Summary
Fibrin-Matrices, die Wachstumsfaktoren wurden verwendet, um aufgepfropften neuronalen Stammzellen in Websites von kompletten Durchtrennung des Rückenmarks zu behalten. Transplantierten Zellen die Läsion Hohlraum vollständig gefüllt ist und in mehrere neuronale Zelltypen, einschließlich Neuronen, die Axone in Wirtsrückenmark über lange Distanzen erweitert differenziert.
Abstract
Neuronale Stammzellen (NSCs) können Selbsterneuerung und Differenzierung in Neurone und Gliazellen. Transplantierte NSCs können verlorene Neuronen und Gliazellen nach einer Rückenmarksverletzung (SCI) zu ersetzen, und kann Funktionsrelais zu bilden, um wieder zu verbinden Rückenmarksegmente über und unter einer Läsion. Frühere Studien Transplantation neuraler Stammzellen durch unvollständige Überleben des Transplantats innerhalb des Rückenmarksverletzung Hohlraum begrenzt. Ferner Verfolgung Transplantat Überleben der Zellen, Differenzierung und Verfahren Verlängerung noch nicht optimiert. Schließlich ist in früheren Studien kultivierten Ratten NSC wurden typischerweise berichtet in Glia differenzieren, wenn der verletzten Rückenmarks, anstatt Neuronen gepfropft, außer Schicksal wurde auf einen spezifischen Zelltyp angetrieben. Um diese Probleme anzugehen, haben wir neue Methoden, um das Überleben, Integration und Differenzierung von NSCs zu den Orten der sogar schwere SCI verbessern. NSCs wurden frisch aus embryonalen Tag 14 Rückenmark (E14) von einer stabilen transgenen Rattenlinie Fischer 344 grün fl ausdrücken isoliertuorescent Protein (GFP) und wurden in eine Fibrinmatrix Wachstumsfaktoren enthält, eingebettet ist; diese Formulierung zielte darauf ab, transplantierten Zellen behalten in der Läsion Höhle und unterstützt das Überleben der Zelle. NSCs in der Fibrin / Wachstumsfaktor-Cocktail wurden zwei Wochen nach Brust-Ebene-3 (T3) komplette Rückenmarksquerschnitten erhalten implantiert, wodurch vermieden Spitzenzeiten der Entzündung. Resultierende Transplantate die Läsion Hohlraum vollständig gefüllt und in den beiden Nervenzellen, die Axone in die Wirtsrückenmark über erstaunlich große Entfernungen erweitert und Glia differenziert. Transplantate von kultivierten menschlichen NSCs, die GFP zu ähnlichen Ergebnissen. Somit sind Verfahren zur Verbesserung der neuronalen Stammzelltransplantation, das Überleben und die Analyse der in vivo Befunde definiert.
Introduction
Rückenmarksverletzung (SCI) oft Schäden, die nicht nur der weißen Substanz, die Signale vom und zum Gehirn führen, sondern auch die zentrale graue Substanz, was Segmentverlust von Inter und Motor-Neuronen. Die Folge ist der Verlust der SCI sowohl motorische und sensorische Funktion unterhalb der Läsion. Leider hat der erwachsenen Zentralnervensystem (ZNS) nicht spontan regenerieren, was zu einer dauerhaften Funktionsdefizite ein. Daher ist der Wiederaufbau des verletzten Rückenmarks und Erwachsenen Verbesserung der motorischen, sensorischen und vegetativen Funktion ein wichtiges Ziel der SCI Forschung. Neuronale Stammzellen (NSCs), auch direkt aus embryonalen oder adulten ZNS isoliert, sind überzeugende Kandidatenzellen, um verlorene Neuronen und Glia zu ersetzen. Darüber hinaus sind diese Zellen haben das Potenzial, neue Funktionsrelais bilden axonalen Leitung über eine Läsion 2,3 wiederherzustellen.
Bisher hat es nicht eine detaillierte Erläuterung der anatomischen, electrophysiologische und Verhaltenseffekte von neuronalen Relais Bildung durch transplantierte NSCs nach schweren SCI. Es gibt mehrere Gründe dafür: Erstens, NSCs oder transplantierten fetalen ZNS-Gewebe überleben schlecht, wenn sie in großen Läsion Hohlräume gepfropft. Frühere Studien zeigen erhebliche frühen Zellverlust, so dass große, leere zystische Läsion Hohlräume 4,5. In einigen Studien die transplantierten Zellen anschließend aufteilen würde und füllen die Läsion Hohlraum 4,5, aber dies könnte nach einer Verzögerung von Tagen bis Wochen auftreten, und anschließende Befüllung Läsion möglicherweise nicht vollständig oder konsistent sein. Zweitens, ein effizientes Tracking-System, das Sound-Daten auf das Überleben der Zellen, Differenzierung / Reifung und Auswuchs von transplantierten NSCs bietet fehlte. Die meisten frühen Studien genutzt antegrade und retrograde Markierung zu axonalen Projektionen aus Transplantationen 2,3 verfolgen. Nur teilweise und oft undeutlich markierten axonale Projektionen aus transplantierten Zellen und Tracerverfahren Diese Techniken sind jedoch subjektivt, um Artefakte durch Farbstoff Leckage über den implantierten Zellen. Andere Gruppen verwendet menschlichen spezifischen neuronalen Marker zur axonalen Projektionen nach Transplantation von humanen fötalen NSCs in Rückenmark verletzt Nagetier 5,6 kennzeichnen. Doch in jenen Studien, die Heterotransplantate nicht durchweg gut überleben. Kürzlich, virale Lieferung der GFP-Reporter-Gen wurde verwendet, um kultiviert NSCs 7,8 kennzeichnen. Allerdings war die GFP-Expression oft widersprüchlich und kann nach unten reguliert werden 7. Kürzlich wurde die Verwendung von transgenen Mäusen oder Ratten Spender des Reportergens GFP oder die menschliche plazentale alkalische Phosphatase stabil exprimieren, dramatisch verbessert die Verfolgung von transplantierten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen in vivo 9,11. Drittens, einige Studien zeigen, dass in vitro kultivierten Ratten NSCs entweder aus embryonalen oder adulten ZNS, ausschließlich in Gliazellen Linien differenzieren, wenn in das Milieu des intakten oder verletzten Erwachsenen Rückenmark transplantiertd 7,12,13, trotz der Tatsache, dass diese neuronalen Stammzellen zur Differenzierung zu Neuronen und Gliazellen sowohl in vitro, was anzeigt, dass die lokalen Umgebungen kann das Schicksal von Stammzellen zu diktieren. Alternativ können kultiviert NSCs, vor allem aus adulten ZNS abgeleitet, intrinsische Eigenschaft defaulty müssen in Gliazellen Linien in vivo 13 unterscheiden.
Aufgrund der oben diskutierten Einschränkungen unserer Gruppe vor kurzem ein neues Protokoll entwickelt, um embryonale NSC-Tracking, das Überleben und die Differenzierung / Reifung in der schwer verletzten Erwachsenen Rückenmark zu verbessern. Kurz gesagt, begannen wir mit einer stabilen transgenen Fischer 344 Ratten-Inzuchtlinie einen GFP-Reporter-Gen, das die GFP-Expression in vivo nach Transplantation erhält 14 abzugeben. Weiter haben wir frisch getrennt NSCs aus embryonalen Tag 14 Fischer 344 Rückenmark, eine Stufe der Entwicklung, die das Potenzial, beide Neuronen und Gliazellen zu generieren behält. Schließlich haben wir eingebettetfrisch gewonnenen NSCs in eine Fibrin-Matrix Wachstumsfaktoren enthält, 15-17, um die Zellen zu halten und verteilen sie in einem großen Hohlraum Läsion, mit dem Ziel, Transplantat Überleben der Zelle, Differenzierung und Integration. Die Transplantate wurden in Websites von T3 komplette Durchtrennung, zwei Wochen nach Verletzungen des Rückenmarks platziert. Diese transplantierten Zellen konsequent gefüllt vollständige Durchtrennung Standorten und in reichlich Neuronen, die eine große Anzahl von Axonen in Wirtsrückenmark über lange Distanzen 18 verlängert differenziert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit kultivierten humanen neuralen Stammzelltransplantate zur Immun-Mangelratten 18 erhalten.
