Summary
Fibrinmatriser innehåller tillväxtfaktorer användes för att behålla ympade neurala stamceller till områden av kompletta ryggmärgen transection. Transplanterade celler fylls fullständigt lesionen hålrum och differentieras i flera neurala celltyper, bland annat nervceller som utökade axoner till värd ryggmärgen över långa avstånd.
Abstract
Neurala stamceller (NSCs) kan själv förnya och differentiera till neuron och glia. Transplanterade NSCs kan ersätta förlorade nervceller och glia efter ryggmärgsskada (SCI), och kan bilda funktionella reläer för att återansluta ryggmärgssegment över och under en skada. Tidigare studier ympning neurala stamceller har begränsats av ofullständig graftöverlevnad inom ryggmärgsskada hålighet. Vidare hade spårning av transplantatcellöverlevnad, differentiering och processen förlängning inte optimerats. Slutligen, i tidigare studier, odlade rått NSCs var oftast rapporterades att differentiera till glia när ympas till den skadade ryggmärgen, snarare än neuroner, om inte ödet drevs till en viss celltyp. För att hantera dessa frågor, har vi utvecklat nya metoder för att förbättra överlevnaden, integration och differentiering av NSCs till platser i och med svår SCI. NSCs var nyligen isolerades från embryonala dag 14 ryggmärgen (E14) från en stabil transgen Fischer 344 råtta som uttrycker gröna fllysrör protein (GFP) och bäddades in i en fibrin-matris innehållande tillväxtfaktorer; denna formulering syftar till att behålla ympade celler i lesionen hålighet och stödja cellöverlevnad. NSCs i fibrin / tillväxtfaktor cocktail implanterades två veckor efter thorax nivå-3 (T3) komplett ryggmärgs transections och därmed undvika rusnings av inflammation. Resulte transplantat fyllas helt lesionen hålrum och differentieras i både nervceller, vilket utökade axoner i värd ryggmärgen över anmärkningsvärt långa sträckor, och glia. Transplantat av odlade humana NSCs uttrycker GFP gav liknande resultat. Således är förfaranden som definierats för att förbättra neural stamcell ympning, överlevnad och analys av in vivo rönet.
Introduction
Ryggmärgsskada (SCI) ofta skadar inte bara vita substans som transporterar signaler till och från hjärnan, men också den centrala grå substans, som orsakar segmentell förlust av intern och motoriska nervceller. Konsekvensen av SCI är förlust av både motoriska och sensoriska funktioner nedanför lesionen. Tyvärr gör det vuxna centrala nervsystemet (CNS) inte spontant regenerera, vilket resulterar i bestående funktions underskott 1. Därför är rekonstruktion av det skadade vuxna ryggmärgen och förbättrad motor, sensorisk och autonom funktion ett viktigt mål för SCI forskning. Neurala stamceller (NSCs), vare sig direkt isolerat från embryonala eller vuxna CNS, finns tvingande kandidatceller för att ersätta förlorade nervceller och glia. Dessutom, dessa celler har potential att bilda nya funktionella reläer för att återställa axonal ledning över en skadestället 2,3.
