Summary
성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.
Abstract
신경 줄기 세포 (NSCs의)는 자기 갱신과 뉴런과 교세포로 분화 할 수있다. NSCs의 이식은 척수 손상 (SCI) 후 손실 뉴런 및 아교를 대체 할 수 있고, 병변 위와 아래 척수 세그먼트를 재 연결하는 중계 기능을 형성 할 수있다. 신경 줄기 세포를 이식 이전 연구는 척수 병변 공동 내에 불완전 이식편 생존에 의해 제한되었다. 또한, 이식 세포의 생존, 분화, 및 프로세스 확장의 추적이 최적화되지 않았다. 마지막으로, 이전의 연구에서, 배양 된 쥐의 NSCs의는 일반적으로 운명이 특정 세포 형태로 구동되지 않는 한, 오히려 신경보다 부상 척수에 이식 할 때 교세포로 분화하는 것으로보고되었다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 심한 SCI의 사이트에 NSCs의 생존, 통합 및 차별화를 개선하기 위해 새로운 방법을 개발했다. NSCs의 갓 녹색 플로리다를 표현하는 안정적인 형질 전환 피셔 344 쥐 라인에서 배아 일 14 척수 (E14)에서 분리되었다uorescent 단백질 (GFP)과는 성장 인자를 함유 피브린 매트릭스에 삽입 하였다; 병변 캐비티 그라프 세포를 유지하고 세포 생존을 지원하는 것을 목표로 제형. 섬유소 / 성장 인자 칵테일 NSCs을함으로써 염증의 피크 기간을 피하고 2 주 흉부 레벨 3 (T3) 완전 척수 transections 후 이식되었다. 결과 이식은 완전히 병변 구멍을 채워 호스트 척추 현저하게 장거리 코드 및 아교로 축삭을 확장 모두 신경 세포로 분화. GFP를 표현하는 교양 인간 NSCs의의 이식은 유사한 연구 결과의 결과. 따라서, 방법은 신경 줄기 세포 이식, 생존과 생체 내 연구 결과의 분석을 향상시키기 위해 정의된다.
Introduction
척수 손상 (SCI)는 종종 손상뿐만 아니라의 interneurons 및 운동 신경의 분절 손실을 일으키는 원인이되는 뇌로부터 신호를 전달 백색질, 또한 중앙 회색 문제. SCI의 결과는 모터와 병변 아래 감각 기능 양자의 손실이다. 불행하게도, 성인 중추 신경계 (CNS)는 자발적으로 영구적 인 기능 적자 1의 결과로, 다시 생성되지 않습니다. 따라서, 부상 성인 척수 및 개선 모터, 감각 및 자율 신경 기능의 재건은 SCI 연구의 중요한 목표이다. 신경줄 기세포 (NSCs의)은 직접적으로 배아 또는 성인 CNS로부터 격리 여부 분실 뉴런 및 아교를 대체하는 강력한 후보 셀이다. 또한, 이러한 세포 병변 사이트 2,3 걸쳐 축삭 전도를 복원하는 신규 기능 릴레이를 형성 할 가능성이있다.
