Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Продвижение выживания и дифференцировка нервных стволовых клеток с фибрином и фактор роста Коктейли после Тяжелая травмы спинного мозга

Published: July 27, 2014 doi: 10.3791/50641
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1,2
1Veterans Administration Medical Center, San Diego, 2Department of Neurosciences, University of California, San Diego

Summary

Фибриновые матрицы, содержащие факторы роста были использованы, чтобы сохранить привитые нервные стволовые клетки в участках полной перерезки спинного мозга. Привитые клетки полностью заполнил полость поражения и дифференцировались в нескольких нейронных типов клеток, в том числе нейроны, которые простирались аксоны в принимающей спинного мозга на большие расстояния.

Abstract

Нервные стволовые клетки (НСК) могут самообновлению и дифференцировке в нейроны и клетки глии. Пересаживают НСК может заменить потерянные нейронов и глии после травмы спинного мозга (SCI), и могут образовывать функциональные реле повторного подключения сегментов спинного мозга выше и ниже поражения. Предыдущие исследования прививки нервные стволовые клетки были ограничены неполного выживание трансплантата внутри спинного мозга полость поражения. Кроме того, отслеживание выживание трансплантата клеток, дифференциации и расширения процесса не были оптимизированы. Наконец, в предыдущих исследованиях, культивированные NSCs крысы, как правило, сообщалось дифференцироваться в глии, когда прививают на поврежденный спинной мозг, а не нейронов, если судьба не был доведен до определенного типа клеток. Для решения этих проблем, мы разработали новые методы для улучшения выживаемости, интеграции и дифференциации НСК к сайтам даже тяжелой ТСМ. NSCs были недавно выделены из эмбрионального день 14 спинного мозга (E14) от стабильной трансгенных крыс Fischer 344 линии, экспрессирующей зеленый этлюминесцентных белок (GFP) и были встроены в фибринового матрикса, содержащего факторы роста; эта формулировка направлена ​​сохранить трансплантированных клеток в полости поражения и поддерживать жизнеспособность клеток. НСК в коктейле фибрина / фактора роста были имплантированы две недели после грудной уровень-3 (Т3) полных спинного transections мозга, что позволяет избежать пиковых периодов воспаления. Полученные трансплантаты полностью заполнена полость поражения и дифференцировались в обоих нейронов, которые расширенных аксоны в принимающей спинного мозга над удивительно большие расстояния, и глии. Прививки из культивированных человеческих НСК выражающих GFP привели к аналогичным результатам. Таким образом, методы определены для улучшения нейронной прививки стволовых клеток, выживание и анализ естественных условиях выводов в.

Introduction

Травма спинного мозга (ТСМ), часто повреждает не только в белом веществе участки, которые несут сигналы от головного мозга, но и центральный серого вещества, в результате чего сегментарную потерю интернейронов и мотонейронов. Следствием ТСМ является потеря как и моторной функции ниже поражения. К сожалению, взрослый центральной нервной системы (ЦНС) не спонтанно регенерировать, в результате постоянных функционального дефицита 1. Таким образом, реконструкция ранения взрослого спинного мозга и улучшению моторных, сенсорных и вегетативных функций является важной задачей исследования SCI. Нервные стволовые клетки (НСК), прямо изолированы от эмбриона или взрослого ЦНС, убедительные кандидаты клетки, чтобы заменить потерянные нейронов и глии. Более того, эти клетки имеют потенциал, чтобы сформировать новые функциональные реле для восстановления аксонов проводимость через поражение сайте 2,3.

