Summary
מטריצות הפיברין המכילות גורמי גדילה שימשו כדי לשמר את תאי גזע עצביים מורכבים לתוך אתרים של חיתוך רוחב חוט השדרה. תאים מורכבים מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לסוגים שונים עצבי תאים, כוללים תאי עצב שהשתרעו אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקים ארוכים.
Abstract
תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים עצמי לחדש ולהתמיין לתאי עצב וגליה. NSCs המושתל יכול להחליף את תאי עצב וגליה אבודים לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI), ויכול להיווצר ממסרים פונקציונליים להתחבר מחדש מקטעי חוט השדרה מעל ומתחת לנגע. מחקרים קודמים השתלת תאי גזע עצביים היו מוגבלים על ידי הישרדות שתל שלמה בתוך חלל נגע חוט השדרה. יתר על כן, מעקב של הישרדות תא שתל, בידול, והארכת תהליך לא היה אופטימלי. לבסוף, במחקרים קודמים, NSCs חולדה בתרבית דווחו בדרך כלל להתמיין לגליה כאשר השתיל לחוט השדרה נפגע, ולא נוירונים, אלא אם הגורל היה מונע לסוג תא מסוים. כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו שיטות חדשות לשיפור ההישרדות, האינטגרציה והבחנה של NSCs לאתרים של SCI אפילו חמור. NSCs בודדו טרי מכבל עוברי יום 14 השדרה (E14) מקו יציב מהונדס פישר 344 חולדה להביע fl הירוקחלבון uorescent (GFP) והיו משובצים למטריצת הפיברין המכילה גורמי גדילה; ניסוח זה נועד כדי לשמור על תאים מורכבים בחלל הנגע ולתמוך בהישרדות תא. NSCs בקוקטייל הפיברין / גורם הגדילה הושתלו שבועיים לאחר transections השדרה החזי מלא ברמת 3 (T3) כבל, וכך להימנע מתקופות שיא של דלקת. שתלים וכתוצאה מכך מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לשני נוירונים, שהשתרעו אקסונים אל חוט השדרה המארח על פני מרחקים ארוכים להפליא, וגליה. שתלי של NSCs אדם המתורבת להביע GFP הביאו לממצאים דומים. לכן, שיטות מוגדרות לשיפור השתלת תאי גזע עצבי, הישרדות וניתוח של ממצאי in vivo.
Introduction
פגיעה בחוט השדרה (SCI) לעתים קרובות נזקים לא רק שטחי חומר לבנים שנושאים אותות ומהמוח, אלא גם את החומר אפור המרכזי, גורמים לאובדן מגזרי של interneurons והנוירונים מוטוריים. התוצאה של SCI היא אובדן של שניהם מוטוריים ותפקוד חושי מתחת לנגע. למרבה הצער, המערכת למבוגרים העצבים המרכזית (CNS) לא באופן ספונטני להתחדש, וכתוצאה מליקויים תפקודיים קבועים 1. לכן, בנייה מחדש של כבל למבוגרים הפגועים בעמוד השדרה ושיפור במנוע, חושי ותפקוד אוטונומי היא מטרה חשובה של מחקר SCI. תאי גזע עצביים (NSCs), בין אם מבודדים ישירות ממערכת העצבים עובריים או מבוגר, הם תאי מועמד משכנעים להחליף תאי עצב וגליה לאיבוד. יתר על כן, התאים הללו הפוטנציאל להוות ממסרים פונקציונליים חדשים כדי לשחזר הולכה באקסון פני 2,3 אתר נגע.
