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Neuroscience

Promoción de la supervivencia y la diferenciación de células madre neurales con fibrina y factor de crecimiento cócteles después de la médula espinal severa lesión

Published: July 27, 2014 doi: 10.3791/50641
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1,2
1Veterans Administration Medical Center, San Diego, 2Department of Neurosciences, University of California, San Diego

Summary

Matrices de fibrina que contienen factores de crecimiento se utilizaron para conservar las células madre neurales injertadas en los sitios de la transección completa de la médula espinal. Células injertadas llenaron completamente la cavidad de la lesión y diferenciarse en múltiples tipos de células neuronales, incluyendo las neuronas que se extendían axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias.

Abstract

Las células madre neurales (NSC) pueden auto-renovarse y diferenciarse en neuronas y células gliales. NSCs trasplantados pueden reemplazar las neuronas perdidas y glía después de la lesión de la médula espinal (SCI), y pueden formar relés funcionales para volver a conectar los segmentos de la médula espinal por encima y por debajo de la lesión. Estudios previos de injerto de las células madre neurales han sido limitados por incompleta la supervivencia del injerto dentro de la cavidad de la lesión de la médula espinal. Además, el seguimiento de la supervivencia de las células del injerto, la diferenciación, y la extensión proceso no había sido optimizada. Finalmente, en estudios previos, se registraron típicamente NSC de rata en cultivo para diferenciarse en glía cuando injertado a la médula espinal lesionada, en lugar de las neuronas, a menos que el destino se debió a un tipo específico de célula. Para abordar estas cuestiones, hemos desarrollado nuevos métodos para mejorar la supervivencia, la integración y la diferenciación de NSC a sitios de incluso severa SCI. NSC estaban recién aisladas de embriones día 14 la médula espinal (E14) desde una línea transgénica de ratas Fischer 344 estable que expresa fl verdeproteína uorescente (GFP) y se incrusta dentro de una matriz de fibrina que contiene factores de crecimiento; esta formulación destinada a conservar las células injertadas en la cavidad de la lesión y apoyar la supervivencia celular. NSCs en el cóctel factor de fibrina / crecimiento se implantaron dos semanas después torácica nivel 3 (T3) completos transección de la médula espinal, lo que evita los períodos pico de la inflamación. Injertos resultantes llenan completamente la cavidad de la lesión y se diferenciaron en neuronas tanto, que se extendían los axones en el huésped de la médula espinal sobre notablemente largas distancias, y glía. Los injertos de NSCs humanos cultivados que expresan GFP produjeron resultados similares. Por lo tanto, los métodos se definen para la mejora de injerto neural de células madre, la supervivencia y el análisis de los resultados in vivo.

Introduction

Lesión de la médula espinal (SCI) a menudo daños no sólo tractos de sustancia blanca que llevan señales desde y hacia el cerebro, sino también la materia gris central, causando la pérdida segmentaria de interneuronas y las neuronas motoras. La consecuencia de la lesión medular es la pérdida de tanto la función motora y sensorial por debajo de la lesión. Desafortunadamente, el sistema nervioso central adulto (SNC) no espontáneamente a regenerar, dando como resultado déficits funcionales permanentes 1. Por lo tanto, la reconstrucción de la lesionada médula espinal adulta y la mejora de motor, sensorial y la función autonómica es un objetivo importante de la investigación de SCI. Las células madre neurales (NSC), ya sea directamente aislada de embrionarias o adultas del SNC, son células candidatos de peso para reemplazar las neuronas perdidas y glía. Por otra parte, estas células tienen el potencial para formar nuevos enlaces funcionales para restaurar la conducción axonal a través de un 2,3 sitio de la lesión.

Hasta la fecha, no ha habido una elucidación detallada de la anatómica, electrophysiológica y efectos en el comportamiento de la formación de relé neuronal por NSCs trasplantados después severa SCI. Hay varias razones para esto: primero, NSCs trasplantados o tejido fetal CNS sobrevivir mal cuando se injertan en grandes cavidades de la lesión. Estudios previos muestran una pérdida sustancial de células temprano, dejando grandes cavidades lesión quística vacías 4,5. En algunos estudios, las células injertadas serían posteriormente se dividen y se llenan la cavidad de la lesión de 4,5, pero esto puede ocurrir después de un retraso de días o semanas, y posterior llenado sitio de la lesión podría no ser completa o coherente. En segundo lugar, un sistema de seguimiento eficaz que proporciona datos fiables sobre la supervivencia celular, la diferenciación / maduración, y el crecimiento de NSCs trasplantados era deficiente. La mayoría de los estudios iniciales utilizados anterógrada y retrógrada etiquetado para rastrear las proyecciones axonales de trasplantes de 2,3. Sin embargo, estas técnicas sólo parcialmente y, a menudo proyecciones axonales poco clara etiquetados derivados de células injertadas, y métodos de trazadores son subjetivost de artefactos causados ​​por fugas de tinte más allá de las células implantadas. Otros grupos utilizan marcadores neuronales específicos humanos para etiquetar las proyecciones axonales después del trasplante de NSC fetales humanos en roedores lesionada de la médula espinal 5,6. Sin embargo, en estos estudios, los xenoinjertos no sobrevivieron consistentemente bien. Recientemente, se utilizó la entrega viral del gen reportero GFP para etiquetar NSC cultivadas 7,8. Sin embargo, la expresión de GFP fue a menudo incoherente y puede ser regulado a la baja 7. Recientemente, el uso de ratones donantes transgénicas o ratas de forma estable que expresan el gen reportero, GFP, o la fosfatasa alcalina de placenta humana, ha mejorado espectacularmente el seguimiento de los trasplantados neurales células madre / progenitoras in vivo 9,11. En tercer lugar, varios estudios indican que in vitro NSCs rata cultivadas derivadas de cualquiera embrionarias o adultas del SNC se diferencian exclusivamente en linajes gliales cuando se trasplantan en el medio de la cor espinal adulta intacta o lesionadad 7,12,13, a pesar del hecho de que estas células madre neurales son capaces de diferenciarse en neuronas y glía tanto in vitro, lo que indica que los entornos locales pueden dictar el destino de las células madre. Alternativamente, NSC cultivadas, especialmente los derivados de SNC adulto, pueden tener propiedad intrínseca defaulty de diferenciarse en linajes gliales in vivo 13.

Debido a las limitaciones mencionadas anteriormente, nuestro grupo ha desarrollado recientemente un nuevo protocolo para mejorar embrionario seguimiento NSC, la supervivencia y la diferenciación / maduración en el adulto con lesiones graves de la médula espinal. En pocas palabras, empezamos con una línea transgénica Fischer 344 ratas inbreed estable que expresa un gen reportero GFP que sustenta la expresión de GFP después in vivo del trasplante 14. A continuación, se utilizó NSC recién aisladas de día embrionario 14 Fischer 344 de la médula espinal, una etapa de desarrollo que conserva el potencial de generar ambas neuronas y glía. Finalmente, inmersosNSCs recién disociadas en una matriz de fibrina que contiene factores de crecimiento 15-17 para retener las células y distribuir uniformemente dentro de una gran cavidad de la lesión, con el objetivo de apoyar la supervivencia de las células del injerto, la diferenciación y la integración. Los injertos se colocan en sitios de T3 transección completa, dos semanas después de la lesión de la médula espinal. Estas células injertadas llenan constantemente sitios transección completa y diferenciarse en neuronas abundantes que se extendía un gran número de axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias 18. Se obtuvieron resultados similares usando cultivadas injertos de células madre neurales humanas a inmunodeficientes ratas 18.

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Protocol

Todos los animales protocolos sean aprobados por VA-San Diego Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). Directrices del NIH para el cuidado de animales de laboratorio y seguridad se siguen estrictamente. Los animales tienen acceso libre a comida y agua durante todo el estudio y se tratan de forma adecuada para reducir al mínimo el dolor y el malestar.

1. Preparación de fibrina componentes que contiene el factor de crecimiento Cocktails

  1. Disolver 25 mg de fibrinógeno de rata en 0,5 ml de PBS para obtener 50 mg / ml de solución madre 2x (ver tabla de Materiales). El fibrinógeno es difícil de disolver y se debe colocar en un 37 ° C incubadora o baño de agua y se agita cada 5-10 minutos durante 1-2 horas.
  2. Disolver 100 trombina rata de la ONU en 2 ml de 10 mM estéril de CaCl2 para obtener 50 U ml 2x solución / acción.
  3. Disolver los factores de crecimiento en PBS a las siguientes concentraciones para obtener una solución de 100 l existencia: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (alta concentración de valores como la infusión intratecal in vivo
  4. Disolver 25 mg MDL28170 (inhibidor de la calpaína) en 1,3 ml de DMSO para obtener 50 mM solución madre de DMSO y luego se diluye 50 veces en PBS para obtener 1 mM solución madre.
  5. Mezclar 100 l de cada componente de factor de crecimiento y 100 l de MDL28170 (solución madre 1 mM) para producir 1000 l solución de factor de crecimiento de cóctel (Figura 1).
  6. Mezclar 500 solución de fibrinógeno l 2x con 500 l de crecimiento factor de cóctel para obtener una solución de 25 mg / ml de fibrinógeno de trabajo que contiene factores de crecimiento y alícuota en 10 o 20 l para el almacenamiento a -70 ° C. La solución es estable durante un máximo de 12 meses a -70 ° C.
  7. Del mismo modo, mezclar 500 l de trombina solución 2x ​​acción con 500 l de cóctel del factor de crecimiento para obtener la solución de trabajo 25 U / ml de trombina que contiene factores de crecimiento y alícuota en volúmenes de 10 o 20 l similares para el almacenamiento de unt -70 ° C durante un máximo de 12 meses.
  8. En el día del injerto, colocar cócteles de fibrinógeno y del factor de crecimiento que contiene trombina en hielo hasta que se mezcla con las células.

2. T3 Spinal Cord transección

  1. Anestesie hembra adulta Fischer 344 ratas o ratones atímicos usando métodos aceptables. Los sujetos son profundamente anestesiados, cuando la capacidad de respuesta a la cola y la pata pizca están completamente ausentes. Nota: Utilizamos típicamente 150-200 g ratas Fischer o 180-220 g ratas atímicos, y un cóctel de anestesia (2 ml / kg) de ketamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / ml) y acepromazina (0,25 mg / ml).
  2. Aplicar pomada para los ojos para evitar la sequedad o lesiones de los ojos de los animales mientras están bajo anestesia.
  3. Afeitar el área torácica superior y limpie la piel con Betadine.
  4. Cortar la piel y el músculo con el n º 15 blade, exponer vértebra T3 usando un retractor quirúrgico, y realizar una laminectomía en T3 vértebras para exponer T3 / 4 de la médula espinal usando una gubia.
  5. Hacer una lonincisión longitudinal en la duramadre de aproximadamente 2 mm de largo con una cuchilla # 11.
  6. Coloque iridectomía tijeras debajo de la duramadre para cortar el lateral derecho de toda la médula espinal. Haga otro corte en el mismo lado 1,5 mm más cadually.
  7. Aspirar el tejido de la médula espinal entre los dos segmentos de corte con un objeto contundente 23 G aguja conectada a vacío intensidad moderada. Utilice la verificación visual para garantizar la transección completa ventral y lateral. Esto completará una hemisección lateral.
  8. Para extender la lesión a una transección de la médula espinal de ancho completo, coloque incisiones espejo en el hemicord izquierda. Intento de salir de la duramadre intacta, que no sea el primer corte, para retener la matriz de injerto / fibrina firme en el sitio de la lesión cuando se injertan dos semanas más tarde.
  9. Sutura del músculo, aplique polvo antibiótico y de primera necesidad de la piel.
  10. Inyectar lactato (3 ml) de Ringer, Bannamine (2,5-5 mg / kg) y ampicilina (80-100 mg / kg) (véase el cuadro Materiales) inmediatamente después de la cirugía y mairatas ntain en una incubadora caliente hasta que se restablezca la termorregulación.
  11. Vacíe la vejiga e inyectar la solución de Ringer y Ampicilina dos veces al día durante dos semanas, hasta el establecimiento de la vejiga reflejo de vaciado (Figura 1B).

3. Preparación de recién disociada día embrionario 14 Médula Espinal Neural Stem Cells

  1. Obtener puras de maíz transgénicos ratas F344 GFP (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) de Recursos rata y el Centro de Investigación, Universidad de Missouri.
  2. Inyectar 40 mg des-Gly 10, [D-Ala 6]-hormona luteinizante liberadora de hormona de etilamida (LHRH) diluido en PBS a una concentración de 200 mg / ml, por vía intraperitoneal (IP) por rata hembra madura (8 semanas de edad o más) después de 2 hr -3 inducción luz para la sincronización de recogida de embriones.
  3. Aparearse con un maduro GFP homocigotos o heterocigotos noche rata macho de 4 días después de la inyección.
  4. Recoger los embriones en día 13,5-14,5 postcoitus(PC) en tampón HBSS frío, examinar la expresión de GFP bajo unas gafas de sol "NightSea" linterna y filtros (BLS1 - BlueStar Linterna y Modelo VG1 filtro barrera) o un microscopio de fluorescencia.
  5. Diseccionar la médula espinal a cabo asépticamente de cada feto GFP-positivas y eliminar las meninges que recubren y ganglios espinales adjunto con tijeras de iridectomía y joyeros pinzas finas.
  6. Recoge las médulas espinales diseccionadas en 2 ml de tampón HBSS frío en un tubo de 15 ml cornical y mantener en hielo.
  7. Siga referencia # 20 de disociar de médulas espinales diseccionadas:
    1. Brevemente, añadir 2 ml de 0,25% de tripsina-EDTA al tubo que contiene de médulas espinales diseccionadas (varios cables pueden ser digeridos juntos, 1 cable puede generar suficientes células para injerto de un sujeto) y digerir a 37 ° C durante 10-12 min.
    2. Detener la reacción con tripsina por la adición de 10 ml de DMEM que contiene 10% de FBS al tubo y se centrifuga el tejido a 2.500 rpm durante 2 min.
    3. Resuspender el tejido en 2 ml de medio de co Neurobasalntaining 2% B27, y triturar el tejido de la médula espinal usando cada vez más pequeñas pipetas Pasteur pulidas al fuego.
    4. Centrifugar las células a 2500 rpm durante 2 min, se resuspende en 2 ml de medio Neurobasal conteniendo B27, y las células de filtro con un filtro de células colador de 40 micras.
  8. Contar las células con un hemocitómetro y dividir las células por igual en dos tubos Eppendorf.
  9. Centrifugar las células y eliminar completamente el sobrenadante (1-2 min tienen la obligación de retirar todo el sobrenadante con una punta baja de vacío) para los cócteles del factor de crecimiento no se diluirán permaneciendo sobrenadante después de la resuspensión celular.
  10. Resuspender cada medio de las células en el fibrinógeno o la solución de trabajo de trombina que contiene factores de crecimiento, respectivamente, a una concentración de 250.000 células / l (recuentos sedimento celular durante aproximadamente ⅓ volumen final) y colocarlos en hielo antes del trasplante (Figura 1A). Tenga en cuenta que el fibrinógeno puede cuajar de forma espontánea cuando se mezclan con célulass antes de combinar con la trombina en el sitio de la lesión / injerto; para evitar la gelificación prematura, mezclar las células en fibrinógeno inmediatamente antes del injerto de células in vivo.

4. Trasplante

  1. Reexpose el lesionado T3 / 4 de la médula espinal dos semanas después de la transección de la médula espinal.
  2. 5 l de fibrinógeno células y 5 trombina células mu l podrían ser inyectadas directamente en nueve puntos de la zona de la lesión a través del tejido de la cicatriz sellado y la duramadre intacta sin volver a abrir el sitio de la lesión.
  3. Utilice una aguja 27 para crear 9 agujeros en la superficie del tejido de la cicatriz y la duramadre intacta 1-2 semanas después de la lesión: 3 en el centro (uno en el punto medio y dos en los laterales, y espaciados 0,5 mm entre sí) y 3 en tanto rostral y 3 en la interfaz de caudal (aproximadamente 0,5 mm rostral o caudal al centro de la lesión).
  4. Se inyecta un medio volumen de solución de células fibrinógeno en tres puntos centrales de la zona de la lesión y un volumen de moneda en 3 puntos de la interfaz rostral y aqvolumen uarter en 3 puntos de la interfaz de caudal.
  5. A continuación, inyecte inmediatamente células throbmbin en los mismos lugares. La mezcla de células de fibrinógeno y trombina células en el interior del sitio de la lesión se formará el gel de fibrina para mantener las células en lugar de la lesión y los cócteles de factores de crecimiento apoyará la supervivencia de las células. Las células se inyectaron utilizando pipetas de vidrio tirados conectados a un Picospritzer (General de válvula, Inc.).
  6. Trasplante de NSC humanas cultivadas 21 en el mismo procedimiento descrito anteriormente, y el uso de fibrina y factor de crecimiento cócteles hechos a partir de reactivos humanos.

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Representative Results

Etiquetado inmunohistoquímico de GFP demuestra que NSC rata injertado resuspendieron en tampón fosfato salino (PBS) (que carece de una matriz de fibrina y factores de crecimiento) sobrevivido mal en el sitio de la transección T3, sólo a la fijación de margen de la lesión / anfitrión y dejando la mayor parte del sitio de la lesión vacío sin células injertadas (Figura 2A). La supervivencia de NSC mejoró cuando se co-injertado con matrices de fibrina por sí solos, pero el injerto no llenar completamente una gran cavidad de la lesión (datos no mostrados). Por lo tanto, inmersos NSC en matrices de fibrina que contienen cócteles de factores de crecimiento para mejorar su supervivencia, el llenado de grandes cavidades de la lesión y la diferenciación en neuronas y células gliales después de la transección de la médula espinal 15-17. Los injertos de cualquiera de rata o humanos NSC consistentemente y completamente llenan la cavidad de la lesión cuando se evaluó siete semanas de post-injerto 18 (Figuras 2B-C).

Se realizó un tiempo de estudio para examinar tempranala supervivencia y el llenado de la cavidad de la lesión después del injerto de NSC incrustados en matrices de fibrina con un cóctel de factores de crecimiento. El análisis histológico reveló que expresan GFP NSC sobrevivieron bien 24 horas después del trasplante (Figuras 3A-B). El NSC injertado se convirtió gradualmente más densa con el tiempo para llenar completamente la cavidad de la lesión por transección de la primera semana después del trasplante probablemente debido a la proliferación 21 (Figuras 3C-H). Además, injertado NSCs integrado bien en la interfaz de host / lesión y pareció reducir las regiones de GFAP inmunoreactividad en los márgenes de la cavidad de la lesión (Figura 3).

Una porción de NSC injertados diferenciarse en neuronas que expresan NeuN-siete semanas después del trasplante (Figuras 4A-B). Además, las neuronas de la médula espinal de injerto de derivados de extenderse un gran número de axones en el huésped de la médula espinal en ambas direcciones rostral y caudal a través de largas distancias 18 < / Sup> (Figura 4C). Axones derivados injertados extendieron rostral y caudalmente a través tanto de la sustancia blanca y sustancia gris en el huésped de la médula espinal (Figuras 4D-E).

Figura 1
Figura 1. Esquema Experimental y Time Line. A) Esquema adaptado de Popovich 22 (Cell, 2012) ilustra el trasplante de células madre neurales con gel de fibrina que contiene el factor de crecimiento de cócteles en completamente seccionado la médula espinal. B) Línea de tiempo experimental. Análisis del comportamiento y electriophysiological se pueden realizar después del injerto celular y antes de la perfusión. El tiempo de supervivencia de los sujetos puede ser variable. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

ntent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 2
.. Figura 2 La supervivencia y el llenado de Neural Stem injertos celulares en T3 Sitios completas transección GFP y GFAP inmunomarcación fluorescente en secciones horizontales demuestra (A) pobre supervivencia de rata E14 NSCs (verde) se volvió a suspender en PBS que carecen de factores de crecimiento y de la matriz de fibrina; BC) Excelente supervivencia y el llenado completo de la cavidad de la lesión cuando (B) de rata o (c) NSC humanos fueron incorporados en matrices de fibrina que contienen cócteles de factores de crecimiento. Las células se injerta en sitios transección T3 durante 7 semanas. La barra de escala, 310 micras. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 3. Injerto Supervivencia a los Puntos temprana Tiempo. AB) GFP y GFAP doble inmunomarcación espectáculo supervivencia y distribución de NSCs ratas injertadas en el sitio de la transección, 1 día después de la implantación de una matriz de fibrina. Área de caja en A se muestra a mayor aumento en el panel B. CD) La supervivencia celular y la distribución también es evidente en el día 2 y (EF) Día 3 post-injerto. GH) A los 7 días, las células se llenan lugar de la lesión y son más densos. Barra de escala: A, C, E, G, 300 m; B, D, F, H, 62 m. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4
Figura 4. Diferenciación y Crecimiento Externo of Neural SteInjertos m celulares en T3 completa transección del sitio. AB) GFP y etiquetado NeuN confirman extensa diferenciación neuronal / maduración de las células madre neuronales de rata injertado 7 semanas después del injerto. C) GFP y NeuN inmunomarcaje revela que injertos de células madre neurales que expresan GFP se extienden un gran número de axones en la médula espinal rostral anfitrión y caudal al sitio de transección (caudal se muestra), dos semanas después del injerto. DE) Un mayor aumento de las áreas en caja de panel C muestra que extensas regiones del anfitrión de la médula espinal contienen proyecciones axonales injerto derivado tanto de la sustancia blanca y sustancia gris. Barra de escala: AB, de 62 m; C, 700 m; DE, 62 micras. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

Uno de los principales obstáculos para la NSC el trasplante de la médula espinal lesionada es pobre supervivencia en el centro de la lesión. Todos los huecos o cavidades en el sitio de la lesión potencialmente podrían reducir o disminuir la formación de relés neuronales funcionales entre axones supraespinales y segmentos de la médula espinal separados por debajo de la lesión. Además, la mala supervivencia de NSCs injertadas puede afectar a su integración con el tejido del huésped, y por lo tanto reducir la conectividad de las neuronas injertadas con las neuronas receptoras. Los posibles mecanismos para explicar la pérdida de células incluyen el entorno citotóxica creado por SCI aguda, degeneración secundaria de las huestes de la médula espinal, y la vascularización insuficiente de la región lesionada 4.

La fibrina se ha utilizado para administrar células, las drogas y los factores de crecimiento en varios modelos experimentales y aplicaciones clínicas, ya que puede retener las células y las moléculas cuando se convierte en polimerizado 23. Un estudio previo demostró que el sellador de fibrina humanapuede servir como una biomatriz para mejorar la regeneración axonal en el subtotal seccionado la médula espinal sin provocar efectos adversos detectables 24. Se utilizó previamente matrices de fibrina para incrustar las células del estroma de la médula ósea para el trasplante en la médula espinal lesionada crónicamente 17. Células injertadas sobrevivieron bien en el lugar de la lesión crónica e integrados así con parénquima anfitrión de la médula espinal 17. Por lo tanto, hemos extendido el uso de fibrina para incrustar NSC para el trasplante en los grandes sitios de lesión abierta en la médula espinal seccionado. Aunque la supervivencia de NSC injertadas mejoró con la fibrina, la supervivencia de NSC injertadas se mantuvo algo variable y se injerta NSC rara vez llena completamente gran cavidad de la lesión.

Por lo tanto, hemos añadido un cóctel de factores de crecimiento en un esfuerzo para mejorar la supervivencia y la proliferación de NSC en el sitio de la lesión. Los factores de crecimiento se ha demostrado en numerosos estudios para apoyar NSC in vitro 25. While la adición de factores de crecimiento a los cultivos de NSCs puede cambiar su destino, no detectamos cualitativamente aparente cambio en la densidad neuronal cuando cócteles de factores de crecimiento añadidos al injerto comparación con los alimentados parcialmente sobrevivido injerto sin factores de crecimiento. Un análisis más detallado es necesario antes de que podamos apreciar con certeza la influencia de los cócteles de factores de crecimiento en el destino celular. Durante el desarrollo neuronal normal, la supervivencia y el crecimiento de las neuronas dependen de factores neurotróficos que a menudo son liberadas por guía tejido diana crecimiento axonal y, en algunos casos, influyen en la supervivencia neuronal 26.

Cócteles de factores de crecimiento similares pero más simples han sido utilizadas por otros grupos para mejorar la supervivencia y la diferenciación de NSC tanto in vitro como in vivo 15,16. Estos esfuerzos se han traducido en general en menos extensa supervivencia NSC que el enfoque de múltiples factores que hemos adoptado. Un paso fundamental en este desarrolloesfuerzo es reducir la lista de factores de crecimiento en el cóctel que son esenciales para apoyar NSC supervivencia, un esfuerzo que se está realizando. Es muy posible que un número más limitado de factores de crecimiento apoyará iguales grados de la supervivencia del injerto, un hallazgo que podría simplificar este enfoque experimental y su traducción potencial para los estudios en humanos.