На сегодняшний день не было подробное выяснение анатомических, electrophysiological и поведенческие эффекты нейронов формирования реле по трансплантированных НСК после тяжелой ТСМ. Есть несколько причин для этого: во-первых, пересаженные НСК или ЦНС плода ткани выжить плохо, когда привитые в крупные поражения полости. Предыдущие исследования показывают, существенные потери в начале клеток, в результате чего большая пустая кистозные поражения полостей 4,5. В некоторых исследованиях привитые клетки впоследствии разделить и заполнить полость поражения 4,5, но это может произойти с задержкой от нескольких дней до недель, и последующее заполнение поражение сайт не может быть полным или последовательным. Во-вторых, эффективная система отслеживания, которая обеспечивает надежные данные о клеточном выживания, дифференциации / созревания, и результат развития трансплантированных НСК недоставало. Большинство ранних исследований использованы антеградно и ретроградной маркировки проследить аксональные проекции из трансплантации 2,3. Однако, эти методы лишь частично и часто неясно, меченные аксонов проекции, вытекающие из трансплантированных клеток, а также методы трассирующие являются субъективнот к артефактам, вызванных утечкой красителя за имплантированных клеток. Другие группы использовали специфические нейронные маркеры человека маркировать аксональные прогнозы после трансплантации фетальных НСК человека в травму грызунов спинного мозга 5,6. Тем не менее, в этих исследованиях, ксенотрансплантаты не последовательно хорошо выживают. Недавно вирусный доставка гена GFP репортера была использована для обозначения культивированных НСК 7,8. Тем не менее, выражение GFP был часто непоследовательны и может быть вниз регулируется 7. В последнее время использование трансгенных мышей или крыс-доноров, стабильно экспрессирующих репортерный ген GFP, или человеческий плацентарный щелочную фосфатазу, значительно улучшилось отслеживание трансплантированных нервных стволовых клеток / клеток-предшественников в естественных 9,11. В-третьих, некоторые исследования показывают, что в пробирке культивированный НСК крысы, полученные либо из эмбриона или взрослого ЦНС исключительно дифференцироваться в глиальные линий при трансплантации в среде с нетронутыми или ранены взрослого спинного корг 7,12,13, несмотря на то, что эти нервные стволовые клетки способны дифференцироваться в обоих нейронов и глии в пробирке, указывая, что местные условия окружающей среды могут диктовать судьбу стволовых клеток. Кроме того, культивируемые NSCs, особенно те, которые получены из взрослой ЦНС, могут иметь внутренним свойством defaulty дифференцироваться в глиальные линий в естественных условиях 13.

Из-за ограничений, описанных выше, наша группа недавно разработала новый протокол для улучшения эмбриональных отслеживание НСК, выживание, и дифференциация / созревание в тяжелые ранения взрослого спинного мозга. Вкратце, мы начали со стабильным трансгенных Фишер 344 крысы ИНБРЕДНЫЕ линии, выражающей ген-репортер GFP, которая поддерживает выражение GFP после трансплантации в естественных условиях 14. Далее, мы использовали Свежевыделенные НСК из эмбриональных день 14 Fischer 344 спинной мозг, этап развития, который сохраняет потенциал для создания как нейроны и глиальные клетки. Наконец, мы встроилинедавно диссоциированные НСК в фибрин матрицы, содержащей факторов роста 15-17 сохранить клетки и равномерно распределить их в большой полости поражения, с целью поддержать выживание трансплантата клеток, дифференцирование и интегрирование. Прививки были помещены в местах T3 полной перерезки, через две недели после травмы спинного мозга. Эти привитые клетки последовательно заполняется полные перерезки сайтов и дифференцировались в обильных нейронов, которые простирались большое количество аксонов в принимающей спинного мозга на большие расстояния 18. Аналогичные результаты были получены с использованием культивированных трансплантатов стволовых нервных клеток человека к иммуно-дефицитных крыс 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы животных утверждаются VA-Сан-Диего Уходу за животными и использованию комитета (IACUC). NIH руководящие принципы для лабораторного ухода за животными и безопасности строго соблюдаются. Животные имеют свободный доступ к пище и воде в течение всего исследования и адекватное лечение для минимизации боли и дискомфорта.