Till dags dato har det inte funnits en utförlig belysning av de anatomiska, electrophysiological och beteendemässiga effekter av neuronal reläbildning genom transplanterade NSCs efter svår SCI. Det finns flera orsaker till detta: för det första, transplanterade NSCs eller fostrets CNS-vävnad överleva dåligt när inympade i stora lesion håligheter. Tidigare studier visar betydande tidiga cellförlust, lämnar stora tomma cystisk lesion håligheter 4,5. I några studier de ympade celler skulle därefter dela och fylla lesionen hålighet 4,5, men detta kan inträffa efter en fördröjning av dagar till veckor, och därefter skadestället fyllning kanske inte är fullständig eller konsekvent. För det andra, var ett effektivt spårningssystem som ger ljuddata på cellöverlevnad, differentiering / mognad, och utväxt av transplanterade NSCs saknas. De flesta tidiga studier utnyttjade antegrad och retrograd märkning för att spåra axonal prognoser från transplantationer 2,3. Men dessa tekniker endast delvis och ofta otydligt märkta axonal prognoser till följd av transplanterade celler och spårmetoder an kommat till artefakter orsakade av färgämnesläckage bortom de implanterade cellerna. Andra grupper använde humana specifika neuronala markörer för att märka axonal prognoser efter transplantation av humana fetala NSCs in skadade gnagare ryggmärgen 5,6. Men i dessa studier, de xenografter inte alltid överlever väl. Nyligen var viral leverans av GFP reporter genen används för att märka odlade NSCs 7,8. Emellertid GFP-uttryck var ofta inkonsekventa och kan nedregleras 7. Nyligen har användningen av transgena donatormöss eller råttor som stabilt uttrycker reportergenen, GFP, eller humant placentalt alkaliskt fosfatas, har dramatiskt förbättrat spårningen av transplanterade neurala stamceller / progenitorceller in vivo 9,11. För det tredje, flera studier pekar på att in vitro odlade rått NSCs härrör från antingen embryonala eller vuxna CNS uteslutande differentierar till gliaceller härstamningar när de transplanteras in i miljön i den intakta eller skadade vuxna spinal cord 7,12,13, trots att dessa neurala stamceller har förmåga att differentiera till både nervceller och glia in vitro, vilket tyder på att lokala miljöer kan diktera öde stamceller. Alternativt kan odlade NSCs, i synnerhet de som härrör från vuxna CNS, har inneboende defaulty egenskapen att differentieras till gliaceller härstamningar in vivo 13.
På grund av de begränsningar som diskuterats ovan, nyligen utvecklat vår grupp ett nytt protokoll för att förbättra embryonala NSC spårning, överlevnad och differentiering / mognad i den svårt skadade vuxna ryggmärgen. Kortfattat, började vi med en stabil transgen Fischer 344 rått Inbreed linje som uttrycker en GFP reporter gen som upprätt GFP uttryck efter in vivo transplantation 14. Därefter använde vi nyligen isolerade NSCs från embryonala dag 14 Fischer 344 ryggmärgen, ett utvecklingsstadium som behåller potential att generera både nervceller och glia. Slutligen är vi inbäddadenyligen dissocierade NSCs i en fibrin matris som innehåller tillväxtfaktorer 15-17 för att bibehålla cellerna och fördela dem inom en stor lesion hålighet, som syftar till att stödja transplantat cellöverlevnad, differentiering och integration. Transplantat placerades i områden av T3 komplett transection, två veckor efter ryggmärgsskada. De transplanterade cellerna fylls gående komplett transection platser och differentieras till rikliga nervceller som utökade många axoner till värd ryggmärgen över långa avstånd 18. Liknande resultat erhölls med hjälp av odlade humana neurala stamceller transplantat till nedsatt immunförsvar råttor 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll godkänns av VA-San Diego Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). NIH riktlinjer för laboratorie djuromsorg och säkerhet följs noga. Djur har fri tillgång till mat och vatten under hela studien och är tillräckligt behandlas för att minimera smärta och obehag.
1. Framställning av Fibrin komponenter innehållande tillväxtfaktor Cocktails
- Lös 25 mg rått fibrinogen i 0,5 ml PBS för att erhålla 50 mg / ml 2x stamlösning (se Material tabell). Fibrinogen är svår att lösa upp och bör placeras i en 37 ° C inkubator eller vattenbad och skakades varje 5-10 min under 1-2 timmar.
- Upplös 100 FN råtta trombin i 2 ml av 10 mM steril CaCl2 för erhållande av 50 U / ml 2x förrådslösning.
- Lös tillväxtfaktorer i PBS i följande nivåer för att erhålla 100 l stamlösning: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (hög aktie koncentration som intratekal infusion in vivo
- Lös 25 mg MDL28170 (calpain inhibitor) i 1,3 ml DMSO för erhållande av 50 mM DMSO-stamlösning, och sedan späda 50x i PBS för att erhålla en mM stamlösning.
- Blanda 100 pl av varje tillväxtfaktor komponent och 100 | il av MDL28170 (1 mM stamlösning) för att framställa 1000 il tillväxtfaktor cocktaillösning (fig 1).
- Blanda 500 l fibrinogen 2x stamlösning med 500 l tillväxtfaktor cocktail för att erhålla 25 mg / ml fibrinogen arbetslösning som innehåller tillväxtfaktorer och delprov i 10 eller 20 l för lagring vid -70 ° C. Lösningen är stabil i upp till 12 månader vid -70 ° C.
