon yerinin yeniden açmadan kapalı yara dokusu ve sağlam dura boyunca lezyon yerinde dokuz nokta enjekte edilebilir.
- Merkezde 3 (orta noktasında bir ve lateraller iki ve birbirinden 0.5 mm aralıklı) ve rostral hem de 3: skar dokusu ve bozulmamış dura 1-2 hafta sonrası lezyon yüzeyindeki 9 delik oluşturmak için bir 27 G iğne kullanın ve kaudal arabirimi (lezyonun merkezinde yaklaşık 0.5 mm ya da rostral kaudal) içerisinde 3.
- Sonra rostral arayüzü ve sulu 3 puan içine lezyon yerinde ve çeyrek hacminin üç merkezi noktaları içine fibrinojen hücre çözümü yarım hacim enjektekaudal arabirimi 3 noktalara uarter hacmi.
- Sonra hemen aynı noktalar içine throbmbin hücreleri enjekte. Fibrinojen hücreleri ve lezyon site içindeki trombin hücrelerinin karışımı, lezyon yerinde tutmak için hücreler içine fibrin jel oluşturur ve büyüme faktörü kokteyller hücrelerin hayatta kalma destekleyecektir. Hücreler, Picospritzer (Genel Valve, Inc) bağlı çekilmiş bir cam pipet ile enjekte edilir.
- Transplant kültürlenmiş insan NSC'lerde, yukarıda tarif edilen aynı prosedür 21 ve insan reaktifler yapılmış fibrin ve büyüme faktörü kokteyller kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP immünohistolojik etiketleme aşılı fare NSC'lerde yalnızca lezyon / ana kenar ekleme olmadan boş lezyon yerinde en bırakarak, T3 transeksiyonu sitedeki kötü hayatta fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (a fibrin matrisi ve büyüme faktörleri içermeyen) içinde yeniden süspansiyon haline gösteriyor aşılanmış hücreleri (Şekil 2A). Yalnız fibrin matrisler ile birlikte aşılı zaman NSC'lerde hayatta kalma geliştirilmiş, ancak greft tamamen büyük bir lezyon boşluğu (veriler gösterilmemiştir) kadar doldurun yoktu. Bu nedenle, omurilik kesisi 15-17 sonra nöronlar ve glia içine büyük lezyon boşlukların ve farklılaşma dolum, onların hayatta kalma geliştirmek için büyüme faktörü kokteyl içeren fibrin matrisler içine NSCs gömülü. 18 (Şekil 2B-C) aşılama sonrası yedi hafta değerlendirildiğinde sıçan veya insan NSC'lerde ya greft sürekli ve tamamen lezyon boşluğu doldurun.
Biz erken incelemek için bir süre ders çalışma yürüttühayatta kalma ve büyüme faktörü kokteylleri ile fibrin matrikslerinde gömülü NSC'lerde aşılama sonra lezyon boşluğu doldurma. Histolojik analiz GFP ifade NSC'lerde transplantasyon (Şekil 3A-B) de sonra 24 saat hayatta olduğunu ortaya koydu. Aşılı NSC'lerde aşamalı olarak tamamen muhtemelen çoğalması 21 (Şekil 3C-H) için transplantasyon sonrası ilk haftasında nakledilmiş lezyon boşluğu doldurmak için zamanla daha yoğun oldu. Buna ek olarak, aşılı NSC'lerde host / lezyon arayüzü iyi entegre ve lezyon boşluğuna (Şekil 3) marjları GFAP immünoreaktivitede bölgeleri azaltmak için ortaya çıktı.
Aşılı NSC'lerde bir kısmı yedi hafta transplantasyon (Şekil 4A-B) sonrası neun ifade nöronlar ayrışmıştır. Buna ek olarak, graft-türevi omurilik nöronları uzun mesafeler üzerinde 18 rostral ve kaudal yönde <hem de ana omuriliğe akson çok sayıda uzatılmış / Sup> (Şekil 4C). Aşılı türetilmiş akson beyaz madde ve konak omurilik (Şekil 4D-E) gri madde hem aracılığıyla rostrally ve kaudal uzatıldı.