현재까지 해부학의 상세한 해설, electrophys은 없었다iological 심각한 SCI 후 이식 NSCs의로의 연결을 중계 형성의 행동 효과. 첫째, 이식 NSCs의 태아의 중추 신경계 조직을 큰 병변 구멍에 이식 할 때 제대로 생존이에 대한 몇 가지 이유가 있습니다. 이전 연구는 큰 빈 낭성 병변 충치에게 4,5를 떠나, 상당한 초기 세포 손실을 보여줍니다. 일부 연구에서는 이식 된 세포가 연속적으로 나누어 병변 캐비티에게 4,5를 작성하지만이 주 일의 지연 상황이 발생할 수 있습니다, 이후 병변 사이트의 충전이 완료 또는 일치하지 않을 것입니다. 둘째, 세포의 생존, 분화 / 성숙하고, 이식 NSCs의의 파생물에 사운드 데이터를 제공하는 효율적인 추적 시스템이 부족했다. 대부분의 초기 연구는 antegrade 및 이식 2,3에서 축삭 돌기를 추적하는 역행 라벨을 이용했다. 그러나 이러한 기술은 부분적으로 만 자주 unclearly 표시 축삭 이식 세포에서 발생하는 예측 및 추적 방법은 subjec 있습니다이식 된 세포 이상 염료 누출로 인한 유물에 t. 다른 그룹은 부상 쥐 척수 5,6에 인간 태아 NSCs의 이식 후 축삭 돌기에 라벨을 인간의 특정 신경 세포 마커를 사용했습니다. 그러나 이러한 연구에서, 이종 이식은 지속적으로 잘 생존하지 않았다. 최근 GFP 리포터 유전자의 바이러스 배달은 배양 NSCs의 7,8 레이블을 사용 하였다. 그러나, GFP의 표현은 종종 일치했고 7을 규제 할 수있다. 최근, 안정 리포터 유전자, GFP 또는 인간 태반 알칼리 포스 파타 아제를 발현하는 형질 전환 마우스 또는 공여 쥐의 사용이 극적 생체 9,11에서 이식 신경 줄기 세포 / 전구 세포의 추적을 개선했다. 셋째, 여러 연구는 손상이나 부상 성인 척추 오호의 환경에 이식 할 때 배아 또는 성인 하나 CNS에서 파생 된 체외에서 배양 한 쥐의 NSCs의 독점적 폐해 계통으로 분화을 나타냅니다이러한 신경줄 기세포는 로컬 환경은 줄기 세포의 운명을 지시 할 수 있다는 것을 나타내는, 뉴런 및 체외에서 신경교 모두로 분화 할 수 있다는 사실에도 불구하고 D 7,12,13. 또한, 배양 NSCs의, 성인 CNS에서 파생 특히이 생체 내 13 신경교 계통으로 분화하는 고유 defaulty에 속성을 가질 수있다.
때문에 위에서 언급 된 한계, 우리 그룹은 최근에 중상을 입은 성인 척수 배아 NSC 추적, 생존, 분화 / 성숙을 개선하기 위해 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 간단히 말해서, 우리는 생체 이식 14 후 GFP 발현을 지속 GFP 리포터 유전자를 발현하는 형질 전환 안정 피셔 344 쥐 inbreed 라인 시작했다. 다음에, 우리는 배아 일부터 14 피셔 344 척수 뉴런 및 아교 모두를 생성 할 수있는 잠재력을 유지 개발 단계를 갓 절연 NSCs의 사용. 마지막으로, 우리는 임베디드성장을 함유 피브린 매트릭스에 갓 NSCs의 분해는 세포를 유지하고 균등 그래프트 세포 생존, 분화 및 통합을 지원하는 것을 목표로, 큰 병변 공동 내에이를 분산 15-17 요인. 이식은 T3 완전 절개, 척수 손상 후 2 주간의 사이트에 배치했다. 이러한 이식 세포는 지속적으로 완전한 절개 사이트를 가득 긴 거리 18 세 이상 호스트 척수로 축삭 많은 수의 확장 풍부한 신경 세포로 분화. 유사한 결과 면역 결핍 쥐 18에 배양 된 신경 줄기 세포의 이식을 사용하여 수득 하였다.
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Protocol
모든 동물 프로토콜은 VA-샌디에고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인됩니다. 실험실 동물 관리 및 안전에 대한 NIH의 지침을 엄격히 준수. 동물 연구를 통해 음식과 물에 자유롭게 접근이 적절하게 고통과 불편을 최소화하기 위해 처리됩니다.
1. 섬유소 구성 요소의 준비 성장 인자 칵테일을 함유
- (자료 표 참조) 50 ㎎ / ㎖ 2 배 원액을 얻기 위해 0.5 ml의 PBS에 25 mg을 쥐 피브리노겐을 분해. 섬유소 용해하기 어렵고, 37 ° C의 보육 또는 수조에 넣고 1 ~ 2 시간마다 5 ~ 10 분을 흔들어해야합니다.
- 50 U / ㎖의 2 배 원액을 얻기 위해 10 mM의 멸균 염화칼슘 2 ㎖에 100 UN 쥐 트롬빈을 녹인다.
- 100 ㎕의 원액을 구하는 다음의 농도로 PBS에 성장 인자를 녹이고, 1 ㎎ / ㎖ : BDNF; 생체 내에서 척수강 내 주입으로 NT-3 (높은 주식 농도
- 50 mM의 DMSO 주식 솔루션을 얻기 위해 1.3 ㎖의 DMSO에 25 밀리그램의 MDL28170 (칼 페인 억제제)를 용해하고 1 ㎜ 주식 솔루션을 얻기 위해 PBS에 50 배 희석.
- 1000 μL 성장 인자 칵테일 솔루션 (그림 1)를 생산하는 각각의 성장 인자 성분의 100 μL와 MDL28170 (1 ㎜의 원액) 100 μl를 섞는다.
- -70 ℃에서 저장을위한 10 또는 20 μL에 성장 인자와 나누어지는를 포함하는 25 ㎎ / ㎖ 피브리노겐 작업 솔루션을 얻기 위해 500 μL 성장 인자 칵테일 500 μL 피브리노겐 배 원액을 혼합 이 솔루션은 -70 ° C에서 최대 12 개월 동안 안정
- 마찬가지로, 스토리지 유사 10 또는 20 ㎕의 부피로 성장 인자를 함유하는 분취 액과 25 U / ㎖ 트롬빈 작업 용액을 얻기 위해 500 ㎕의 성장 인자의 칵테일을 500 μL 트롬빈 2X 원액 혼합T -70 ° C에 대한 최대 12 개월까지.
- 세포와 혼합 될 때까지 이식의 날, 얼음에 피브리노겐과 트롬빈 함유 성장 인자 칵테일을 배치합니다.
2. T3 척수 절개
- 수용 가능한 방법을 사용하여 성인 여성의 피셔 344 쥐 또는 무 흉선 누드 쥐를 마취. 꼬리와 발 핀치에 응답이 완전히없는 경우 주제 깊이, 마취 있습니다. 참고 : 우리는 일반적으로 150-200g 피셔 쥐 또는 1백80~2백20그램 무 흉선 쥐와 마취제의 마취 칵테일 (2 ㎖ / ㎏) (25 ㎎ / ㎖), 자일 라진 (1.3 ㎎ / ㎖) 및 아세 프로 마진 (0.25 MG를 사용 / ㎖).
- 동물이 마취 동안 건조 또는 눈의 손상을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 상단 흉부 영역을 면도하고 베타 딘으로 피부를 청소합니다.
- , # 15 블레이드를 사용하여 피부와 근육을 잘라 외과 견인기를 사용하여 T3 척추를 노출하고 rongeur을 사용하여 T3 / 4 척수를 노출 T3 척추에서 후궁 절제술을 수행합니다.
- 경도를 확인# 11 블레이드를 사용하여 약 2mm 길이의 경질의 종 방향 중간 선 절개.
- 오른쪽 측면 전체 척수를 절단하는 경막 아래에 홍채 절개 가위를 놓습니다. 1.5 mm 더 cadually 같은면에 또 다른 상처를 확인합니다.
- 중간 강도의 진공에 연결 무딘 23 G 바늘 두 컷 세그먼트 사이 기음 척수 조직. 배쪽으로 횡 방향 완전 절개를 보장하기 위해 시각적 인 확인을 사용합니다. 이 측면 hemisection을 완료합니다.
- , 전체 폭 척수 절개로 병변을 확장 왼쪽 hemicord에 거울 절개를 배치합니다. 2 주 후 이식 할 때 병변 사이트의 회사 이식 / 섬유소 매트릭스를 유지하기 위해, 첫 번째 컷이 아닌, 그대로 두라를 떠나 시도합니다.
- 근육을 봉합 항생제 분말과 주식 스킨을 적용.
- 락 테이트 링거액 (3 ㎖)을 주입, Bannamine (2.5-5 ㎎ / ㎏)과 암피실린 (80 ~ 100 ㎎ / ㎏) 즉시 수술 및 마이 후 (재료 표 참조)따뜻한 인큐베이터에서 ntain 쥐 체온이 다시 설정 될 때까지.
- 방광을 비우고 (그림 1B)를 비우는 반사 방광의 설립 때까지 약 2 주 동안 하루에 두 번 링거 암피실린 솔루션을 주입.
3. 갓 해리 배아 일의 준비 (14) 척수 신경은 줄기 세포
- inbreed 유전자 변형 GFP의 F344 쥐 쥐 자원에서 (F344-Tg는 (UBC-EGFP) F455Rrrc) 및 연구 센터, 미주리 대학교를 얻습니다.
- 40 μg DES-의 Gly (10)를 주입, [D-알라 6] Leuteinizing 호르몬이 후 200의 농도 ㎍ / 성숙한 여성의 쥐 (8 주 이상) 당 (IP)을 복강 ml로 PBS에 희석 호르몬 에틸 아미드 (LHRH)을 해제 배아 컬렉션의 동기화를위한 -3의 시간 빛 유도.
- 사일 주입 후 성숙한 GFP 동형 접합 또는 이형 남성 쥐의 하룻밤과 결합.
- 일 13.5-14.5 postcoitus에서 배아를 수집또는 형광 현미경 - 차가운 HBSS 버퍼 (PC), "NightSea"손전등 및 필터 안경 (BlueStar는 손전등 모델 VG1 차단 필터 BLS1)에서 GFP 발현을 확인합니다.
- 각 GFP 양성 태아에서 무균 중 척수를 해부 위에있는 수막 및 홍채 절제술 가위 및 미세 보석상의 집게와 연결된 척수 신경절을 제거합니다.
- 15 ㎖의 cornical 관에 2 ㎖ 차가운 HBSS 버퍼로 해부 척수를 수집하고 얼음에 보관.
- 해부 척수 해리 참조 번호 (20)를 따라
- 간단히, (여러 코드 1 코드가 하나의 주제의 이식을위한 충분한 세포를 생성 할 수 있습니다, 함께 소화 할 수있다) 해부 척수를 포함하는 튜브에 0.25 % 트립신-EDTA 2 ㎖를 추가하고 10 ~ 12 분 동안 37 ° C에서 소화.
- 튜브를 원심 분리 2 분 동안 2,500 rpm에서 조직을 10 % FBS 함유 DMEM 10 ㎖를 첨가함으로써 트립신의 반응을 정지.
- 2 ㎖ NeuroBasal 매체 콜로라도에있는 조직을 재현 탁2 % B27를 ntaining하고, 점차적으로 작은 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 척수 조직을 씹다.
- 원심 분리기 40 μm의 셀 필터 여과기와 2 분, B27를 함유 NeuroBasal 배지 2 ㎖에 재현 탁하고, 필터 셀에 대한 2,500 rpm에서 세포.
- 혈구와 세포를 세어 똑같이 두 에펜 도르프 튜브에 세포를 나눕니다.
- 세포를 원심 분리기와 완전히 뜨는을 제거 (1 ~ 2 분은 저 진공 끝으로 모든 상층 액을 철회해야한다) 그래서 성장 인자 칵테일 세포 재 정지 후 남은 상층 액을 희석되지 않습니다.
- (약 ⅓ 최종 볼륨의 세포 펠렛 카운트) 250,000 세포 / μL의 농도로 각각 성장 인자를 포함하는 피브리노겐 또는 트롬빈 작업 솔루션의 각 셀 절반을 재현 탁하고 (그림 1A) 얼음 전에 이식에 배치. 세포와 혼합 때 피브리노겐이 자발적으로 젤 수도 있습니다발 병변 / 그래프트 사이트 트롬빈과 결합하기 전에; 조기 겔화를 방지하기 위해, 바로 생체 내에서 세포 이식하기 전에 피브리노겐의 세포를 혼합한다.
4. 이식
- 이주 척수 절개 한 후 병변을 T3 / 4 척수 Reexpose.
- 5 μL 피브리노겐 세포 5 μL 트롬빈 세포는 직접 병변 사이트를 다시 열지 않고 밀봉 된 흉터 조직 그대로 두라를 통해 병변 사이트의 9 점에 주입 될 수있다.