1. Подготовка фибрина компонентов, содержащих фактор роста Коктейли

  1. Растворите 25 мг крысы фибриногена в 0,5 мл PBS, чтобы получить 50 мг / мл исходного раствора 2х (см. таблицу материалов). Фибриноген трудно растворим и должны быть помещены в 37 ° C инкубаторе или водяной бане и встряхивали каждые 5-10 мин в течение 1-2 часов.
  2. Растворить 100 крыс тромбин ООН в 2 мл 10 мМ CaCl 2 стерильный с получением 50 U / мл исходного раствора 2х.
  3. Растворить факторы роста в PBS в следующих концентрациях, чтобы получить 100 мкл исходного раствора: 1 мг / мл: BDNF; NT-3 (высокая концентрация акции как интратекальной вливания в естественных условиях
  4. Растворите 25 мг MDL28170 (калпаина ингибитор) в 1,3 мл ДМСО с получением 50 мМ ДМСО маточного раствора, а затем разбавить 50x в ФБР, чтобы получить 1 мМ маточного раствора.
  5. Смешайте 100 мкл каждого компонента фактора роста и 100 мкл MDL28170 (1 мМ исходный раствор) для производства 1000 мкл фактор роста коктейль решение (рис. 1).
  6. Смешайте 500 мкл 2x фибриноген маточного раствора с 500 мкл фактора роста коктейлем, чтобы получить 25 мг / мл фибриногена рабочий раствор, содержащий факторы роста и аликвоту в 10 мкл или 20 для хранения при -70 ° С Раствор стабилен в течение 12 месяцев при температуре -70 ° С.
  7. Аналогично, смешать 500 мкл тромбина 2x маточного раствора с 500 мкл коктейля фактора роста для получения 25 рабочего раствора Ед / мл тромбина, содержащий факторы роста и аликвоты в аналогичных объемах 10 или 20 мкл для хранения ат -70 ° C до 12 месяцев.
  8. В день прививки, место фибриногена и тромбина-содержащих фактор роста коктейли на льду до смешивали с клетками.

2. Т3 спинного мозга Перерезка

  1. Обезболить взрослых женщин Фишер 344 крыс или бестимусных голых крыс с помощью приемлемых методов. Субъекты глубоко под наркозом, когда реагирование на хвост и лапы крайнем случае полностью отсутствуют. Примечание: Обычно мы используем 150-200 г крыс Фишера или 180-220 г. бестимусных крыс, а также анестезии коктейль (2 мл / кг) кетамина (25 мг / мл), ксилазина (1,3 мг / мл) и ацепромазина (0,25 мг / мл).
  2. Применить глазную мазь, чтобы предотвратить сухость и повреждение глаз в то время как животные находятся под наркозом.
  3. Бритье верхний грудной области и протереть кожу Бетадин.
  4. Разрежьте кожу и мышцы с помощью # 15 лезвие, подвергать T3 позвонка с помощью хирургического втягивающим, а также выполнять ламинэктомии на T3 позвонка выставить T3 / 4 спинной мозг с помощью Rongeur.
  5. Сделайте долготапродольной срединный разрез в твердой мозговой оболочки около 2 мм длиной, используя # 11 лезвие.
  6. Наведите иридэктомия ножницы под твердой мозговой оболочки, чтобы сократить правую боковую весь спинной мозг. Сделайте еще один порез на той же стороне 1,5 мм больше cadually.
  7. Аспирируйте ткани спинного мозга между двумя срезанных сегментов с тупым 23 G иглы, подключенного к умеренной вакууме интенсивности. Используйте визуальный контроль, чтобы обеспечить полное рассечение снизу и с боков. Это позволит завершить боковую гемисекции.
  8. Чтобы продлить поражение в перерезки спинного полной ширины мозга, поместите зеркало разрезы в левый hemicord. Попытка покинуть твердую мозговую оболочку нетронутыми, кроме первого разреза, чтобы сохранить твердую трансплантат / фибрина матрицу, в месте повреждения при прививке через две недели.
  9. Шовный мышцы, применять порошок антибиотика и главный продукт кожи.
  10. Введите лактат (3 мл) Рингера, Bannamine (2,5-5 мг / кг) и ампициллин (80-100 мг / кг) (см. таблицу материалов) сразу же после операции и Майntain крысы в ​​теплом инкубаторе до терморегуляции не будет восстановлена.
  11. Опорожнить мочевой пузырь и не вводить раствор Рингера и ампициллин два раза в день в течение двух недель до установления рефлекторной опорожнения мочевого пузыря (рис. 1b).