Şekil 1. Deneysel şematik ve Time Line. A) Popovich 22 (Hücre, 2012) uyarlanan şematik çizim fibrin jel tamamen transected omurilik. B) Deneysel zaman çizgisi içine büyüme faktörü kokteyl içeren nöral kök hücre nakli göstermektedir. Davranış ve electriophysiological analizler hücre aşılama sonrası ve perfüzyon önce yapılabilir. Konuların sağkalım süresi değişken olabilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
.. Şekil 2. Survival ve Nöral Dolum T3 tam Kesisi Siteleri Hücre Greftler Kök yatay bölümlerde GFP ve GFAP floresan immün büyüme faktörleri ve fibrin matriks eksik sıçan E14 NSC'lerde (yeşil) PBS içinde yeniden süspanse (A) kötü sağkalım gösterir; BC) mükemmel hayatta kalma ve (B) fare ya da (C), insan büyüme faktörü NSC'lerde kokteylleri içeren fibrin matris içine gömülü olan lezyon boşluğunun tam dolum. Hücre 7 hafta T3 transeksiyonu siteleri içine aşılanmıştır. Ölçek çubuğu, 310 mikron. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
6.5in "src =" / files/ftp_upload/50641/50641fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 3.. Greft Survival Erken Zaman Noktalarında. AB) GFP ve GFAP çift immün gösteri hayatta kalma ve transseksiyon sitesinde, bir fibrin matriks 1 gün post-implantasyon aşılı sıçan NSC'lerde dağılımı. A Kutulu alan paneli B. CD) Hücre hayatta kalma ve dağıtımında yüksek büyütmede gösterilen 7 gün By Day 2'de de açıktır ve (EF) 3. Gün sonrası aşılama. GH), hücreler lezyon yeri doldurmak ve yoğun vardır. Ölçek çubuğu: A, C, E, G, 300 mikron; B, D, F, H, 62 mikron. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Sinir Ste Şekil 4.. Farklılaşma ve akıbetT3 Komple Kesisi Sitede m Hücre Greftler. AB) GFP ve neun etiketleme 7 hafta aşılama. C) GFP sonra neun immün GFP-ifade nöral kök hücre greftler konak omurilik rostral içine akson çok sayıda uzatmak ve ortaya koymaktadır aşılı sıçan nöral kök hücrelerinin yoğun nöronal farklılaşma / olgunlaşmasını onaylamak transseksiyon sitede (kaudal gösterilir), iki hafta sonrası aşılama. DE) konak omuriliğin geniş bölgeleri beyaz madde ve gri madde hem de greft türetilmiş aksonal projeksiyonlar içeren panel C show kutulu alanlardan yüksek büyütme için kaudal. Ölçek çubuğu: AB, 62 um; C, 700 um; DE, 62 mikron. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yaralı omurilik MGK nakli için önemli engellerden biri lezyon merkezinde yoksul hayatta kalabilmek. Lezyon yerinde herhangi bir boşluk veya boşluklar potansiyel olarak azaltmak veya supraspinal akson ve yaralanma altında ayrılmış spinal kord segmentleri arasında fonksiyonel nöronal röleleri oluşumunu zayıflatabilir. Ek olarak, aşılanmış NSC'lerde zayıf yaşama konak doku ile entegrasyonu etkiler ve bu nedenle ana nöronlar ile aşılanmış nöronların bağlantı azaltabilir. Hücre kaybını açıklamak için olası mekanizmalar sitotoksik akut SCI tarafından oluşturulan ortamı, ev sahibi omurilik ikincil dejenerasyonu ve yaralı bölgenin 4 yetersiz vaskülarizasyon içerir.
Fibrin bu polimerize 23 olduğunda bu hücrelerin ve moleküllerin tutabilen bu yana, çeşitli deneysel modelleri ve klinik uygulamalarda hücreleri, uyuşturucu ve büyüme faktörleri teslim etmek için kullanılmıştır. Bir önceki çalışma göstermiştir ki, insan fibrin yapıştırıcısaptanabilir olumsuz etkilere yol açmadan 24 omurilik transekte subtotal aksonal rejenerasyonu arttırmak için bir biyomatris olarak hizmet verebilir. Daha önce yaralı kronik omurilik 17 içine nakli için kemik iliği stromal hücreleri yerleştirmek için fibrin matrisi kullanılır. Aşılı hücreler kronik lezyon yerinde iyi atlattı ve konak omurilik parankimi 17 ile de entegre. Bu nedenle, transeksiyon omurilikte büyük açık lezyon bölgeleri içine nakli için NSCs gömmek için fibrin kullanımını genişletilmiş. Aşılı NSC'lerde hayatta fibrin ile geliştirilmiş olsa da, aşılı NSC'lerde hayatta biraz değişken kaldı ve NSC'lerde nadiren tamamen geniş lezyon boşluğunu doldurdu aşılı.