Además de la utilización de matrices de fibrina y cócteles de factores de crecimiento, el éxito de un injerto in vivo en el sitio de la lesión severa puede depender de factores mecánicos en el sitio de la lesión. Hacemos todo lo posible para mantener la integridad de la membrana dural extremadamente delgada que recubre la médula espinal de roedores después de las lesiones y el injerto, en un esfuerzo para retener mecánicamente las células injertadas en el sitio de la lesión. Por lo tanto, hacemos esfuerzos cuidadosos y diligentes para optimizar el llenado celular consistente de la zona de la lesión. Sin estos múltiples esfuerzos, relleno de injerto es incompleta. Estas técnicas requieren extensa prácticoce.

En el intento de enseñar esta técnica a los demás, hemos identificado algunos retos. Si las células se inyectan en el anfitrión de la médula espinal en lugar de la cavidad de la lesión, a continuación, las células pueden diferenciarse preferentemente en la glía. En este caso, el número de axones emergentes se reduce en gran medida. Si el gran cuidado y diligencia no se hacen para llenar la cavidad de la lesión utilizando las múltiples técnicas y enfoques descritos en los párrafos anteriores, la supervivencia celular es menos consistente y las respuestas biológicas, incluyendo axón, son limitados. Por lo tanto, es imprescindible dedicar un tiempo considerable, la diligencia y la técnica meticulosa de utilizar con éxito estos métodos. Una vez que las técnicas son adquiridos, los resultados son muy coherentes de animal a animal, produciendo la capacidad de estudiar las propiedades biológicas notables de estos NSC en sitios de lesión del sistema nervioso central.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a la Rata de Recursos y Centro de Investigación de la Universidad de Missouri, Columbia, Missouri, para proporcionar ratas GFP; Neuralstem Inc. para proporcionar células madre neurales humanas. Este trabajo fue apoyado por la Administración de Veteranos, el NIH (NS09881), la Organización Canadiense de Investigación espinal, la Fundación Craig H. Neilsen, y Bernard y Anne Spitzer Charitable Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen (rat) Sigma F6755-25MG 2 hr at 37 °C to dissovle
Stock Concentration: 50 mg/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat) Sigma T5772-100UN Dissovle in 10 mM CaCl2
Stock Concentration: 50 U/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human) Sigma F0291 (25 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine) Sigma E1257 (0.1 mg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human) Peprotech 452-02 (1 mg) Stock Concentration: 1,000 ng/μl
Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human) Peprotech 452-03 (1 mg) Stock Concentration: 1,000 ng/μl
Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat) Sigma G1401 (10 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse) Sigma I8779 (50 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human) Sigma F5542 (25 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human) Sigma P3076 (10 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human) Sigma H9661 (5 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170 Sigma M6690 (25 mg) Stock in DMSO
Stock Concentration: 1 mM
Final Concentration: 50 μM
PBS Millipore BSS-1005-B Stock Concentration: 1x
Final Concentration: 1x
DMSO Sigma D2650
Ketamine Putney 26637-411-01 40-80 mg/kg
Stock Concentration: 100 mg/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine Lloyd 0410, 2.5-8 mg/ml
Stock Concentration: 100 mg/ml
Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine Butler 003845 0.5-4 mg/ml
Stock Concentration: 10 mg/ml
Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine Healthpets BET16OZ
Ringers Abbott 04860-04-10 2-3 ml/inj
Banamine Schering-Plough 0061-0851-03 2.5-5 mg/kg
Stock Concentration: 50 mg/ml
Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin Sandoz 0781-3404-85 80-100 mg/kg
Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH Sigma L4513 200 μg/kg
Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS Gibco 14175-096
Trypsin Gibco 25200056 Stock Concentration: 0.25 %
Final Concentration: 0.125 %
DMEM Gibco 11995073
FBS Gibco 16000044 Stock Concentration: 100 %
Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium Gibco 21103049
B27 Gibco 17504044 Stock Concentration: 100x
Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs

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Lu, P., Graham, L., Wang, Y., Wu, D., Tuszynski, M. Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (89), e50641, doi:10.3791/50641 (2014).

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