נכון להיום, לא חלה הבהרה מפורטת של אנטומיים, electrophysiological והשפעות ההתנהגותיות של היווצרות ממסר עצבית על ידי NSCs המושתל לאחר SCI החמור. ישנן מספר סיבות לכך: ראשית, NSCs מושתל או רקמת מערכת העצבים המרכזית של העובר לשרוד בצורה גרועה כאשר השתילו לתוך חללי נגע גדולים. מחקרים קודמים הראו אובדן תא המוקדם משמעותי, ומשאיר חללים ריקים נגע גדול פיברוזיס 4,5. בחלק ממחקרי התאים המורכבים היו לאחר מכן להתחלק ולמלא את חלל נגע 4,5, אבל זה עשוי להתרחש באיחור של ימים עד שבועות, ומילוי אתר נגע שלאחר מכן לא יכול להיות שלם או עקבי. שנית, מערכת מעקב יעילה המספקת נתוני קול על הישרדות תאים, התמיינות / התבגרות, ותולדה של NSCs המושתל הייתה חסרה. רוב המחקרים המוקדמים מנוצלים antegrade ותיוג מדרדר לאתר את תחזיות axonal מהשתלות 2,3. עם זאת, טכניקות אלה באופן חלקי בלבד ולעתים קרובות תחזיות שכותרת לא ברור אקסון הנובעות מהתאים מורכבים, ושיטות נותב הן subjecלא לחפצים שנגרמו על ידי דליפה לצבוע מעבר לתאים המושתלים. קבוצות אחרות המשמשות סמנים עצביים ספציפיים אנושיים לתייג תחזיות אקסון לאחר ההשתלה של NSCs העוברי האנושי לחוט השדרה של מכרסמים נפצעו 5,6. עם זאת, במחקרים אלה, xenografts לא שרדה באופן עקבי היטב. לאחרונה, משלוח ויראלית של גן כתב ה-GFP שימש תווית NSCs התרבותי 7,8. עם זאת, הביטוי של GFP היה לעתים קרובות לא עקבי והוא יכול להיות למטה מוסדר 7. לאחרונה, השימוש בעכברים מהונדסים תורם או חולדות ביציבות להביע גן הכתב, ה-GFP, או phosphatase אלקליין השליה האנושי, שיפר באופן משמעותי את המעקב של תאי גזע / אבות עצביים מושתלים in vivo 9,11. שלישית, כמה מחקרים מצביעים על כך NSCs חולדה בתרבית במבחנה הנגזר ממערכת העצבים המרכזית או עובריים או מבוגר לבדל באופן בלעדי לשושלות גליה כאשר מושתלים לתוך המילייה של cor השדרה המבוגר ללא פגע או הפצועד 7,12,13, למרות העובדה שתאי גזע העצביים אלה הם מסוגלים להבדיל לשני תאי עצב וגליה במבחנה, מצביעים על כך שהסביבה מקומית עשויה להכתיב את גורלם של תאי גזע. לחלופין, NSCs התרבותי, במיוחד אלה הנגזרים ממערכת העצבים המרכזית למבוגרים, עשוי להיות נכס מהותי defaulty להתמיין לשושלות גליה in vivo 13.
בגלל המגבלות שנדונו לעיל, הקבוצה שלנו לאחרונה פיתחה פרוטוקול חדש כדי לשפר את המעקב עוברי המל"ל, הישרדות, ובידול / התבגרות בחוט השדרה המבוגר נפצע באורח קשה. בקצרה, התחלנו עם קו פישר 344 משפחת מזדווגים עכברים הטרנסגניים יציב להביע גן כתב ה-GFP שמקיים ביטוי של GFP לאחר השתלת in vivo 14. בשלב הבא, אנחנו משמשים NSCs המבודד טרי מיום עוברי 14 344 חוט השדרה פישר, שלב התפתחות ששומר על הפוטנציאל ליצירת שני תאי עצב וגליה. לבסוף, אנו מוטבעיםNSCs טרי ניתק לתוך מטריצת הפיברין המכילה צמיחת גורמי 15-17 כדי לשמר את התאים ובאופן שווה להפיץ אותם בתוך חלל נגע גדול, במטרה לתמוך בהישרדות תא שתל, גזירה ואינטגרציה. שתלי הונחו לתוך אתרים של חיתוך רוחב מלא T3, שבועיים לאחר פגיעה בחוט השדרה. תאים מורכבים אלה מולא באופן עקבי באתרי חיתוך רוחב מלאים ומובחנים לנוירונים בשפע שהשתרעו מספר גדול של אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקים ארוכים 18. תוצאות דומות התקבלו באמצעות שתלים של תאי גזע עצביים אנושיים בתרבית לחולדות חיסונית לקוי 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים של בעלי החיים מאושרים על ידי VA-סן דייגו המוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC). הנחיות NIH לטיפול בבעלי חיים במעבדה ובטיחות הן אחריו בקפדנות. לבעלי חיים יש גישה חופשית למזון ומים לאורך כל תקופת המחקר ומטופלים כראוי למזעור כאב ואי נוחות.