- På samma sätt, blanda 500 l trombin 2x stamlösning med 500 l tillväxtfaktor cocktail för att erhålla 25 U / ml trombin arbetslösning innehållande tillväxtfaktorer och delprov i liknande 10 eller 20 il volymer för lagring at -70 ° C i upp till 12 månader.
- På dagen för ympning, placera fibrinogen och trombin-innehållande tillväxtfaktorcocktails på is tills det blandas med cellerna.
2. T3 Ryggmärgen transection
- Bedöva vuxna kvinnliga Fischer 344 råttor eller atymiska nakna råttor med hjälp av acceptabla metoder. Ämnen är djupt sövda, då lyhördhet för svans och tass nypa är helt frånvarande. Observera: Vi använder typiskt 150 till 200 g Fischer-råttor eller 180-220 g atymiska råttor och en anestesi cocktail (2 ml / kg) av ketamin (25 mg / ml), xylazin (1,3 mg / ml) och acepromazin (0,25 mg / ml).
- Applicera ögonsalva för att förhindra torrhet eller skada på ögonen medan djuren är under narkos.
- Raka övre bröstkorg området och rengör huden med Betadine.
- Skär hud och muskler med hjälp av # 15 blad, utsätta T3 kota med hjälp av en kirurgisk upprullningsdon, och utför en laminektomi på T3 kotan att exponera T3 / 4 ryggmärgen med hjälp av en rongeur.
- Gör en longitudinal mittlinje snitt i dura av approximativt 2 mm i längd med användning av en # 11 blad.
- Placera iridectomy sax under dura att skära rätt i sidled hela ryggmärgen. Gör ett snitt på samma sida 1,5 mm mer cadually.
- Sug ryggmärgsvävnad mellan de två skurna segment med en trubbig 23 G nål ansluten till måttlig intensitet vakuum. Använd visuell kontroll för att säkerställa fullständig transection ventralt och lateralt. Detta kommer att slutföra en lateral hemisection.
- För att förlänga den skada som en full bredd ryggmärgen transection, placera spegel snitt i vänster hemicord. Försök att lämna dura intakt, utom den första snittet, för att behålla den fasta transplantat / fibrinmatris i lesionsstället när ympade två veckor senare.
- Sutur muskeln, tillämpa antibiotika pulver och häfta huden.
- Injicera Ringer-laktat (3 ml), Bannamine (2,5-5 mg / kg) och Ampicillin (80-100 mg / kg) (se Material tabell) omedelbart efter kirurgi och maintain råttor i en varm kuvös tills termo återupprättas.
- Tömma blåsan och injicera Ringers och Ampicillin lösning två gånger dagligen under ca två veckor fram till inrättandet av reflexblåstömning (Figur 1B).
3. Framställning av nyligen dissocierade embryonala dag 14 Ryggmärg neurala stamceller
- Skaffa Inbreed transgena GFP F344 råttor (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) från Rat Resurs och Research Center, University of Missouri.
- Injicera 40 ^ g des-Gly 10, [D-Ala 6]-Leuteinizing Hormone Releasing Hormone etylamid (LHRH) som spätts i PBS i en koncentration av 200 | ig / ml intraperitonealt (IP) per mogen honråtta (8 veckor gamla eller äldre) efter två -3 tim ljus induktion för synkronisering av embryosamling.
- Mate med en mogen GFP homozygot eller heterozygot hanråtta över natten 4 dagar efter injektionen.
- Samla embryon på dag 13,5-14,5 postcoitus(Pc) i kall HBSS buffert, undersöka GFP uttryck i en "NightSea" ficklampa och filterglas (BLS1 - Bluestar Ficklampa och modell VG1 barriärfilter) eller en fluorescerande mikroskop.
- Dissekera ryggmärgen ut aseptiskt från varje GFP-positivt foster och ta bort överliggande hjärnhinnor och fäst spinal ganglierna med iridectomy sax och fina juvelerare pincett.
- Samla de dissekerade ryggmärgen i 2 ml kall HBSS buffert i en 15 ml cornical rör och hålla på is.
- Följ referens # 20 att dissociera dissekerade ryggmärgen:
- Kortfattat, tillsätt 2 ml av 0,25% trypsin-EDTA till röret innehållande dissekerade ryggmärg (flera sladdar kan smälta ihop, 1 sladd kan generera tillräckligt med celler för transplantat av ett ämne) och smälta vid 37 ° C i 10-12 min.
- Stoppa trypsin reaktionen genom tillsats av 10 ml av DMEM innehållande 10% FBS till röret och centrifugera vävnaden vid 2500 rpm under 2 min.
- Resuspendera vävnad i 2 ml Neurobasal medel containing 2% B27, och mal sönder ryggmärgsvävnad med hjälp av progressivt mindre brand-polerad Pasteur pipetter.
- Centrifugera cellerna vid 2500 rpm under 2 minuter, återsuspendera i 2 ml Neurobasal-medium innehållande B27-och filter-celler med en 40 | im cellfilter sil.
- Räkna celler med en hemocytometer och dividera cellerna lika i två Eppendorf-rör.
- Centrifugera cellerna och fullständigt avlägsna supernatanten (1-2 min erfordras för att dra tillbaka all supernatanten med en låg vakuumspets) så att tillväxtfaktorcocktails kommer inte spädas på återstående supernatanten efter cell resuspension.
- Resuspendera varje halva av cellerna i fibrinogen eller trombin arbetslösning innehållande tillväxtfaktorer, respektive, vid en koncentration av 250.000 celler / | il (cellpelleten räknas för ca ⅓ slutlig volym) och placera dem på is före transplantation (Figur 1A). Observera att fibrinogen kan spontant gel när de blandas med cells innan du kombinera med trombin vid lesionen / transplantat webbplats; för att undvika för tidig gelning, blanda celler i fibrinogen omedelbart före cell ympning in vivo.
4. Transplantation
- Reexpose den skadade T3 / 4 ryggmärgen två veckor efter ryggmärgstransektion.
- 5 jil fibrinogen-celler och 5 | il trombin-cellerna kunde injiceras direkt i nio punkter i skadestället genom förseglade ärrvävnad och intakta dura utan att återuppta det skadestället.
- Använd en 27 G nål för att skapa 9 hål på ytan av ärrvävnad och intakta dura 1-2 veckor efter skada: 3 i centrum (en i mittpunkten och två i laterals, och placerade 0,5 mm från varandra) och 3 i både rostral och 3 i kaudal gränssnitt (ca. 0,5 mm rostralt och kaudalt om centrum av den lesion).
- Sedan injicera halva volymen av fibrinogen cellösningen i tre centrala punkter lesionsstället och en fjärdedel volym i 3 punkter i rostral gränssnitt och aquarter volym till 3 poäng i den näst sista gränssnittet.
- Sedan, genast injicera throbmbin celler i samma fläckar. Blandningen av fibrinogen celler och trombin celler inuti lesionsstället bildar fibrin gel för att hålla celler till skadestället och tillväxtfaktor drinkar kommer att stödja överlevnad av celler. Celler injiceras med drog glaspipetter som är anslutna till en Picospritzer (General Valve, Inc.).
- Trans odlade humana NSCs 21 i samma procedur som beskrivits ovan, och använda fibrin och tillväxtfaktor drinkar gjorda av mänskliga reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP immunhistologisk märkningen visar att transplanterad rått NSCs återsuspenderades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (som saknar en fibrinmatris och tillväxtfaktorer) överlevde dåligt i T3 transection site, bara att fästa till lesionen / värd marginal och lämnar de flesta av skadestället tom utan ympade celler (Figur 2A). Överlevnaden av NSCs förbättras vid samtidig ympat med enbart fibrin-matriser, men transplantatet inte fullständigt fylla upp en stor lesion kavitet (data ej visade). Därför är vi inbäddade NSCs i fibrinmatriser innehåller tillväxtfaktor drinkar för att förbättra deras överlevnad, fyllning av stora lesioner håligheter och differentiering till nervceller och glia efter ryggmärgen transection 15-17. Transplantat av antingen rått-eller human NSCs konsekvent och helt fylla lesionen hålighet när bedömt sju veckor efter ympning av 18 (fig. 2B-C).