Bu nedenle, lezyon sitedeki NSC'lerde hayatta kalmasını ve çoğalmasını arttırmak için bir çaba büyüme faktörlerinin bir kokteyl ilave edildi. Büyüme faktörleri, in vitro 25 NSCs desteklemek için çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. WHIle NSC'lerde kültürlerine büyüme faktörlerinin eklenmesi, kendi kaderini değiştirebilir büyüme faktörü kokteyller büyüme faktörleri olmayanlarda kısmen atlattı greft karşılaştırarak greft eklendiğinde nitel olarak nöronal yoğunluk belirgin bir değişiklik tespit etmedi. Biz kesinlikle hücre kaderi üzerinde büyüme faktörü kokteyller etkisini takdir önce daha detaylı bir analiz gereklidir. Normal sinir gelişme sırasında, nöronların hayatta kalması ve büyümesi, genellikle hedef doku kılavuz akson büyümesi tarafından yayımlanan ve, bazı durumlarda, nöronun hayatta kalışını, 26 etkisi vardır nörotrofik faktörlere bağlıdır.
Benzer daha basit bir büyüme faktörü kokteyl, in vitro ve in vivo hem de 15,16 NSC'lerde hayatta kalmasını ve farklılaşmasını geliştirmek için diğer gruplar tarafından kullanılmıştır. Bu çabalar genellikle biz benimsedik birden fazla faktör yaklaşım daha az kapsamlı MGK hayatta sonuçlandı. Bu gelişmede önemli bir sonraki adımçaba MGK hayatta, devam etmekte bir çabayı desteklemek için gerekli olan kokteylde büyüme faktörlerinin listesini daraltmak için. Bu büyüme faktörleri daha sınırlı sayıda greft yaşam, insan çalışmalarında bu deneysel yaklaşımı ve potansiyel çeviri kolaylaştırmak olacak bir bulgunun eşit derecelerde destek olacak bu tamamen mümkündür.
Fibrin matrisler ve büyüme faktörü kokteyller kullanımına ek olarak, ciddi lezyon yerinde in vivo aşılama başarısı lezyon yerinde mekanik faktörlere bağlı olabilir. Biz mekanik lezyon sitede aşılı hücreleri korumak için bir çaba lezyonlar ve aşılama sonrası kemirgen omurilik üzerler derece ince dura zarının bütünlüğünü korumak için her türlü çabayı. Böylece, lezyon yerinde tutarlı hücre doldurma optimize etmek için dikkatli ve gayretli çaba. Bu çoklu çabaları olmasaydı, greft dolum eksik. Bu teknikler, geniş practi gerektirirce.
Başkalarına bu tekniği öğretmek için çalışırken, bazı zorlukları belirledik. Ev sahibi hücreler, omurilik yerine lezyon boşluğuna enjekte edilir, daha sonra hücreler, tercihli olarak glia içine ayırt edebilir. Bu durumda, çıkan akson sayısı önemli ölçüde azalır. Büyük bir özen ve titizlik önceki paragraflarda anlatılan çok teknikleri ve yaklaşımları kullanarak lezyon boşluğu doldurmak için yapılan değilseniz, hücre sağkalım daha az tutarlı ve akson akıbet dahil olmak üzere biyolojik tepkileri, sınırlıdır. Bu nedenle, başarılı bir şekilde bu yöntemleri kullanmak için önemli bir zaman, çalışkanlık ve titiz teknik adamak esastır. Teknikler alınan sonra, sonuçlar merkezi sinir sistemi lezyon sitelerinde bu NSC'lerde dikkate değer biyolojik özelliklerini incelemek için yeteneği hasıl hayvandan hayvana yüksek tutarlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz Rat Kaynak ve Araştırma Merkezi teşekkür, Missouri Üniversitesi, Columbia, Missouri, GFP fareleri sağlamak için; Insan sinir kök hücreleri sağlamak için Neuralstem Inc. Bu çalışma Gaziler İdaresi, NIH (NS09881), Kanada Spinal Araştırma Örgütü, Craig H. Neilsen Vakfı, ve Bernard ve Anne Spitzer Charitable Trust tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