3. Подготовка Свежеиспеченные диссоциированных эмбриональный день 14 спинного мозга нервные стволовые клетки

  1. Получить ИНБРЕДНЫЕ трансгенных GFP F344 крыс (F344-TG (UBC-EGFP) F455Rrrc) от Rat ресурс и научно-исследовательский центр, Университет Миссури.
  2. Введите 40 мкг дез-Gly 10, [D-Ala 6]-Leuteinizing гормон высвобождающий гормон этиламид (LHRH), разведенного в PBS при концентрации 200 мкг / мл внутрибрюшинно (IP) в зрелом самок крыс (8 недель и старше) после 2 -3 ч света индукции для синхронизации отбора эмбрионов.
  3. Mate со зрелой GFP гомозиготной или гетерозиготной мужской крысы в ​​течение ночи 4 дня после инъекции.
  4. Сбор эмбрионов в дни 13,5-14,5 postcoitus(Шт) в холодном буфере HBSS, изучить выражение GFP рамках проекта "NightSea" фонарик и фильтров стекол (BLS1 - BlueStar фонарик и модель VG1 барьер фильтр) или флуоресцентным микроскопом.
  5. Проанализируйте спинной мозг из асептических от каждого GFP-положительных плода и удалить вышележащие мозговые оболочки и прикрепленный спинальных ганглиев с иридэктомия ножницами и ювелиров щипцами.
  6. Соберите расчлененные спинного мозга в 2 мл холодного буфера HBSS в 15 мл cornical трубки и держать на льду.
  7. Следуйте ссылка # 20 для диссоциации расчлененный спинного мозга:
    1. Вкратце, добавляют 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в пробирку, содержащую рассеченные спинного мозга (несколько шнуры могут быть переварены вместе, один шнур может генерировать достаточное количество клеток для трансплантата одного субъекта) и переварить при 37 ° С в течение 10-12 мин.
    2. Остановить реакцию трипсина путем добавления 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS в пробирку центрифуги и тканей при 2500 оборотов в минуту в течение 2 мин.
    3. Ресуспендируют ткани в 2 мл Neurobasal среднего сотрудничестваntaining 2% B27, и растирают ткани спинного мозга с помощью постепенно меньшие огневой полировкой Пастера пипец.
    4. Центрифуга клетки при 2500 оборотов в минуту в течение 2 мин, ресуспендируют в 2 мл Neurobasal среде, содержащей B27 и фильтрующих ячеек с мобильного сетчатый фильтр 40 мкм.
  8. Граф клеток с помощью гемоцитометра и разделить клетки одинаково в две пробирки Эппендорфа.
  9. Центрифуга клетки и полностью удалить надосадочную жидкость (1-2 мин необходимо вывести все супернатанта с низким вакуумной наконечника), так коктейли фактор роста не будет разбавлен оставшейся надосадочной жидкости после клетки ресуспендируют.
  10. Ресуспендируют каждую половину клеток в фибриногена или рабочего раствора тромбина, содержащего факторы роста, соответственно, при концентрации 250000 клеток / мкл (осадок клеток отсчетов около ⅓ конечного объема) и разместить их на лед предварительного трансплантации (рис. 1А). Следует отметить, что фибриноген может спонтанно гель при смешивании с клеткойс до объединения с тромбина на поражение / трансплантата сайта; чтобы избежать преждевременного гелеобразования, смешать клетки в фибриногена непосредственно перед клеток прививки в естественных условиях.

4. Трансплантация

  1. Reexpose пораженное T3 / 4 спинной мозг через две недели после перерезки спинного мозга.
  2. 5 мкл фибриногена-клеток и 5 мкл тромбина-клетки могут быть непосредственно введен в девяти точках месте повреждения через герметичный рубцовой ткани и интактной твердой мозговой оболочки без повторного открытия месте повреждения.
  3. Используйте 27 г иглы для создания 9 лунок на поверхности рубцовой ткани и неповрежденной твердой мозговой оболочки 1-2 недели после поражения: 3 в центре (один в средней точке и два в боковых и расположенных 0,5 мм друг от друга) и 3 в обоих ростральнее и 3 в хвостовой интерфейса (около 0,5 мм ростральной или хвостовой к центру поражения).
  4. Тогда придать половину объема раствора фибриногена клеток в трех центральных точках сайте поражения и объемом четверть на 3 точках ростральной интерфейсом и воднымОбъем uarter на 3 точках хвостового интерфейса.
  5. Затем сразу же придать throbmbin клетки в тех же самых местах. Смесь фибриногена клеток и тромбина клеток внутри очага повреждения сформирует фибрина гель для хранения клеток в месте повреждения и коктейли фактор роста будет поддерживать выживание клеток. Клетки вводят с помощью вытащил стеклянный пипетки, подключенных к PicoSpritzer (Генеральный клапан, Inc.)
  6. Трансплантации культивированных человеческих NSCs 21 в той же процедуре, описанной выше, и использовать фибрина и фактора роста коктейли, сделанные из человеческих реагентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GFP иммуногистологического маркировка показывает, что привитой крыс NSCs ресуспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) (отсутствует фибринового матрикса и факторов роста) выжили плохо в перерезки сайта Т3, только крепления к краю поражение / хост и оставляя большую часть месте повреждения пустой без привитые клетки (рис. 2а). Выживание НСК улучшена при совместном с привитым только фибрина матриц, но трансплантат не полностью заполнить большое поражения полость (данные не показаны). Поэтому мы встроили НСК в фибрин матриц, содержащих коктейли фактор роста для повышения их выживание, заполняя крупных поражения полости и дифференциации в нейроны и клетки глии после спинного мозга перерезки 15-17. Прививки из любой крысы или человека НСК последовательно и полностью заполнить полость поражения при оценке семь недель после прививки 18 (рис. 2В-C).