Vi utförde en tidsförloppet studie för att undersöka tidigtöverlevnad och fyllning av lesionen hålighet efter ympning av NSCs inbäddade i fibrin matriser med tillväxtfaktor cocktails. Histologisk analys visade att GFP-uttryckande NSCs överlevde väl 24 h efter transplantation (fig. 3A-B). Den ympade NSCs blev gradvis tätare med tiden att helt fylla transected lesionen hålighet av den första veckan efter transplantation förmodligen på grund av spridning 21 (figur 3C-H). Dessutom ympade NSCs integrerats väl vid värd / lesion gränssnitt och verkade minska regioner i GFAP immunreaktivitet vid anslutning till lesionen hålighet (Figur 3).
En portion av ympade NSCs differentieras till NeuN-uttryckande neuroner sju veckor efter transplantation (Fig. 4A-B). Dessutom transplantat-derived ryggmärgen nervceller förlängd många axoner i värden ryggmärgen både rostralt och caudal riktningar över långa avstånd 18 < / Sup> (Figur 4C). Ympade härrör axoner förlängd rostrally och kaudalt genom både vit substans och grå substans i värd ryggmärgen (figur 4D-E).
Figur 1. Experimentell Schematisk och Time Line. A) Schematisk ritning anpassad från Popovich 22 (Cell, 2012) illustrerar transplantation av neurala stamceller med fibrin gel innehållande tillväxtfaktorcocktail in helt transected ryggmärgen. B) Experimentell tidslinje. Beteende-och electriophysiological analyser kan utföras efter cell ympning och före perfusion. Överlevnadstiden för patienter kan vara variabel. Klicka här för att visa en större bild .
.. Figur 2 Överlevnad och Fyllning av Neural Stem Cell transplantat i T3 Kompletta transection webbplatser GFP och GFAP fluorescerande immunomärkning i horisontella sektioner visar (A) dålig överlevnad råtta E14 NSCs (grön) åter suspenderade i PBS saknar tillväxtfaktorer och fibrin matris; BC) Utmärkt överlevnad och fullständig fyllning av skada kavitet när (B) råtta eller (C) mänskliga NSCs var inbäddade i fibrin matriser som innehåller tillväxtfaktor cocktails. Cell var inympade i T3 transection platser för 7 veckor. Skala bar, 310 nm. Klicka här för att visa en större bild .
6.5in "src =" / files/ftp_upload/50641/50641fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 3. Graft överlevnad vid tidig tidpunkter. AB) GFP och GFAP dubbel immunomärkning show överlevnad och fördelning av ympade rått NSCs i transection site, en dag efter implantation i en fibrinmatris. Boxed area i A visas vid högre förstoring i panel B. CD) Cellöverlevnad och distribution är också uppenbart vid dag 2 och (EF) Dag 3 efter ympning. GH) Av 7 dagar, celler fylla skadestället och är tätare. Scale bar: A, C, E, G, 300 ^ m; B, D, F, H, 62 um. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Differentiering och utväxt av Neural Stem Cell transplantat i T3 komplett transection Site. AB) GFP och NeuN märkning bekräftar omfattande neuronal differentiering / mognad av ympade råtta neurala stamceller 7 veckor efter ympning. C) GFP och NeuN immunomärkning avslöjar att GFP-uttryckande neurala stamceller transplantat förlänga stort antal axoner i värden ryggmärgen rostralt och kaudalt till transection webbplats (caudal visat), två veckor efter ympning. DE) Högre förstoring från boxed områden panel C visar att stora områden i värd ryggmärgen innehåller graft-härledda axonal prognoser i både vit substans och grå substans. Skala bar: AB, 62 um; C, 700 ^ m; DE, 62 um. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de stora hindren för NSC transplantation i den skadade ryggmärgen är dålig överlevnad i lesionen centrum. Eventuella luckor eller hålrum i lesionsstället skulle kunna minska eller försvaga bildandet av funktionella neuronala reläer mellan supraspinala axoner och separerade ryggmärgssegment nedanför skadan. Dessutom kan dålig överlevnad av transplanterade NSCs påverkar deras integration med värdvävnaden, och därmed minska anslutning av transplanterade nervceller med värd nervceller. Möjliga mekanismer för att förklara cellförlust inkluderar cytotoxiska miljö som skapats av akut SCI, sekundär degeneration i värd ryggmärgen, och otillräcklig vaskularisering av de skadade området 4.