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Protocol
Alle Tier Protokolle werden von VA-San Diego Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. NIH-Richtlinien für Labortierhaltung und Sicherheit strikt befolgen. Tiere haben freien Zugang zu Futter und Wasser während der gesamten Studie und angemessen zur Minimierung Schmerzen und Beschwerden behandelt.
1. Herstellung von Fibrin Komponenten mit Wachstumsfaktor-Cocktails
- Lösen Sie 25 mg Fibrinogen Ratte in 0,5 ml PBS auf 50 mg / ml 2x Stammlösung zu erhalten (siehe Materialien Tabelle). Fibrinogen ist schwierig zu lösen, und sollte in einem 37 ° C Brutschrank oder Wasserbad gestellt und geschüttelt alle 5-10 min für 1-2 Stunden werden.
- Lösen 100 UN Ratte Thrombin in 2 ml 10 mM CaCl sterile 2 bis 50 U / ml 2x Stammlösung zu erhalten.
- Lösen Wachstumsfaktoren in PBS in den folgenden Konzentrationen zu 100 ul Stammlösung: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (hohe Konzentration Lager intrathekale Infusion in vivo
- Lösen Sie 25 mg MDL28170 (Calpain-Inhibitor) in 1,3 ml DMSO auf 50 mM DMSO-Stammlösung zu erhalten, und dann verdünnen 50x in PBS auf 1 mM Stammlösung zu erhalten.
- Mischen Sie 100 ul jeder Wachstumsfaktor-Komponente und 100 ul MDL28170 (1 mM Stammlösung) zu 1.000 ul Wachstumsfaktor-Cocktail-Lösung (Abbildung 1) zu produzieren.
- Mischen Sie 500 ul Fibrinogen 2x Stammlösung mit 500 ul Wachstumsfaktor-Cocktail bis 25 mg / ml Fibrinogen Arbeitslösung bei -70 ° C zu erhalten, Wachstumsfaktoren enthält und Teilmenge in 10 oder 20 ul für die Lagerung Die Lösung wird bei -70 ° C für bis zu 12 Monate stabil
- Ebenso mischen 500 ul Thrombin 2x Stammlösung mit 500 ul Wachstumsfaktor-Cocktail bis 25 U / ml Thrombin Arbeitslösung zu erhalten, Wachstumsfaktoren enthält, und in aliquoten ähnliche 10 oder 20 ul Volumen für die Lagerung eint -70 ° C für bis zu 12 Monate.
- Am Tag der Transplantation stellen Fibrinogen-und Thrombin-haltigen Wachstumsfaktor Cocktails auf Eis, bis mit Zellen gemischt.
2. T3 Spinal Cord Trennung
- Anesthetize erwachsenen weiblichen Fischer 344 Ratten oder athymischer Ratten mit akzeptablen Methoden. Themen sind tief anästhesiert, als Reaktion auf Schwanz und Pfote Prise fehlen völlig. Anmerkung: Wir verwenden typischerweise 150-200 g Fischer Ratten oder athymischen Ratten 180-220 g und einen Anästhesie-Cocktail (2 ml / kg) von Ketamin (25 mg / ml), Xylazin (1,3 mg / ml) und Acepromazin (0,25 mg / ml).
- Bewerben Augensalbe zur Trockene Augen oder Verletzungen zu verhindern, während die Tiere in der Anästhesie.
- Rasieren Sie den oberen Brustbereich und reinigen Sie die Haut mit Betadine.
- Schneiden Sie die Haut und Muskeln mit # 15 Klinge, aussetzen T3 Wirbel mit einer Wund-Spreizer, und führen Sie eine Laminektomie bei T3 Wirbel zu entlarven T3 / 4 Rückenmark mit einer Zange.
- Machen Sie eine longitudinal Mittellinienschnitt in der Dura von etwa 2 mm Länge unter Verwendung einer # 11 Klinge.
- Zeigen Iridektomie Schere unter der Dura, um den rechten Seiten gesamte Rückenmark geschnitten. Machen Sie eine weitere Schnitt auf der gleichen Seite 1,5 mm mehr cadually.
- Saugen Sie Rückenmarksgewebe zwischen den beiden Segmenten geschnitten mit einer stumpfen Nadel 23 G bis mäßiger Intensität Vakuum verbunden. Verwenden Sie visuelle Überprüfung, um eine vollständige Durchtrennung ventral und seitlich zu gewährleisten. Dies wird eine seitliche Hemisektion abzuschließen.
- Um die Läsion zu einer vollbreiten Durchtrennung des Rückenmarks erstrecken, legen Spiegel Einschnitte in die linke hemicord. Versuchen Sie, die Dura intakt lassen, außer dem ersten Schnitt, um die Firma Graft / Fibrin-Matrix in der Läsion, wenn gepfropft zwei Wochen später erhalten.
- Naht der Muskel, gelten Antibiotika-Pulver und heften Sie die Haut.
- Inject Ringer-Laktat-(3 ml), Bannamine (2,5-5 mg / kg) und Ampicillin (80-100 mg / kg) (siehe Materialien Tabelle) unmittelbar nach der Operation und maintain Ratten in einem warmen Inkubator, bis der Thermoregulation wieder hergestellt.
- Entleeren Sie die Blase und spritzen die Ringer-Lösung und Ampicillin zweimal am Tag für etwa zwei Wochen, bis die Einrichtung von Blasenentleerungsreflex (Abbildung 1B).
3. Vorbereitung der frisch gewonnenen embryonalen Tag 14 Spinal Cord Neural Stem Cells
- Erhalten Inzucht transgenen GFP-F344-Ratten (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) aus Ratten-Ressourcen-und Research Center, University of Missouri.
- Inject 40 ug des-Gly 10, [D-Ala 6]-Leuteinizing Hormone Releasing Hormone ethylamid (LHRH) in PBS in einer Konzentration von 200 ug / ml intraperitoneal (IP) pro reifen weiblichen Ratten (8 Wochen oder älter) nach 2 verdünnt -3 Stunden Licht Induktion zur Synchronisation von Embryo-Entnahme.
- Kamerad mit einer reifen GFP homozygot oder heterozygot männlichen Ratten über Nacht 4 Tage nach der Injektion.
- Sammeln Embryonen an den Tagen 13,5-14,5 postcoitus(Pc) in kaltem HBSS-Puffer, untersuchen GFP-Expression unter einer "Nightsea" Taschenlampe und Filtergläser (BLS1 - Bluestar-Taschenlampe und Modell VG1 und Sperrfilter) oder einem Fluoreszenzmikroskop.
- Dissect Rückenmark aseptisch aus jedem GFP-positiven Fötus und zu entfernen, die über Hirnhaut und Rücken angebracht Ganglien mit Iridektomie Schere und Pinzette Juweliere.
- Sammeln Sie die seziert Rückenmark in 2 ml kaltem HBSS-Puffer in einem 15 ml Cornical Rohr und auf Eis zu halten.
- Folgen Referenz # 20 bis seziert Rückenmark distanzieren:
- Kurz gesagt, 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA auf die Röhrchen mit seziert Rückenmark (mehrere Kabel können zusammen verdaut werden, ein Kabel kann genügend Zellen für Transplantat von einem Thema erzeugen) und zu verdauen bei 37 ° C für 10-12 min.
- Stoppen der Reaktion durch Zugabe von Trypsin 10 ml DMEM mit 10% FBS auf das Rohr und das Gewebe Zentrifuge bei 2500 rpm für 2 min.
- Resuspendieren Gewebe in 2 ml Neurobasalmedium Containing 2% B27 und verreiben Sie die Rückenmarksgewebe mit immer kleiner feuerpolierten Pasteur Pipetten.
- Zentrifugation der Zellen bei 2500 rpm für 2 min, resuspendieren in 2 ml Neurobasalmedium B27 enthalten, und Filterzellen mit einer 40 &mgr; m Zellfilter Sieb.
- Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer und teilen die Zellen gleichmäßig in zwei Eppendorf-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen und Überstand vollständig entfernen (1-2 min sind erforderlich, um alle Überstand mit einer niedrigen Vakuum Spitze zurückziehen), so dass die Wachstumsfaktor-Cocktails nicht durch verbleibende Überstand nach Zell Resuspension verdünnt werden.
- Resuspendieren jeder Hälfte der Zellen in der Fibrinogen bzw. Thrombin-Arbeitslösung, enthaltend Wachstumsfaktoren, jeweils in einer Konzentration von 250.000 Zellen / ul (Zellpellet zählt etwa ⅓ Endvolumen) und sie auf Eis vor der Transplantation (Fig. 1A). Beachten Sie, dass Fibrinogen kann spontan gelieren, wenn mit Zell gemischts vor der Kombination mit Thrombin an der Läsion / Transplantationsstelle; um vorzeitige Gelierung zu vermeiden, mischen Zellen in Fibrinogen unmittelbar vor der Zelltransplantation in vivo.
4. Transplantation
- Reexpose den verletzten T3 / 4 Rückenmark zwei Wochen nach Durchtrennung des Rückenmarks.
- 5 ul Fibrinogen-Zellen und 5 ul Thrombin-Zellen konnten direkt ohne erneutes Öffnen der Läsion in neun Punkten der Läsion durch Narbengewebe verschlossen und intakte Dura injiziert werden.
- Verwenden Sie eine 27 G-Nadel zu 9 Löcher auf der Oberfläche des Narbengewebes und intakte Dura 1-2 Wochen nach Läsion zu erstellen: 3 in der Mitte (in einem mittleren Punkt und zwei seitlichen und Abstand voneinander 0,5 mm) und 3 in beiden rostralen und 3 im kaudalen-Schnittstelle (etwa 0,5 mm rostral und kaudal vom Zentrum der Läsion).
- Dann spritzen die Hälfte des Volumens von Fibrinogen Zell-Lösung in drei zentralen Punkten der Läsion und einem Viertel Volumen in 3 Punkten des rostralen Schnittstelle und aquarter Volumen in 3 Punkten von der Schwanz Schnittstelle.
- Dann sofort injizieren throbmbin Zellen in den gleichen Stellen. Die Mischung von Fibrinogen und Thrombin-Zellen Zellen in der Läsion wird Fibrin-Gel, um Zellen in Läsion halten zu bilden und die Wachstumsfaktor-Cocktails wird das Überleben der Zellen zu unterstützen. Die Zellen werden mit Hilfe gezogen Glaspipetten auf einen Picospritzer (General Ventil, Inc.) verbunden injiziert.
- Transplantation kultivierter menschlicher NSC 21 in dem oben beschriebenen gleichen Verfahren und mit Fibrin-und Wachstumsfaktor-Cocktail aus humanen Reagenzien hergestellt.
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Representative Results
GFP immunhistologische Markierung zeigt, dass die aufgepfropften Ratte NSCs in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (fehlt ein Fibrin-Matrix und Wachstumsfaktoren) resuspendiert schlecht überlebt in der T3 Trennung Ort, nur Befestigung an der Läsion / Host-Marge und verlassen die meisten der Läsion leer ohne transplantierten Zellen (Fig. 2A). Das Überleben der NSC verbessert, wenn mit Fibrin-Matrices allein cogepfropften, aber das Transplantat nicht vollständig füllen einen großen Läsion Hohlraum (Daten nicht gezeigt). Deshalb haben wir NSCs eingebettet in Fibrin Matrizen mit Wachstumsfaktor-Cocktails, um ihr Überleben zu verbessern, Füllen von großen Hohlräumen Läsion und Differenzierung in Neurone und Gliazellen nach einer Rückenmarksdurchtrennung 15-17. Grafts entweder Ratte oder des Menschen NSCs die Läsion Hohlraum konsequent und vollständig zu füllen, wenn beurteilt 7 Wochen nach der Transplantation 18 (2B-C).
Wir haben eine Zeitverlaufsstudie zu früh prüfenÜberleben und Füllen des Hohlraums Läsion nach der Transplantation von NSC in Fibrin-Matrices mit Wachstumsfaktor Cocktails eingebettet. Die histologische Analyse zeigte, dass GFP NSC lebt auch 24 h nach der Transplantation (Fig. 3A-B). Die veredelten NSCs wurde allmählich dichter über die Zeit, um die durchtrennten Läsion Hohlraum vollständig auszufüllen von der ersten Woche nach der Transplantation wahrscheinlich durch Proliferation 21 (3C-H). Darüber hinaus integriert gepfropft NSCs auch an der Gast / Läsion Schnittstelle und schien Regionen der GFAP-Immunreaktivität an den Rändern der Läsion Hohlraum (Abbildung 3) zu reduzieren.
Ein Teil der gepfropft NSCs differenziert sieben Wochen nach der Transplantation (Fig. 4A-B) in NeuN-exprimierenden Neuronen. Darüber hinaus erweitert Transplantat stammRückenMarksNeuronen große Zahl der Axone in die Wirtsrückenmark in beiden Richtungen rostral und kaudal über lange Distanzen 18 < / Sup> (4C). Gepfropfte abgeleitet Axone rostral und kaudal sowohl durch weißen Substanz und grauen Substanz in der Host-Rückenmarks (Abb. 4D-E) erweitert.
Abbildung 1. Versuchsplan und Time Line. A) Schematische Darstellung von Popovich 22 (Cell, 2012) veranschaulicht angepasst Transplantation von neuralen Stammzellen mit Fibrin-Gel mit Wachstumsfaktor-Cocktail in völlig durchtrennten Rückenmarks. B) Versuchszeitlinie. Verhaltens-und electriophysiological Analysen können nach der Zelltransplantation und vor der Durchblutung durchgeführt werden. Die Überlebenszeit der Patienten kann variabel sein. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
.. Abbildung 2 Überleben und Abfüllung von Neural Stem Cell Grafts in T3 komplette Durchtrennung Seiten GFP und GFAP Fluoreszenzimmunmarkierung in horizontalen Abschnitten zeigt (A) schlechten Überlebensraten von Ratten E14 NSCs (grün) in PBS resuspendiert fehlen Wachstumsfaktoren und Fibrin-Matrix; BC) Ausgezeichnet Überleben und vollständige Füllung des Hohlraums Läsion, wenn (B) Ratten-oder (C) wurden in menschlichen NSC Fibrin-Matrices enthalten, Wachstumsfaktor-Cocktail eingebettet. Die Zellen wurden in T3 Trennung Websites 7 Wochen gepfropft. Maßstabsbalken, 310 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 3. Transplantatüberleben zu frühen Zeitpunkten. AB) GFP und GFAP Doppelimmunmarkierung zeigen das Überleben und die Verbreitung von aufgepfropften Ratte NSCs in der Durchtrennung Ort, 1 Tag nach der Implantation in einer Fibrin-Matrix. Boxed-Bereich in A wird bei höherer Vergrößerung in Feld B CD) Zellüberleben und die Verteilung dargestellt zeigt sich auch an Tag 2 und (EF) 3. Tag nach der Transplantation. GH) Mit 7 Tage Zellen füllen Läsion und sind dichter. Maßstabsbalken: A, C, E, G, 300 um; B, D, F, H, 62 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 4. Differenzierung und Auswuchs von Neural Stem Zelltransplantate in T3 komplette Durchtrennung der Website. AB) GFP und NeuN Kennzeichnung bestätigen umfangreiche neuronale Differenzierung / Reifung von aufgepfropften Ratte neuralen Stammzellen 7 Wochen nach der Transplantation. C) GFP und NeuN Immunmarkierung zeigt, dass die GFP-exprimierenden neuronalen Stammzelltransplantate verlängern viele Axone in die Wirtsrückenmark und rostral kaudal der Durchtrennung der Unterkunft (Schwanz gezeigt), zwei Wochen nach der Transplantation. DE) Höhere Vergrößerung von boxed Bereichen der Tafel C zeigen, dass weite Gebiete des Gastrückenmark enthalten Transplantat stamm axonalen Projektionen sowohl in der weißen Substanz und grauen Substanz. Maßstabsbalken: AB, 62 um; C 700 um; DE, 62 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Eine der wichtigsten Hürden für die NSC-Transplantation in das verletzte Rückenmark ist schlecht Überleben in der Läsion entfernt. Alle Lücken oder Hohlräume in der Läsion möglicherweise reduzieren oder zu schwächen, die Bildung von neuronalen Funktionsrelais zwischen supraspinalen Axonen und getrennten Rückenmarksegmente unterhalb der Verletzung. Darüber hinaus kann der schlechten Überlebens gepfropft NSCs ihre Integration mit dem Wirtsgewebe beeinflussen und somit zu reduzieren Konnektivität gepfropft Neuronen mit Host Neuronen. Potenzielle Mechanismen zur Zellverlust zu erklären sind, die zytotoxische Umwelt durch akuten SCI, sekundäre Degeneration der Gastgeber Rückenmark, und eine unzureichende Durchblutung des verletzten Bereich 4.
Fibrin wurde verwendet, um Zellen, Arzneimittel und Wachstumsfaktoren in verschiedenen Versuchsmodellen und klinischen Anwendungen zu liefern, da sie Zellen und Moleküle zurückzuhalten, wenn es polymerisiert wird 23. Eine frühere Studie zeigte, dass die menschliche Fibrinkleberkann als Biomatrix zu axonalen Regeneration in der subtotal trennten Rückenmarks erhöhen, ohne nachweisbare schädliche Wirkungen hervorrufen 24 dienen. Wir bisher verwendeten Fibrin-Matrices zu Stromazellen des Knochenmarks für die Transplantation in der chronisch verletzte Rückenmark 17 einbinden. Transplantierten Zellen überlebten auch in der chronischen Läsion und integriert gut mit Host-Rückenmarks Parenchym 17. Daher verlängert sich die Verwendung von Fibrin um NSCs für die Transplantation in großen offenen Stellen in der Läsion des Rückenmarks durchtrennt einbinden. Obwohl die Überlebensrate von aufgepfropften NSCs verbessert mit Fibrin, das Überleben der aufgepfropften NSCs blieb etwas variabel und gepfropft NSCs selten ganz große Läsion Hohlraum gefüllt.
Deshalb wurden ein Cocktail von Wachstumsfaktoren in dem Bemühen, das Überleben und die Proliferation von NSC in der Läsion zu erhöhen. Wachstumsfaktoren wurden in zahlreichen Studien gezeigt, dass NSCs in vitro 25 unterstützen. While die Zugabe von Wachstumsfaktoren, die Kulturen von NSCs können ihr Schicksal zu ändern, haben wir nicht erkennen, qualitativ scheinbare Änderung der neuronalen Dichte als Wachstumsfaktor-Cocktails auf das Transplantat im Vergleich zu jenen teilweise überlebt Transplantat ohne Wachstumsfaktoren aufgenommen. Eine genauere Analyse ist notwendig, bevor wir mit Sicherheit den Einfluss von Wachstumsfaktor-Cocktails auf das Schicksal der Zelle zu schätzen wissen. Während des normalen neuralen Entwicklung, das Überleben und das Wachstum von Neuronen abhängig von neurotrophen Faktoren, die oft von Zielgewebe Führungs axonalen Wachstums freigesetzt werden und in einigen Fällen beeinflussen das Überleben von Neuronen 26.
Ähnliche, aber einfachere Wachstumsfaktor Cocktails wurden von anderen Gruppen verwendet worden, um das Überleben und die Differenzierung von NSC in vitro und in vivo 15,16 erhöhen. Diese Bemühungen wurden in der Regel in weniger umfangreich als die Überlebens NSC mehrere Faktor Ansatz, den wir angenommen haben geführt. Eine wesentliche nächste Schritt in dieser EntwicklungBemühungen ist es, die Liste einzugrenzen von Wachstumsfaktoren in der Cocktail, die wesentlich für das Überleben NSC, eine Anstrengung, die im Gange ist, zu unterstützen. Es ist durchaus möglich, dass eine begrenzte Anzahl von Wachstumsfaktoren gleich Grade Transplantatüberleben, die Feststellung, das diesen experimentellen Ansatz und seine möglichen Übersetzung in Humanstudien vereinfachen würde zu unterstützen.
Neben der Verwendung von Fibrin-Matrices und Wachstumsfaktor-Cocktail kann der Erfolg der Transplantation in vivo der schweren Läsion auf mechanische Faktoren in der Läsion ab. Wir unternehmen alle Anstrengungen, um die Integrität der extrem dünne Membran, die die Dura Nagetier Rückenmark nach Verletzungen und Transplantation, in dem Bemühen, transplantierten Zellen mechanisch behalten in der Läsion liegt über aufrecht zu erhalten. So stellen wir eine sorgfältige und gewissenhafte Bemühungen um einheitliche Zellenfüllung der Läsion Website zu optimieren. Ohne diese mehrere Bemühungen ist Transplantat Füllung unvollständig. Diese Techniken erfordern umfangreiche praktischece.
Bei dem Versuch, diese Technik, um andere zu lehren, haben wir einige Herausforderungen identifiziert. Wenn Zellen in den Wirt Rückenmark statt der Läsion Hohlraum eingespritzt wird, dann vorzugsweise in Zellen Glia differenzieren. In diesem Fall wird die Anzahl der Schwellen Axone stark reduziert. Wenn große Sorgfalt und Gewissenhaftigkeit sind nicht gemacht, um die Läsion Hohlraum zu füllen mit den mehreren Techniken und Herangehensweisen in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben, ist das Überleben der Zelle weniger konsistent und biologischen Reaktionen, darunter Axon Auswuchs, sind begrenzt. Daher ist es wichtig, viel Zeit, Sorgfalt und akribische Technik widmen, diese Methoden erfolgreich zu nutzen. Sobald die Techniken gewonnen werden, sind die Ergebnisse sehr konsistent von Tier zu Tier, wodurch die Möglichkeit, die bemerkenswerte biologische Eigenschaften dieser NSC im zentralen Nervensystem Läsionsstellen studieren.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken dem Rat Ressourcen-und Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, für die Bereitstellung von GFP Ratten; Neuralstem Inc. für die Bereitstellung von humanen neuralen Stammzellen. Diese Arbeit wurde von der Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, The Craig H. Neilsen-Stiftung und der Bernard und Anne Spitzer Charitable Trust unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
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