- 센터에서 3 (중간 지점에있는 하나 이음 두, 따로 따로 0.5 mm 간격)와 주동이 모두 3 : 반흔 조직 그대로 두라 1~2주 포스트 병변의 표면에 9 홀을 만들기 위해 27 G 바늘을 사용하여 와 꼬리 인터페이스 (병변의 중심에 약 0.5 mm 주동이 또는 꼬리) 3.
- 그런 다음 주동이의 인터페이스와 수성의 3 점으로 병변 사이트와 분기 볼륨의 세 가지 핵심 포인트로 피브리노겐 세포 솔루션의 절반 볼륨을 주입꼬리 인터페이스의 3 점에 uarter 볼륨.
- 그 후, 즉시 동일한 스팟에 throbmbin 세포를 주입. 피브리노겐 및 세포 병변 사이트 내부 트롬빈 세포의 혼합물을 병변 부위에 세포를 억제하는 피브린 겔을 형성하고 성장 인자의 칵테일은 세포의 생존을 지원할 것이다. 세포 PicoSpritzer (일반 밸브, 주식 회사)에 접속 뽑아 유리 피펫을 사용하여 주입된다.
- 이식 교양 인간 NSCs의 상술 한 바와 같은 절차에 21 일 인간 시약 만든 섬유소 및 성장 인자 칵테일을 사용합니다.
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Representative Results
GFP 면역 조직 라벨이 접목 쥐 NSCs의는 병변 / 호스트 마진에 부착하고없는 빈 병변 사이트의 대부분을 떠나, T3의 절개 사이트에서 가난하게 살아 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) (섬유소 매트릭스와 성장 인자가 결여)에 재현 탁 것을 보여줍니다 이식 세포 (그림 2A). 단독 피브린 매트릭스와 공동 그래프트 NSCs의 경우의 생존을 향상하지만 그라프 완전히 큰 병변 캐비티 (데이터는 도시하지 않음)을 채우지 않았다. 따라서, 우리는 척수 절개 15-17 후 뉴런과 교세포에 큰 병변 충치과 분화의 작성, 자신의 생존을 향상시키는 성장 인자 칵테일을 포함 섬유소 행렬에 NSCs의 임베디드. 18 (그림 2B-C)를 포스트 이식 칠주 평가 때 쥐 또는 인간 NSCs의 하나의 이식은 지속적으로 완전히 병변 구멍을 채우십시오.
우리는 초기 검사 시간 과정 연구를 수행생존과 성장 인자 칵테일 섬유소 매트릭스에 포함 된 NSCs의의 이식 후 병변 공동의 충전. 조직 학적 분석은 GFP 표현 NSCs의 이식 (그림 3A-B)은 후에 24 시간을 살아 것으로 나타났다. 이식 NSCs을 점차적으로 완전히 아마 인해 확산 21 (그림 3C-H)에 이식 후 첫 주에 가로로 병변 구멍을 채우기 위해 시간이 지남에 더 조밀하게되었다. 또, 그래프트 NSCs의 호스트 / 병변 계면에 잘 통합 병변 캐비티 (도 3)의 여백에 GFAP 면역 반응성의 영역을 줄이기 위해 나타났다.
이식 NSCs의의 일부는 칠주 이식 (그림 4A-B) 후 노이 앤 발현하는 신경 세포로 분화. 또한, 이식 유래 척수 신경은 긴 거리를 18 세 이상 주동이와 꼬리 방향으로 <모두의 호스트 척수로 축삭 많은 수의 확장 / SUP> (그림 4C). 이식 파생 축삭 흰색 물질과 호스트 척수 (그림 4D-E)에있는 회색 물질 모두를 rostrally와 꼬리 쪽 확장.
그림 1. 실험 회로도 및 타임 라인. A) 포포비치 22 (셀, 2012)에서 적응 개략도 섬유소 젤이 완전히 가로로 척수. B) 실험 타임 라인에 성장 인자 칵테일을 포함하는있는 신경 줄기 세포의 이식을 보여줍니다. 행동과 electriophysiological 분석은 세포 이식 후 살포하기 전에 수행 할 수 있습니다. 주제의 생존 기간은 변수가 될 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
.. 그림 2의 생존과 신경의 충전은 T3 완료 절개 사이트에있는 세포 이식 줄기 수평 섹션 GFP 및 GFAP 형광 immunolabeling 성장 요인과 섬유소 매트릭스가 부족한 쥐 E14 NSCs의 (녹색) PBS에 재 부유의 (A) 생존율을 보여줍니다; BC) 좋음 생존 및 (B) 쥐 또는 (C)가 NSCs의 인간 성장 인자의 칵테일을 함유 피브린 매트릭스에 매립 된 병변 공동의 완전 충전. 휴대 7 주 동안 T3의 절개 사이트에 이식했다. 스케일 바, 310 μm의는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 3. 이식 생존 초기 시점에서. AB) GFP 및 GFAP 더블 immunolabeling 쇼 생존과 절개 사이트, 섬유소 매트릭스 일일 착상에 접목 쥐 NSCs의 유통. 박스형 영역이 패널 B에 CD) 세포의 생존 및 유통에서 더 높은 배율로 표시됩니다 칠일으로 2 일에 또한 분명하고 (EF) 3 일 후 이식. GH), 세포 병변 사이트를 채우고 밀도이다. 스케일 바 : A, C, E, G, 300 μm의; B, D, F, H, 62 μm의는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
신경 마리의 그림 4. 차별화 및 파생물T3 완료 절개 사이트에있는 M 세포 이식. AB) GFP 및 노이 앤 라벨이 칠주 이식. C) GFP 후 노이 앤의 immunolabeling가 GFP를 발현하는 신경 줄기 세포 이식이 호스트 척수 주동이로 축삭의 큰 숫자를 확장하고 있음을 알 수 그라프 쥐의 신경 줄기 세포의 광범위한 신경 세포의 분화 / 성숙을 확인 절개 사이트 (꼬리가 보이는) 2 주 후 이식. DE) 호스트 척수의 광범위한 영역의 백질과 회백질 모두에서 이식 유래의 축삭 돌기를 포함하는 패널 C 쇼의 박스 지역에서 높은 배율로 꼬리. 스케일 바 : AB, 62 μm의; C, 700 μm의; DE, 62 μm의. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
손상된 척수에있는 NSC 이식을위한 주요 장애물 중 하나는 병변 센터에서 생존율이다. 병변 사이트의 틈새 나 구멍은 잠재적으로 감소 시키거나 supraspinal 축삭 손상 아래 분리 된 척수 세그먼트 사이의 기능적 연결을 릴레이의 형성을 약화시킬 수 있습니다. 또한, 이식 NSCs의 가난한 생존 호스트 조직과의 통합에 영향을 미치고, 따라서 호스트 신경 세포와 이식 뉴런의 연결을 줄일 수 있습니다. 세포의 손실을 설명하는 잠재적 인 메커니즘은 세포 독성 급성 SCI에 의해 만들어진 환경, 호스트 척수의 차 변성 및 손상 영역 (4)의 불충분 한 혈관이 (가) 있습니다.
피브린은 중합 된 (23)이되는 경우에는 세포와 분자를 보유 할 수 있기 때문에, 다양한 실험 모델 및 임상 응용에 세포, 약물 및 성장 인자를 전달하는 데 사용되었다. 이전 연구는 보여 주었다 인간 피브린 실란트검출 부작용 24을 도출하지 않고 척수를 가로로 subtotally에서 축삭 재생을 향상시킬 수있는 biomatrix 역할을 할 수 있습니다. 우리는 이전 만성 척수 손상 (17)에 이식을위한 골수 간질 세포를 포함하는 피브린 매트릭스를 사용 하였다. 이식 세포는 만성 병변 사이트에서 잘 살아 호스트 척수 실질 (17)와 잘 통합. 따라서, 우리는 가로로 척수에있는 대형 오픈 병변 사이트에 이식 NSCs의를 포함하는 섬유소의 사용을 확장했다. 그라프 NSCs의 생존이 섬유소 개선 있지만, 그라프 NSCs의 생존이 다소 변수 남아 NSCs의이 거의 완전히 큰 병변 공동 작성하지 이식.