Fibrin har använts för att leverera celler, droger och tillväxtfaktorer i olika experimentella modeller och kliniska tillämpningar, eftersom det kan behålla celler och molekyler när det blir polymeriserad 23. En tidigare studie visade att den mänskliga fibrintätningsmedelkan fungera som en biomatris att förbättra axonal regeneration i subtotally transected ryggmärgen utan att framkalla påvisbara skadliga effekter 24. Vi har tidigare använt fibrinmatriser att bädda benmärgsstromaceller för transplantation till kroniskt skadade ryggmärgen 17. Transplanterade celler överlevde väl i den kroniska skadestället och integreras väl med värd ryggmärgen parenkymet 17. Därför förlängde vi användning av fibrin för att bädda NSCs för transplantation till stora öppna lesioner platser i transected ryggmärgen. Även om överlevnaden av ympade NSCs förbättrades med fibrin, förblev överlevnad ympade NSCs något varierande och ympade NSCs sällan helt fylld stor skada hålighet.
Vi lade därför en cocktail av tillväxtfaktorer i ett försök att öka överlevnad och spridning av NSCs i lesionsstället. Tillväxtfaktorer har visats i ett flertal studier att stödja NSCs in vitro 25. While tillägg av tillväxtfaktorer till kulturer av NSCs kan ändra sitt öde, vi inte kvalitativt upptäcka uppenbar förändring i neuronal densitet när tillväxtfaktor cocktails läggs till transplantatet jämför med de som delvis överlevt transplantat utan tillväxtfaktorer. En mer detaljerad analys är nödvändig innan vi kan uppskatta med säkerhet påverkan av tillväxtfaktor cocktails på cell öde. Under normal neural utveckling, överlevnad och tillväxt av nervceller beror på neurotrofiska faktorer som ofta släpptes av målvävnad styr axonal tillväxt och, i vissa fall påverka neuronal överlevnad 26.
Liknande men enklare tillväxtfaktorcocktails har utnyttjats av andra grupper för att öka överlevnad och differentiering av NSCs både in vitro och in vivo 15,16. Arbetet har i allmänhet lett till mindre omfattande NSC överlevnad än den multipla faktorn strategi som vi har antagit. Ett viktigt nästa steg i denna utvecklingansträngning är att begränsa listan av tillväxtfaktorer i cocktail som är viktigt att stödja NSC överlevnad, ett försök som pågår. Det är fullt möjligt att ett mer begränsat antal tillväxtfaktorer kommer att stödja lika grader av transplantatöverlevnad, ett konstaterande som skulle förenkla denna experimentella strategi och dess potential översättning till humanstudier.
Förutom användningen av fibrin-matriser och tillväxtfaktorcocktails kan framgången för ympning in vivo till den allvarliga skadestället beror på mekaniska faktorer i skadestället. Vi gör allt för att upprätthålla integriteten i den extremt tunna duralmembranet som ligger över den gnagare ryggmärgen efter skador och ympning, i ett försök att mekaniskt hålla ympade celler i lesionsstället. Därför gör vi noggranna och ihärdiga ansträngningar för att optimera konsekvent cell fyllning av lesionsstället. Utan dessa flera insatser, är graft fyllning ofullständig. Dessa tekniker kräver omfattande prakce.
I försök att lära ut denna teknik till andra, har vi identifierat vissa utmaningar. Om celler injiceras in i värd ryggmärgen stället för lesionen hålighet, då cellerna kan preferentiellt differentiera till glia. I detta fall är antalet nya axoner kraftigt reducerad. Om stor omsorg och flit inte är gjorda för att fylla lesionen hålrum med hjälp av olika tekniker och metoder som beskrivs i punkterna ovan, är cellöverlevnad mindre konsekvent och biologiska reaktioner, inklusive Axon utväxt, är begränsade. Därför är det viktigt att ägna avsevärd tid, flit och noggrann teknik för att framgångsrikt använda dessa metoder. När teknikerna förvärvas, resultaten är mycket konsekvent från djur till djur, vilket ger möjlighet att studera de märkliga biologiska egenskaperna hos dessa NSCs i centrala nervsystemet lesioner webbplatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Rat Resurs och Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, för att ge GFP råttor; Neuralstem Inc. för att tillhandahålla humana neurala stamceller. Detta arbete stöddes av Veterans Administration, NIH (NS09881), kanadensiska Spinal Research Organisation, The Craig H. Neilsen Foundation och Bernard och Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