1. הכנת פיברין הרכיבים המכילה קוקטיילי גורם גדילה
- ממיסים פיברינוגן החולדה 25 מ"ג ב0.5 מיליליטר PBS להשיג 50 מ"ג / מיליליטר 2x פתרון מניות (ראה טבלת חומרים). פיברינוגן קשה לפזר וצריך להיות ממוקם ב37 מעלות צלזיוס חממה או waterbath ומזועזע כל דקות 5-10 ל1-2 שעות.
- ממיסים 100 תרומבין החולדה האו"ם ב2 מיליליטר של 10 מ"מ CaCl סטרילי 2 כדי להשיג את 50 U / ml 2x פתרון מניות.
- ממיסים גורמי גדילה ב-PBS בריכוזים הבאים כדי לקבל פתרון 100 מניית μl: 1 מ"ג / מיליליטר: BDNF; NT-3 (ריכוז המניה גבוה כמו עירוי intrathecal in vivo
- ממיסים 25 MDL28170 מ"ג (מעכב calpain) ב1.3 מיליליטר DMSO להשיג 50 פתרון מניות מ"מ DMSO, ואז לדלל 50x בPBS להשיג פתרון מניות 1 מ"מ.
- מערבבים את כל רכיב גורם גדילה 100 μl ושל MDL28170 (פתרון מניות 1 מ"מ) 100 μl לייצר פתרון קוקטייל גורם גדילת 1,000 μl (איור 1).
- מערבבים 500 פתרון מניות μl פיברינוגן 2x עם 500 קוקטייל גורם גדילת μl להשיג פתרון 25 מ"ג / מיליליטר פיברינוגן עבודה המכיל גורמי גדילה וaliquot לתוך 10 או 20 μl לאחסון ב -70 ° C. הפתרון הוא יציב עד 12 חודשים ב -70 ° C.
- בדומה לכך, לערבב פתרון 2x המניה 500 תרומבין μl עם 500 קוקטייל גורם גדילת μl להשיג 25 פתרון עובד U / תרומבין מיליליטר המכיל גורמי גדילה וaliquot לתוך כרכי 10 או 20 μl דומים לאחסוןלא -70 עד מעלות צלזיוס במשך 12 חודשים.
- ביום ההשתלה, הנח קוקטיילים פיברינוגן וגורם גדילה המכיל תרומבין על קרח עד מעורבב עם תאים.
2. חיתוך רוחב חוט השדרה T3
- הרדימי נקבה בוגרת חולדות פישר 344 או חולדות בעירום athymic תוך שימוש בשיטות מקובלות. נושאים עמוקים מורדמים, כאשר היענות לזנב וקמצוץ כפה נעדרות לחלוטין. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 150-200 חולדות גרם פישר או 180-220 גרם חולדות athymic, וקוקטייל הרדמה (2 מיליליטר / קילוגרם) של קטמין (25 מ"ג / מיליליטר), xylazine (1.3 מ"ג / מיליליטר) וacepromazine (0.25 מ"ג / מיליליטר).