따라서 우리는 병변 사이트에서 NSCs의 생존과 확산을 강화하기위한 노력의 일환으로 성장 인자의 칵테일을 추가했습니다. 성장 인자는 생체 외 25 NSCs의를 지원하기 위해 수많은 연구에서 밝혀졌다. WHI르 NSCs의의 문화로 성장 요인의 추가는, 자신의 운명을 바꿀 수 성장 인자 칵테일 성장 인자없이 그 부분적으로 살아 이식에 비해 이식에 추가 될 때 우리는 질적으로 신경 세포 밀도에 명백한 변화를 감지하지 않았다. 우리는 확실하게 세포의 운명에 대한 성장 인자 칵테일의 영향을 평가하기 전에 더 자세한 분석이 필요합니다. 정상적인 신경 발달하는 동안, 신경 세포의 생존과 성장은 종종 대상 조직 가이드 축삭의 성장에 의해 발표하고, 일부의 경우, 신경 세포의 생존 (26)에 영향을 미칠하는 신경 영양 요소에 따라 달라집니다.
유사하지만 더 간단한 성장 인자의 칵테일을 시험 관내 및 생체 내에서 모두 15,16 NSCs의 생존과 분화를 향상시키기 위해 다른 그룹에 의해 이용되어왔다. 이러한 노력은 일반적으로 우리가 채택한 여러 요인의 접근 방식보다 광범위한 NSC의 생존에 성공. 이 개발에 필수적인 다음 단계노력은 NSC의 생존, 진행의 노력을 지원하기 위해 필수적인 칵테일 성장 인자 목록의 범위를 제한하는 것입니다. 이 성장 인자의 더 제한된 수의 이식 생존율, 인체 실험이 실험 방법 및 그것의 잠재력 번역을 단순화 것 발견의 동등한 학위를 지원하는 것이 전적으로 가능하다.
피브린 매트릭스 및 성장 인자의 칵테일의 사용에 더하여, 심한 병변 사이트에 대한 생체 내에서의 그 래프팅 성공 병변 사이트의 기계적 요인에 의존 할 수있다. 우리는 기계적으로 병변 사이트에 접목 세포를 유지하기위한 노력의 일환으로 병변 및 이식 후 쥐 척수, 위에 놓 매우 얇은 경막 멤브레인의 무결성을 유지하기 위해 갖은 노력을한다. 따라서, 우리는 병변 사이트의 일관된 셀 충전을 최적화하기 위해 신중하고 근면 한 노력을합니다. 이러한 여러 노력하지 않고, 이식 충전이 완전하지 않습니다. 이 기술은 광범위한 Practi와이 필요CE.
다른 사람에게이 기술을 가르 칠 시도에서 우리는 몇 가지 문제를 확인했습니다. 세포가 숙주 척수 대신 병변 공동 내로 주입되면, 세포는 우선적 교세포로 분화있다. 이 경우, 새로운 축삭의 수는 크게 감소된다. 신중과 근면은 앞 단락에서 설명한 여러 기술 및 방법을 이용하여 병변 공동을 채우도록 구성하지 않으면, 세포 생존 덜 일치하고 축삭 파생물 등 생물학적 반응은 제한적이다. 따라서 성공적으로이 방법을 사용하려면 상당한 시간, 노력과 세심한 기술을 투자하는 것이 필수적입니다. 기술이 획득되면, 결과는 중추 신경계의 병변 사이트에서 이러한 NSCs의의 놀라운 생물학적 특성을 연구 할 수있는 능력을 산출, 동물에서 동물에 매우 일치한다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 쥐 자원 연구 센터 감사, 미주리 대학, 컬럼비아, 미주리, GFP 쥐를 제공; 인간의 신경 줄기 세포를 제공하는 Neuralstem 사. 이 작품은 재향 군인회, NIH (NS09881), 캐나다의 척추 연구 기관, 크레이그 H. Neilsen 재단, 그리고 버나드와 앤 스피처 자선 신탁에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
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