Мы провели исследование время курса для изучения в началевыживание и заполнение полости поражения после прививки НСК встроенных в фибрина матриц с коктейлями факторов роста. Гистологический анализ показал, что GFP выражающие НСК выжил и через 24 часа после трансплантации (3А-B). Привитые NSCs постепенно более плотной в течение долгого времени, чтобы полностью заполнить полость ПЕРЕСЕЧЕННОМ поражения на первой недели после трансплантации, вероятно, из-за пролиферации 21 (фиг. 3C-H). Кроме того, привитые НСК хорошо интегрированы в интерфейс хост / поражения и, казалось, уменьшить регионы GFAP иммунореактивности в кулуарах поражения полости (рис. 3).

Часть привитых НСК дифференцировались в NeuN-экспрессирующих нейронов семь недель после трансплантации (фиг. 4A-B). Кроме того, привитые происхождения нейронов спинного мозга расширен большое количество аксонов в принимающей спинного мозга в обоих ростральных и хвостового направлениях на большие расстояния 18 < / SUP> (рис. 4С). Привитые, полученные аксоны продлен рострально и каудально через обе белого вещества и серого вещества в принимающей спинного мозга (рис. 4D-E).

Рисунок 1
Рисунок 1. Экспериментальная схема и Time Line. А) Схематическое изображение взято из Попович 22 (Cell, 2012) иллюстрирует трансплантации нервных стволовых клеток с фибрин гель, содержащий фактор коктейль роста в полностью перерезана спинного мозга. Б) Экспериментальные линии времени. Поведенческие и electriophysiological анализы могут быть выполнены после клеточной трансплантации и до перфузии. Время выживания субъектов может быть переменной. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

ntent "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 2
.. Рисунок 2 Выживание и Заполнение нейронных стволовых клеток трансплантатов в Т3 Полное сайтов перерезки GFP и GFAP люминесцентные иммуномечение в горизонтальных участках демонстрирует (а) плохую выживаемость крыс E14 НСК (зеленый) ресуспендировали в PBS хватает факторы роста и фибрина матрицу; BC) Отлично выживание и полное заполнение полости поражения при (B) крыса или (с) человека NSCs были встроены в фибрин матриц, содержащих коктейли фактора роста. Сотовый были привиты к Т3 перерезки сайтов для 7 недель. Шкала бар, 310 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