- החל משחה העין כדי למנוע יובש או פציעתם של עיניים ואילו בעלי החיים נמצאים תחת הרדמה.
- לגלח את אזור בית החזה העליון ולנקות את העור עם פולידין.
- חותכים את העור ושרירים באמצעות # 15 להב, לחשוף חוליה T3 באמצעות מפשק כירורגית, ולבצע laminectomy בחולית T3 לחשוף T3 / 4 חוט השדרה באמצעות rongeur.
- הפוך לוןחתך קו האמצע gitudinal בדורה של כ -2 מ"מ אורך באמצעות סכין # 11.
- הנח המספריים iridectomy מתחת הדורה לחתוך את חוט השדרה כולו לרוחב הנכון. לעשות חתך נוסף באותו הצד 1.5 מ"מ יותר cadually.
- רקמת חוט השדרה לשאוב בין שני מגזרים לחתוך עם מחט G בוטה 23 מחוברת לואקום בעצימות בינוני. השתמש באימות חזותית על מנת להבטיח חיתוך רוחב מלא ventrally ורוחבי. זה ישלים hemisection לרוחב.
- כדי להאריך את הנגע לחיתוך רוחב חוט השדרה ברוחב מלא, הנח חתכים ראי לhemicord השמאל. תנסה לעזוב את הדורה ללא פגע, מלבד החתך הראשון, כדי לשמר את מטריצת השתל / הפיברין חברה באתר הנגע כאשר השתילו שבועיים מאוחר יותר.
- תפר את השרירים, להחיל אבקת אנטיביוטיקה ומרכיב עיקרי בעור.
- הזרק (3 מיליליטר) של רינגר לקטט, Bannamine (2.5-5 מ"ג / קילוגרם) ואמפיצילין (80-100 מ"ג / קילוגרם) (ראה טבלת חומרים) מייד לאחר הניתוח ומאיחולדות ntain בחממה חמה עד ויסות החום הוא הוקם מחדש.
- רוקן את שלפוחית השתן ולהזריק את הפתרון של רינגר ואמפיצילין פעמיים ביום במשך כשבועיים, עד להקמת שלפוחית רפלקס ריקון (איור 1).
3. הכנת טרי היום עוברי ניתק 14 חוט השדרה עצבית תאי גזע
- השג חולדות F344-GFP מהונדסים משפחת מזדווגים (F344-TG (UBC-EGFP) F455Rrrc) מעכברוש משאבים ומרכז מחקר, אוניברסיטת מיזורי.
- הזרק 40 מיקרוגרם des-גלאי 10, [D-עלא 6]-Leuteinizing הורמון משחרר הורמון Ethylamide (LHRH) מדולל PBS בריכוז של 200 מיקרוגרם / intraperitoneally מ"ל (IP) לחולדה בוגרת נשית (8 שבועות ומעלה) לאחר 2 אינדוקציה אור hr -3 לסנכרון של אוסף עובר.
- הזדווג עם לילה בוגר GFP הומוזיגוטים או הטרוזיגוטיים זכר חולדה 4 ימים לאחר ההזרקה.
- איסוף עובר בימים 13.5-14.5 postcoitus(PC) במאגר HBSS קר, לבחון את הביטוי של GFP תחת משקפיים פנס ומסנן "NightSea" (BLS1 - BlueStar פנס ומסנן מחסום הדגם VG1) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- לנתח חוט השדרה מתוך סביבה נקיה מחיידקים מעובר GFP החיובי ולהסיר את קרומי המוח שמעל וגרעיני השדרה מצורפים עם מספריים iridectomy ומלקחי תכשיטנים בסדר.
- לאסוף את מיתרי השדרה גזורים לתוך 2 חיץ HBSS קר מיליליטר בצינור cornical 15 מ"ל ולשמור על קרח.
- עקוב התייחסות # 20 לנתק את מיתרי השדרה גזורים:
- בקצרה, להוסיף 2 מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA לצינור המכיל מיתרי השדרה גזורים (ניתן לעכל כמה חוטים יחד, כבל 1 יכול לייצר מספיק תאים להשתלה של נושא אחד) ולעכל ב37 מעלות צלזיוס למשך 10-12 דקות.
- לעצור את תגובת טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של DMEM המכיל FBS 10% לצינור צנטריפוגות הרקמות ב2,500 סל"ד במשך 2 דקות.
- Resuspend רקמות ב2 מיליליטר שיתוף בינוני neurobasalntaining 2% B27, וtriturate רקמת חוט השדרה באמצעות pipets פסטר אש מלוטש בהדרגה קטנה יותר.
- צנטריפוגה התאים ב 2,500 סל"ד במשך 2 דקות, resuspend ב 2 מיליליטר של מדיום neurobasal המכיל B27, ותאי סינון עם מסננת מסנן תא 40 מיקרומטר.
- ספירת התאים עם hemocytometer ולחלק את התאים באופן שווה לשני צינורות Eppendorf.
- צנטריפוגה התאים ולהסיר לחלוטין את supernatant (1-2 דקות נדרשות להסיג את כל supernatant עם טיפ ואקום נמוך) ולכן הקוקטיילים גורם גדילה לא ידוללו על ידי supernatant שנותר לאחר התא מחדש השעיה.
- Resuspend כל מחצית התאים בפיברינוגן או הפתרון עובד תרומבין המכיל גורמי גדילה, בהתאמה, בריכוז של 250,000 תאים / μl (ספירות תא גלולה במשך כ ⅓ נפח סופי) ומניח אותם על השתלה לפני קרח (איור 1 א). הערה פיברינוגן שעשוי באופן ספונטני ג'ל כאשר מעורבבים עם תאs לפני שילוב עם תרומבין באתר נגע / שתל; כדי להימנע מgellation המוקדם, לערבב תאים בפיברינוגן מייד לפני השתלת תאים בגוף חי.
4. השתלות
- Reexpose חוט השדרה lesioned T3 / 4 שבועיים לאחר חיתוך רוחב של חוט השדרה.
- 5 פיברינוגן-תאים μl ו5 תרומבין-תאי μl יכולים להיות מוזרקים ישירות לתשע נקודות של אתר הנגע באמצעות רקמת צלקת אטומה ודורה שלמה ללא פתיחה מחדש אתר הנגע.
- שימוש במחט G 27 ליצור 9 חורים על פני השטח של רקמת הצלקת ודורה ללא פגע לאחר 1-2 שבועות נגע: 3 במרכז (אחד בנקודת אמצע ושניים בlaterals, ומרווחי 0.5 מ"מ בנפרד) ו 3 בשני מקורי ו3 בממשק הזנב (כ 0.5 מ"מ מקורי או הזנב למרכז של הנגע).
- אז מזריק מחצית נפח של פתרון תא פיברינוגן לשלוש נקודות של אתר הנגע ורבע נפח מרכזיים ל3 נקודות של הממשק וaq מקוריuarter נפח ל -3 נקודות של ממשק הזנב.
- ואז, מייד להזריק תאי throbmbin לאותם מקומות. התערובת של תאי פיברינוגן ותאי תרומבין בתוך אתר הנגע תהווה ג'ל הפיברין להחזיק תאים לתוך אתר נגע וקוקטיילי גורם הגדילה יתמכו בהישרדות של תאים. תאים מוזרקים באמצעות טפטפות זכוכית משך מחוברת לPicospritzer (כללי Valve, Inc).
- NSCs השתלות התרבותי אנושי 21 באותו ההליך שתואר לעיל, ולהשתמש בקוקטיילי הפיברין וגורם גדילה עשויים מחומרים כימיים אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תיוג immunohistological GFP מוכיח כי NSCs חולדה מורכב resuspended בופר פוספט (PBS) (חסר מטריצת הפיברין וגורמי גדילה) שרד בצורה גרועה באתר חיתוך רוחב T3, רק הצמדת לשוליים נגע / המארח ועוזבים את רוב אתר הנגע ריק ללא תאים מורכבים (איור 2 א). ההישרדות של NSCs משופר בעת שיתוף מורכב עם מטריצות הפיברין לבד, אבל השתל לא להתמלא לגמרי חלל גדול נגע (מידע לא מוצג). לכן, אנו מוטבעים NSCs למטריצות הפיברין מכילות קוקטיילים גורם גדילה כדי לשפר את ההישרדות שלהם, מילוי של חללי נגע גדולים והתמיינות לתאי עצב וגליה לאחר חיתוך רוחב חוט השדרה 15-17. שתלי של או עכברוש או NSCs אדם למלא באופן עקבי ובאופן מוחלט את חלל הנגע כאשר העריכו שבעה שבועות לאחר השתלת 18 (איורים 2 ב-C).
אנחנו ביצענו מחקר כמובן זמן כדי לבחון מוקדםהישרדות ומילוי של חלל הנגע לאחר ההשתלה של NSCs המוטבע במטריצות הפיברין עם קוקטיילים גורם גדילה. ניתוח היסטולוגית חשף כי NSCs להביע GFP שרד גם 24 שעות לאחר ההשתלה (איורים 3A-B). NSCs המורכבים בהדרגה הפך צפוף יותר לאורך זמן כדי למלא לגמרי את חלל נגע transected ידי השבוע לאחר ההשתלה הראשון ככל הנראה בשל ריבוי 21 (איורים 3C-H). בנוסף, NSCs מורכב משולב היטב בממשק מארח / נגע והופיע כדי להפחית את האזורים של immunoreactivity GFAP בשולי חלל הנגע (איור 3).
חלק מNSCs מורכב מובחן לנוירונים NeuN-להביע שבעה שבועות לאחר ההשתלה (איורים 4 א-B). בנוסף, תאי עצב בחוט השדרה הנגזר שתל הרחיבו מספר גדול של אקסונים אל חוט השדרה המארח בשני כיוונים מקורי ואת הזנב על פני מרחקים ארוכים 18 < / Sup> (איור 4C). מורכב אקסונים הנגזרים האריכו rostrally וcaudally דרך שני חומר לבן וחומר אפור בחוט השדרה המארח (איורים 4D-E).
איור 1. הניסויי סכמטי וקו זמן. א) ציור סכמטי מותאם מ22 פופוביץ (Cell 2012) ממחיש השתלה של תאי גזע עצביים בג'ל הפיברין המכיל קוקטייל גורם גדילה לתוך חוט transected לחלוטין השדרה. ב ') קו זמן ניסויי. ניתן לבצע ניתוחי התנהגות וelectriophysiological לאחר השתלת תא ולפני זלוף. זמן ההישרדות של נושאים יכול להיות משתנה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
.. איור 2 הישרדות ומילוי של הגזע עצבי שתלי נייד באתרי חיתוך רוחב מלאים T3-GFP וimmunolabeling ניאון GFAP בסעיפים אופקיים מדגים () הישרדות ירודה של העכברוש E14 NSCs (ירוק) מחדש תלויה PBS חסר גורמי גדילה ומטריצת הפיברין; לפני הספירה) הישרדות מצוינת ומילוי חלל נגע כש( חולדה) B או () NSCs אדם C היו משובצים במטריצות הפיברין מכילים קוקטיילים גורם גדילה מלא. התא היו מורכבים לאתרי חיתוך רוחב T3 במשך 7 שבועות. סרגל קנה מידה, 310 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
"Src =" 6.5in / files/ftp_upload/50641/50641fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
איור 3. שתל הישרדות בנקודות בתחילת זמן. GFP א.ב.) והישרדות GFAP כפולה מופע immunolabeling והפצה של NSCs חולדה מורכבים באתר חיתוך רוחב, שלאחר ההשתלה ביום 1 במטריצת הפיברין. האזור התאגרף במוצג בהגדלה גבוהה יותר בתקליטור לוח ב ') הישרדות תא והפצה ניכרה גם ביום 2 ויום (EF) 3 הודעה השתלה. GH) על ידי 7 ימים, תאים למלא את אתר נגע וצפופים יותר. בר סולם: A, C, E, G, 300 מיקרומטר; B, D, F, H, 62 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 4. בידול ותולדה של העצבי Steשתלי סלולרי מ 'באתר חיתוך רוחב מלא T3. GFP א.ב.) וסימון NeuN לאשר התמיינות / התבגרות עצבית נרחבת של תאי גזע עצבי עכברוש מורכב 7 שבועות לאחר השתלת ה-GFP. C) וimmunolabeling NeuN מגלה כי שתלים של תאי גזע עצביים-GFP-לבטא להאריך מספרים גדולים של אקסונים לחוט השדרה מקורי ומארח הזנב לאתר חיתוך רוחב (הזנב מוצג), שבועיים לאחר השתלה. DE) הגדלה גבוהה מאזורים התאגרפו של תכנית C פנל שאזורים נרחבים בחוט השדרה המארח להכיל תחזיות axonal נגזר שתל בשני חומר לבן וחומר אפור. סרגל קנה מידה: AB, 62 מיקרומטר; C, 700 מיקרומטר; DE, 62 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד המכשולים העיקריים להשתלה המל"ל בחוט השדרה נפגע הוא הישרדות עניות במרכז הנגע. כל פערים או חללים באתר הנגע העלול להפחית או להחליש את היווצרות של ממסרים עצביים פונקציונליים בין האקסונים supraspinal ומגזרים בחוט השדרה נפרדים מתחת לפציעה. בנוסף, הישרדות ירודה של NSCs מורכב עשויה להשפיע על האינטגרציה שלהם עם רקמה מארחת, ולכן להפחית את הקישוריות של תאי עצב מורכבים עם נוירונים מארחים. מנגנונים אפשריים להסביר אובדן תא כוללים את הסביבה ציטוטוקסיות נוצרה על ידי SCI החריף, ניוון משני של חוט השדרה המארח, וכלי דם מספקים של האזור נפצע 4.
הפיברין נעשה שימוש כדי לספק תאים, תרופות וגורמי גדילה במודלי ניסויים שונים ויישומים קליניים, שכן הוא יכול לשמור על תאים ומולקולות, כאשר הוא הופך להיות 23 polymerized. מחקר קודם הראה כי איטום הפיברין האדםיכול לשמש כbiomatrix כדי לשפר את התחדשות אקסון בsubtotally transected חוט השדרה מבלי לעורר תופעות לוואי לגילוי 24. אנחנו השתמשנו בעבר מטריצות הפיברין להטביע תאי סטרומה מח עצם להשתלה לתוך חוט השדרה נפגע כרוני 17. תאים מורכבים שרדו גם באתר הנגע הכרוני ומשתלבים היטב עם parenchyma חוט השדרה מארח 17. לכן, הרחבנו את השימוש של הפיברין להטביע NSCs להשתלה לאתרי נגע פתוח גדולים בחוט השדרה transected. למרות שההישרדות של NSCs מורכב השתפרה עם הפיברין, ההישרדות של NSCs מורכבים נשארה משתנה במקצת ומורכבת NSCs לעתים רחוקות מילא חלל נגע גדול לחלוטין.
לפיכך, אנו הוספנו קוקטייל של גורמי גדילה, במאמץ לשפר את הישרדותם ושגשוגם של NSCs באתר הנגע. גורמי גדילה הוכחו במחקרים רבים כדי לתמוך NSCs במבחנה 25. While התוספת של גורמי גדילה לתרבויות של NSCs יכול לשנות את הגורל שלהם, אנחנו מבחינה איכותית לא לזהות שינוי ניכר בצפיפות עצבית כאשר קוקטיילים גורם הגדילה הוסיפו לשתל בהשוואה לשתל שרד באופן חלקי אלו ללא גורמי גדילה. ניתוח מפורט יותר הוא הכרחי לפני שאנו יכולים להעריך בודאות את ההשפעה של קוקטיילים גורם גדילה בגורל תא. במהלך התפתחות עצבית נורמלית, ההישרדות והצמיחה של תאי עצב תלוי בגורמי נוירוטרופי שלעתים קרובות שפורסמו על ידי צמיחת אקסון מדריך רקמת היעד, ובמקרים מסוימים, להשפיע על הישרדות עצבית 26.
קוקטיילים גורם גדילה דומים אבל פשוט כבר נוצלו על ידי קבוצות אחרות כדי לשפר את ההישרדות ובידול של NSCs הן במבחנה in vivo 15,16. מאמצים אלה בדרך כלל הביאו להישרדות המל"ל פחות נרחבת מאשר גישת הגורם מרובה שאמצנו. הצעד הבא חיוני בהתפתחות זומאמץ הוא לצמצם את הרשימה של גורמי גדילה בקוקטייל, כי הם חיוניים לתמיכה במועצה לביטחון לאומית הישרדות, מאמץ שמתנהל. זה אפשרי לחלוטין, כי במספר מצומצם יותר של גורמי גדילה יתמוך מעלות שווה של הישרדות שתל, ממצא שהיה לפשט את הגישה הזאת ניסיונית ותרגום הפוטנציאל שלה למחקרים בבני אדם.
בנוסף לשימוש במטריצות הפיברין וקוקטיילים גורם גדילה, ההצלחה של השתלת in vivo לאתר הנגע החמור יכולה להיות תלויה בגורמים מכאניים באתר הנגע. אנו עושים כל מאמץ כדי לשמור על השלמות של קרום dural הדק מאוד שoverlies כבל המכרסמים השדרה לאחר נגעים והשתלה, במאמץ לשמור על מכאני תאים מורכבים באתר הנגע. לכן, אנו עושים מאמצים זהירים וחרוצים כדי לייעל את מילוי תא עקבי של אתר הנגע. ללא מאמצים המרובים אלה, מילוי שתל אינו שלם. טכניקות אלו דורשות practi הנרחבהספירה.
בניסיון ללמד את הטכניקה הזו לאחרים, זיהינו כמה אתגרים. אם תאים שהוחדרו לתוך חוט השדרה המארח במקום חלל הנגע, ולאחר מכן תאים עשויים מעדיפים להתמיין לגליה. במקרה זה, מספר אקסונים המתעוררים מופחת במידה ניכר. אם טיפול ובחריצות גדולים אינם עשויים למלא את חלל הנגע תוך שימוש בטכניקות מרובות והגישות שתוארו בסעיפים הקודמים, הישרדות תא היא פחות עקבית ותגובות ביולוגיות, כוללים תולדת האקסון, מוגבלות. לכן, זה הכרחי כדי להקדיש זמן רב, חריצות וטכניקה מוקפדת להשתמש בהצלחה בשיטות אלה. פעם אחת הטכניקות נרכשות, התוצאות הן עקביות מאוד מבעלי החיים לבעלי חיים, מניב היכולת ללמוד את המאפיינים ביולוגיים יוצאות דופן של NSCs אלה באתרי נגע מערכת עצבים מרכזיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מודים למשאב לעכברוש ומרכז מחקר, אוניברסיטת מיזורי, קולומביה, מיזורי, למתן חולדות GFP; Neuralstem בע"מ לאספקת תאי גזע עצביים של אדם. עבודה זו נתמכה על ידי המינהל הוותיקים, NIH (NS09881), מנהל מחקר בעמוד השדרה בקנדה, קרן קרייג ח נילסן, וברנרד וקרן הצדקה אן שפיצר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