6.5in "Первоначально" / files/ftp_upload/50641/50641fig3highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 3. Выживаемость трансплантата в начале моменты времени. А.Б.) GFP и GFAP двойной иммуномечение шоу выживание и распространение привитыми НСК крыс в месте перерезки, 1 день после имплантации в фибринового матрикса. В штучной упаковке площадь в А показан в большем увеличении на панели Б. CD) выживаемость клеток и распределения также очевидно в День 2 и (EF) День 3 после прививки. GH) на 7 дней, клетки заполняют поражения сайт и плотнее. Шкала бар: А, С, Е, G, 300 мкм; B, D, F, H, 62 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4
Рисунок 4. Дифференциация и следствием Neural Steм Сотовые Прививки в T3 Полный перерезки сайта. А.Б.) GFP и NeuN маркировка подтвердить обширный дифференцировку нейронов / созревание привитой крыс нервные стволовые клетки через 7 недель после прививки. C) GFP и NeuN иммуномечение показывает, что GFP-экспрессирующих нейронные трансплантаты стволовых клеток расширить большое количество аксонов в принимающей спинного ростральнее мозга и Хвостовой на сайт перерезки (хвостовой показан), через две недели после прививки. DE) большее увеличение от коробочных областях панели C показывают, что обширные районы принимающей спинного мозга содержат привитые полученных аксональные прогнозы как в белом веществе и серого вещества. Шкала бар: AB, 62 мкм; С 700 мкм; DE, 62 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Одним из основных препятствий для трансплантации НСК в поврежденный спинной мозг беден выживание в поражения центра. Любые пробелы или полости в месте повреждения может потенциально снизить или ослабить формирование функциональных нейронных реле между супраспинальных аксонов и разделенными сегментов спинного мозга ниже травмы. Кроме того, плохая выживаемость привитых НСК может повлиять на их интеграцию с ткани хозяина, и, следовательно, уменьшить связность привитых нейронов с принимающими нейронов. Потенциальные механизмы, чтобы объяснить потерю клеток включают цитотоксическое среды, созданной острой ТСМ, вторичное вырождение принимающей спинного мозга, а также недостаточное кровоснабжение потерпевшего области 4.

Фибрин был использован для доставки клеток, наркотики и факторы роста в различных экспериментальных моделях и клинических применений, так как он может сохранить клетки и молекулы, когда она становится полимеризованный 23. Предыдущее исследование показало, что человеческая фибринового герметикаможет служить биоматрицы повышения регенерацию аксонов в субтотально перерезана спинной мозг, не вызывая обнаруживаемых Побочные эффекты 24. Мы ранее использовали фибрина матриц для встраивания мозга стромальных клеток костного для трансплантации в хронически поврежденный спинной мозг 17. Привитые клетки выжил и в хронической сайте поражения и хорошо интегрированы с паренхимы хозяин спинного мозга 17. Таким образом, мы расширили использование фибрина вставлять НСК для трансплантации в больших открытых поврежденных участках, в перерезанного спинного мозга. Хотя выживание привитыми НСК улучшена с фибрин, выживание привитыми НСК остается несколько переменная и привиты НСК редко полностью заполнен большую полость поражения.

Поэтому мы добавили коктейль из факторов роста в попытке повысить выживаемость и пролиферацию НСК в месте повреждения. Факторы роста, как было показано в многочисленных исследованиях, чтобы поддержать НСК в пробирке 25. Whiле добавление факторов роста к культурам НСК может изменить свою судьбу, мы не качественно обнаружить очевидное изменение в нейронной плотности при коктейли фактор роста добавляют к трансплантата по сравнению с теми частично сохранилось трансплантата без факторов роста. Более подробный анализ необходимо прежде чем мы сможем оценить с уверенностью влияние коктейлей факторов роста на судьбу клеток. Во время нормальной развития нервной системы, выживание и рост нейронов зависит от нейротрофических факторов, которые часто опубликованным роста аксонов направляющей ткань-мишень и, в некоторых случаях, влияющих на выживаемость нейронов 26.

Аналогичные, но более простые коктейли фактора роста были использованы другими группами для повышения выживаемости и дифференциацию НСК как в пробирке и в естественных 15,16. Эти усилия в совокупности привели в менее обширной выживания НСК чем подхода множественных факторов, которые мы приняли. Существенным Следующим шагом в этом развитииусилия, чтобы сузить список факторов роста в коктейль, которые необходимы для поддержки НСК выживание, усилие, которое идет полным ходом. Вполне возможно, что более ограниченное число факторов роста будет поддерживать равные степени выживание трансплантата, нахождения, что бы упростить этот экспериментальный подход и его потенциальной перевод на исследованиях на людях.

В дополнение к использованию фибриновых матриц и коктейлей факторов роста, успех в естественных условиях прививке к тяжелой месте повреждения может зависеть от механических факторов в месте повреждения. Мы прилагаем все усилия, чтобы сохранить целостность чрезвычайно тонкой твердой мозговой оболочки, что перекрывает грызунов спинного мозга после повреждений и прививки, в попытке механически сохранить трансплантированных клеток в месте повреждения. Таким образом, мы делаем осторожные и старательные усилия по оптимизации последовательного заполнения ячеек месте повреждения. Без этих многочисленные усилия, заполнение трансплантата является неполной. Эти методы требуют больших практическисе.

В попытке научить эту технику к другим, мы определили некоторые проблемы. Если клетки инъецируют в принимающей спинного мозга вместо полости поражения, а затем клетки могут дифференцироваться в преимущественно глии. В этом случае, число новых аксонов значительно снижается. Если большое внимание и усердие не сделал, чтобы заполнить полость поражения с использованием нескольких методов и подходов, описанных в предыдущих пунктах, выживаемость клеток менее последовательны и биологические реакции, в том числе аксонов, ограничены. Таким образом, очень важно, чтобы посвятить значительное время, трудолюбие и дотошный технику, чтобы успешно использовать эти методы. После того, как методы приобрел, результаты весьма последовательной от животного к животному, получая возможность изучать замечательные биологические свойства этих НСК в центральной нервной системе сайтов поражения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Rat ресурсов и научно-исследовательский центр, Университет Миссури, Колумбия, штат Миссури, для обеспечения GFP крыс; Neuralstem Инк для обеспечения человека нервные стволовые клетки. Эта работа была поддержана Администрацией по делам ветеранов, NIH (NS09881), канадской исследовательской организацией спинного, Крэйг Х. Нильсен Foundation, и Бернард и Энн Spitzer Благотворительный фонд.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen (rat) Sigma F6755-25MG 2 hr at 37 °C to dissovle
Stock Concentration: 50 mg/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat) Sigma T5772-100UN Dissovle in 10 mM CaCl2
Stock Concentration: 50 U/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human) Sigma F0291 (25 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine) Sigma E1257 (0.1 mg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human) Peprotech 452-02 (1 mg) Stock Concentration: 1,000 ng/μl
Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human) Peprotech 452-03 (1 mg) Stock Concentration: 1,000 ng/μl
Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat) Sigma G1401 (10 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse) Sigma I8779 (50 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human) Sigma F5542 (25 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human) Sigma P3076 (10 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human) Sigma H9661 (5 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170 Sigma M6690 (25 mg) Stock in DMSO
Stock Concentration: 1 mM
Final Concentration: 50 μM
PBS Millipore BSS-1005-B Stock Concentration: 1x
Final Concentration: 1x
DMSO Sigma D2650
Ketamine Putney 26637-411-01 40-80 mg/kg
Stock Concentration: 100 mg/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine Lloyd 0410, 2.5-8 mg/ml
Stock Concentration: 100 mg/ml
Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine Butler 003845 0.5-4 mg/ml
Stock Concentration: 10 mg/ml
Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine Healthpets BET16OZ
Ringers Abbott 04860-04-10 2-3 ml/inj
Banamine Schering-Plough 0061-0851-03 2.5-5 mg/kg
Stock Concentration: 50 mg/ml
Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin Sandoz 0781-3404-85 80-100 mg/kg
Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH Sigma L4513 200 μg/kg
Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS Gibco 14175-096
Trypsin Gibco 25200056 Stock Concentration: 0.25 %
Final Concentration: 0.125 %
DMEM Gibco 11995073
FBS Gibco 16000044 Stock Concentration: 100 %
Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium Gibco 21103049
B27 Gibco 17504044 Stock Concentration: 100x
Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
  2. Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
  3. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
  4. Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
  5. Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
  6. Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
  7. Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
  8. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
  9. Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
  10. Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
  11. Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
  12. Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
  13. Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
  14. Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
  15. Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
  16. Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
  17. Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
  18. Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
  19. Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
  20. Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
  21. Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
  22. Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
  23. Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
  24. Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
  25. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  26. Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).

Tags

Neuroscience выпуск 89 заболевания нервной системы ранения и травмы биологические факторы терапевтические хирургические процедуры нервные стволовые клетки трансплантация повреждение спинного мозга фибрин факторы роста
Продвижение выживания и дифференцировка нервных стволовых клеток с фибрином и фактор роста Коктейли после Тяжелая травмы спинного мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, P., Graham, L., Wang, Y., Wu,… More

Lu, P., Graham, L., Wang, Y., Wu, D., Tuszynski, M. Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (89), e50641, doi:10.3791/50641 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter