Summary
Fibrin matricer indeholdende vækstfaktorer blev brugt til at tilbageholde påhæftede neurale stamceller i lokaliteter af komplette rygmarv transection. Transplanterede celler helt fyldt læsionen hulrum og differentieres i flere neurale celletyper, herunder neuroner, der udvidede axoner i værtscelle rygmarven over lange afstande.
Abstract
Neurale stamceller (NSC), kan selv forny og differentiere i neuroner og glia. Transplanterede NSC kan erstatte mistede neuroner og glia efter rygmarvsskade (SCI), og kan danne funktionelle relæer til at re-forbinde rygmarv segmenter over og under en læsion. Tidligere undersøgelser grafting neurale stamceller er blevet begrænset af ufuldstændig transplantatoverlevelse i rygmarven læsion hulrum. Endvidere sporing af transplantat celleoverlevelse, differentiering og proces forlængelsen var ikke blevet optimeret. Endelig i tidligere undersøgelser, dyrkede rotte NSC blev typisk rapporteret at differentiere til glia når podet til de sårede rygmarv, snarere end neuroner, medmindre skæbne blev drevet til en specifik celletype. For at løse disse problemer, har vi udviklet nye metoder til at forbedre overlevelsen, integration og differentiering af NSC til steder med selv svær SCI. NSC var frisk isoleret fra embryonale dag 14 rygmarv (E14) fra en stabil transgen Fischer 344 rotte linje udtrykker grøn fl, fluorescerende protein (GFP) og blev indlejret i fibrin matrix indeholdende vækstfaktorer; denne formulering har til formål at fastholde podede celler i læsionen hulrum og understøtte celleoverlevelse. NSC i fibrin / vækstfaktor cocktail blev implanteret to uger efter, thorax niveau-3 (T3) komplette rygmarvsskader transections og derved undgå spidsbelastningsperioder på inflammation. Resulterende podninger helt fyldt læsionen hulrum og differentieret i både neuroner, som udvidede axoner i værten rygmarven løbet bemærkelsesværdigt lange afstande, og glia. Transplantater af dyrkede humane NSC udtrykker GFP resulterede i lignende fund. Således er metoderne defineret til forbedring af neural stamcelle podning, overlevelse og analyse af in vivo resultater.
Introduction
Rygmarvsskade (SCI) ofte skader, der ikke kun hvide substans skrifter, der bærer signaler til og fra hjernen, men også den centrale grå stof, der forårsager segmentær tab af interneuroner og motoriske neuroner. Konsekvensen af SCI er tab af både motorisk og sensorisk funktion under læsionen. Desværre er den voksne centralnervesystemet (CNS) ikke spontant regenerere, hvilket resulterer i permanente funktionelle mangler 1. Derfor rekonstruktion af den skadede voksne rygmarven og forbedring i motoriske, sensoriske og autonome funktion er et vigtigt mål for SCI forskning. Neurale stamceller (NSC), enten direkte isoleret fra embryonale eller voksne CNS, er overbevisende kandidat celler til at erstatte tabte neuroner og glia. Desuden er disse celler har evnen til at danne nye funktionelle relæer genoprette axonal conduction over en læsionsstedet 2,3.
Til dato har der ikke været en detaljeret belysning af anatomiske, electrophysiological og adfærdsmæssige effekter af neuronal relæ dannelse af transplanteret NSC efter alvorlig SCI. Der er flere grunde til dette: For det første, transplanterede NSC eller føtal CNS væv overleve dårligt når de er podet i store læsioner hulrum. Tidligere undersøgelser viser betydelige tab tidligt celle, der forlader store tomme cystisk læsion hulrum 4,5. I nogle studier vil de podede celler efterfølgende dele sig og fylde læsionen hulrum 4,5, men dette kan ske efter en forsinkelse på dage til uger, og efterfølgende læsionssted påfyldning muligvis ikke være komplet eller konsekvent. For det andet blev et effektivt tracking system, der giver pålidelige oplysninger om cellulær overlevelse, differentiering / modning, og udvækst af transplanteret NSC mangler. De fleste tidlige undersøgelser udnyttet antegrad og retrograd mærkning at spore axonale fremskrivninger fra transplantationer 2,3. Men disse teknikker kun delvist og ofte utydeligt mærket axonale fremskrivninger skyldes podede celler og tracer metoder er subject artefakter forårsaget af farvestoflækage over de implanterede celler. Andre grupper brugte menneskelige specifikke neuronale markører til at mærke axonale fremskrivninger efter transplantation af humane føtale NSC i såret gnaver rygmarv 5,6. Men i disse studier xenotransplantaterne ikke konsekvent overleve godt. For nylig blev viral levering af GFP-reportergenet anvendes til at mærke dyrkede NSC 7,8. Men GFP udtryk var ofte usammenhængende og kan nedreguleret 7. For nylig anvendelsen af transgene donor mus eller rotter, der stabilt udtrykker reportergenet, GFP eller human placental alkalisk phosphatase, har forbedret sporing af transplanterede neurale stamceller / stamceller in vivo 9,11. For det tredje, flere undersøgelser tyder på, at in vitro-dyrkede rotte NSC udvundet af enten embryonale eller voksne CNS udelukkende differentiere i gliøse slægter når transplanteres ind i miljø i intakte eller tilskadekomne voksen spinal cord 7,12,13, trods det faktum at disse neurale stamceller er i stand til at differentiere til både neuroner og glia in vitro, hvilket indikerer, at det lokale miljø kan diktere skæbne stamceller. Alternativt kan kulturperler NSC, især dem, der stammer fra voksne CNS, har iboende defaulty egenskab til at differentiere til gliøse slægter in vivo 13.
På grund af de begrænsninger diskuteret ovenfor, vores gruppe for nylig udviklet en ny protokol til forbedring af embryonale NSC tracking, overlevelse og differentiering / modning i de alvorligt tilskadekomne voksne rygmarven. Kort, vi begyndte med en stabil transgen Fischer 344 rotte indavl der udtrykker et GFP reporter gen, der opretholder GFP udtryk efter in vivo transplantation 14. Dernæst brugte vi frisk isolerede NSC fra embryonale dag 14 Fischer 344 rygmarv, et udviklingstrin, der bevarer potentiale til at generere både neuroner og glia. Endelig har vi indlejretfrisk dissocierede NSC i en fibrin matrix indeholdende vækstfaktorer 15-17 at fastholde cellerne og jævnt distribuere dem i en stor læsion hulrum, der sigter på at støtte graft celle overlevelse, differentiering og integration. Transplantater blev placeret i lokaliteter af T3 komplet transektion to uger efter rygmarvsskade. Disse transplanterede celler konsekvent fyldt komplet transection sites og differentieret i rigelige neuroner, der udvidede stort antal axoner i vært rygmarven over lange afstande 18. Lignende resultater blev opnået ved anvendelse af dyrkede neurale stamceller grafts humane til immuno-deficiente rotter 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle animalske protokoller godkendes af VA-San Diego Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). NIH retningslinier for laboratoriedyr pleje og sikkerhed nøje. Dyrene har fri adgang til mad og vand hele studiet og er tilstrækkeligt behandlet for at minimere smerte og ubehag.
1. Fremstilling af fibrin komponenter indhold vækstfaktor Cocktails
- 25 mg rotte fibrinogen opløses i 0,5 ml PBS til opnåelse af 50 mg / ml 2x stamopløsning (se Materialer tabel). Fibrinogen er vanskeligt at opløse, og bør placeres i et 37 ° C inkubator eller vandbad og rystet hver 5-10 min i 1-2 timer.
- 100 FN rotte thrombin opløses i 2 ml 10 mM sterilt CaCl2 til opnåelse af 50 U / ml 2x stamopløsning.
- Opløs vækstfaktorer i PBS ved følgende koncentrationer for at opnå 100 ul stamopløsning: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (høj bestand koncentration som intratekal infusion in vivo
- 25 mg MDL28170 (calpaininhibitor) opløses i 1,3 ml DMSO for at opnå 50 mM DMSO stamopløsning, og derefter fortynde 50x i PBS for at opnå 1 mM stamopløsning.
- Bland 100 gl af hver vækstfaktor komponent og 100 pi MDL28170 (1 mM stamopløsning) til frembringelse af 1,000 pi vækstfaktor cocktail opløsning (figur 1).
- Bland 500 ul fibrinogen 2x stamopløsning med 500 vækst pi faktor cocktail for at opnå 25 mg / ml fibrinogen arbejder opløsning indeholdende vækstfaktorer og alikvot i 10 eller 20 pi til opbevaring ved -70 ° C. Løsningen er stabil i op til 12 måneder ved -70 ° C.
- Ligeledes blande 500 ul thrombin 2x stamopløsning med 500 ul vækstfaktor cocktail for at opnå 25 U / ml thrombin arbejder opløsning indeholdende vækstfaktorer og alikvot i lignende mængder 10 eller 20 pi til opbevaring at -70 ° C i op til 12 måneder.
- På dagen for podning, placere fibrinogen-og thrombin-holdige vækstfaktor cocktails på is, indtil blandet med celler.
2.. T3 Spinal Cord transection
- Bedøver voksen kvindelige Fischer 344 rotter eller athymiske nøgne rotter ved hjælp af acceptable metoder. Emner er dybt bedøvet, når lydhørhed til hale og pote knivspids er helt fraværende. Bemærk: Vi bruger typisk 150-200 g Fischer-rotter eller 180-220 g athymiske rotter og en anæstesi cocktail (2 ml / kg) af ketamin (25 mg / ml), xylazin (1,3 mg / ml) og acepromazin (0,25 mg / ml).
- Anvend øjet salve for at forhindre tørhed eller tilskadekomst øjnene, mens dyrene er under bedøvelse.
- Barbere det øvre thorax område og rengør huden med Betadine.
- Skær huden og musklen hjælp # 15 klinge, eksponere T3 ryghvirvel ved hjælp af et kirurgisk retraktor, og udføre en laminektomi på T3 ryghvirvel at eksponere T3 / 4 rygmarven ved hjælp af et rongeur.
- Lav en longitudinal midtliniesnit i dura omtrent 2 mm længde ved hjælp af en # 11 blad.
- Placer iridectomy saks under dura at skære højre laterale hele rygmarven. Lav en anden snit på samme side 1,5 mm mere cadually.
- Aspirer rygmarvsvæv mellem de to efterfølgende segmenter med en stump 23 G kanyle forbundet til moderat intensitet vakuum. Brug visuel kontrol for at sikre fuldstændig transection ventralt og sideværts. Dette vil fuldende en lateral hemisection.
- For at forlænge læsion til en fuld bredde rygmarv transektion placere spejl indsnit i den venstre hemicord. Forsøg på at efterlade dura intakt, bortset fra den første snit, for at bevare den faste graft / fibrin matrix i læsionsstedet når de er podet to uger senere.
- Suturere musklen, anvende antibiotisk pulver og hæfte huden.
- Injicer Ringer-laktat (3 ml), Bannamine (2,5-5 mg / kg) og Ampicillin (80-100 mg / kg) (se Materialer tabel) umiddelbart efter operationen og Maintain rotter i en varm inkubator indtil varmeregulering er genetableret.
- Tøm blæren og sprøjt Ringers og Ampicillin opløsning to gange dagligt for omkring to uger indtil oprettelsen af refleks blæretømning (figur 1B).
3.. Udarbejdelse af frisk dissocierede Embryonale Dag 14 Spinal Cord neurale stamceller
- Opnå indavl transgene GFP F344 rotter (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) fra Rat Resource og Research Center, University of Missouri.
- Injicer 40 ug des-Gly 10, [D-Ala 6]-luteiniserende hormon ethylamid (LHRH) fortyndet i PBS ved en koncentration på 200 ug / ml intraperitonealt (IP) pr modne kvindelige rotte (8 uger eller ældre) efter 2 -3 timers lys induktion til synkronisering af embryonindsamlingsteam.
- Parre sig med en moden GFP homozygot eller heterozygot hanrotte natten over 4 dage efter injektion.
- Saml embryoner på dag 13,5-14,5 postcoitus(Pc) i koldt HBSS buffer, undersøge GFP udtryk under en "NightSea" lommelygte og filter briller (BLS1 - BlueStar Lommelygte og model VG1 barriere filter) eller et fluorescerende mikroskop.
- Dissekere rygmarv ud aseptisk fra hver GFP-positive foster og fjerne overliggende meninges og fastgjort spinalganglier med iridectomy saks og fine guldsmede pincet.
- Saml de dissekerede rygmarv i 2 ml kold HBSS buffer i en 15 ml cornical rør og holde på is.
- Følg reference # 20 at adskille dissekeret rygmarv:
- Kort fortalt, tilsættes 2 ml 0,25% trypsin-EDTA til rør indeholdende dissekeret rygmarv (flere ledninger kan fordøjes sammen, 1 ledning kan generere nok celler til transplantat af et emne) og fordøje ved 37 ° C i 10-12 min.
- Stop trypsin reaktionen ved tilsætning af 10 ml DMEM indeholdende 10% FBS til røret og centrifugeres vævet ved 2.500 rpm i 2 min.
- Resuspender væv i 2 ml Neurobasal medium containing 2% B27, og udriv rygmarven væv ved hjælp af gradvist mindre flammepolerede Pasteur pipetter.
- Centrifuger cellerne ved 2.500 rpm i 2 min, resuspender i 2 ml Neurobasal medium indeholdende B27, og filter-celler med en 40 um celle filter si.
- Tæl cellerne med et hæmocytometer og opdele cellerne ligeligt i to Eppendorf-rør.
- Centrifuger cellerne og helt fjerne supernatanten (1-2 min er forpligtet til at trække alle supernatanten med et lavt vakuum spids), så vækstfaktor cocktails, vil ikke blive udvandet af resterende supernatanten efter celle re-suspension.
- Resuspender hver halvdel af cellerne i fibrinogen eller thrombin arbejder opløsning indeholdende vækstfaktorer, henholdsvis i en koncentration på 250.000 celler / mikroliter (cellepelleten tæller for omkring ⅓ endelig volumen) og læg dem på is før transplantation (figur 1A). Bemærk, at fibrinogen spontant kan gelere, når det blandes med celles før kombination med thrombin på læsion / graft sted; at undgå for tidlig gelering, blandes cellerne i fibrinogen umiddelbart før celle transplantation in vivo.
4.. Transplantation
- Reexpose den læderede T3 / 4 rygmarven to uger efter, rygmarv overskæring.
- 5 pi fibrinogen-celler og 5 thrombin-celler ul direkte kunne injiceres i ni punkter læsionssitet gennem forseglede arvæv og intakt dura uden genåbne læsion site.
- Brug en 27 G kanyle til at skabe 9 huller på overfladen af arvæv og intakt dura 1-2 uger efter læsion: 3 i centrum (én i midterste punkt og to i stikledninger og afstand 0,5 mm fra hinanden), og 3 i begge rostral og 3 caudale interface (omkring 0,5 mm rostralt eller caudale til centrum af læsion).
- Så injicere halvt volumen af fibrinogen celle løsning i tre centrale punkter i læsionssted og en fjerdedel volumen i 3 punkter i rostral interface og aquarter volumen i 3 punkter i caudale interface.
- Så straks injicere throbmbin celler i de samme pletter. Blandingen af fibrinogen celler og thrombin celler inde læsionsstedet vil danne fibringel at holde cellerne i læsion websted og vækstfaktor cocktails vil støtte overlevelsen af celler. Celler injiceres ved brug trækkes glaspipetter forbundet til en PicoSpritzer (General Valve, Inc.).
- Transplant dyrkede humane NSC 21 i den samme procedure som beskrevet ovenfor, og bruge fibrin og vækstfaktor-cocktails fra humane reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP immunhistologisk mærkning viser, at transplanterede rotte NSC resuspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS) (der mangler en fibrinmatrix og vækstfaktorer), overlevede dårligt i T3 transection site, kun er knyttet til læsionen / vært margin og forlader det meste af læsionsstedet tomt uden transplanterede celler (figur 2A). Overlevelsen af NSC forbedret, når co-podet med fibrin-matricer alene, men transplantatet ikke fuldstændigt at fylde en stor læsion hulrum (data ikke vist). Derfor har vi indlejret NSC i fibrin matricer indeholdende vækstfaktor cocktails til at forbedre deres overlevelse, påfyldning af store læsioner hulrum og differentiering i neuroner og glia efter rygmarv transection 15-17. Podninger enten rotte eller menneskelige NSC konsekvent og fuldstændigt udfylde læsionen hulrum, når det vurderes syv uger efter podning 18 (figur 2B-C).
Vi udførte en tidsforløb undersøgelse for at undersøge tidligtoverlevelse og påfyldning af læsionen hulrum efter podning af NSC indlejret i fibrin matricer med vækstfaktor cocktails. Histologisk analyse viste, at GFP-udtrykkende NSC overlevede godt 24 timer efter transplantation (figur 3A-B). Den podede NSC gradvist mere tæt over tid fyldes helt gennemskåret læsion hulrum ved den første uge efter transplantation sandsynligvis proliferation 21 (fig. 3C-H). Desuden podet NSC godt integreret på vært / læsion interface og syntes at reducere områder af GFAP immunreaktivitet på randen af læsionen hulrum (Figur 3).
En del af podede NSC differentieret i Neun-udtrykkende neuroner syv uger efter transplantation (figur 4A-B). Desuden graft-afledte rygmarvsneuroner forlænget mange axoner i værten rygmarven i både rostralt og caudal retninger over lange afstande 18 < / Sup> (figur 4C). Podede afledte axoner forlænget rostrally og caudally gennem både hvide substans og grå stof i værtslandet rygmarv (figur 4D-E).
Figur 1.. Experimental Skematisk og Time Line. A) Skematisk tegning tilpasset fra Popovich 22 (Cell, 2012) illustrerer transplantation af neurale stamceller med fibringel indeholdende vækstfaktor cocktail til helt transected rygmarven. B) Eksperimentel tid linje. Adfærdsmæssige og electriophysiological analyser kan udføres efter celle podning og før perfusion. Overlevelsestiden af emner kan være variabel. Klik her for at se større figur .
.. Figur 2. Overlevelse og påfyldning af neural stamcelle grafts i T3 Komplet transection Sites GFP og GFAP fluorescerende immunolabeling i vandrette sektioner viser (A) dårlig overlevelse rotte E14 NSC (grøn) re-suspenderet i PBS mangler vækstfaktorer og fibrinmatrix; BC) Fremragende overlevelse og fuldstændig fyldning af læsion hulrum, når (B) rotte-eller (C) humane NSC blev indlejret i fibrin-matricer indeholdende vækstfaktor cocktails. Cell blev podet ind T3 transection sites i 7 uger. Scale bar, 310 mM. Klik her for at se større figur .
6.5in "src =" / files/ftp_upload/50641/50641fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Fig. 3. Graft Survival på tidlige tidspunkter. AB) GFP og GFAP dobbelt immunolabeling show overlevelse og distribution af podede rotte NSC i transection site, en dag efter implantation i en fibrin matrix. Boxed område i A er vist ved større forstørrelse i panel B. CD) Cell overlevelse og distribution er også tydelig på dag 2 og (EF) Dag 3 efter podning. GH) Ved 7 dage, celler fylde læsionssted og er tættere. Målestokken: A, C, E, G, 300 m; B, D, F, H, 62 mM. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Differentiering og udvækst af Neural Stem Cell grafts i T3 Complete transection site. AB) GFP og Neun mærkning bekræfter omfattende neuronal differentiering / modning af podet rotte neurale stamceller 7 uger efter podning. C) GFP og Neun immunolabeling viser, at GFP-udtrykkende neurale stamceller transplantater udvide mange axoner i værten rygmarv rostralt og caudale til transection stedet (caudale vist), to uger efter podning. DE) Højere forstørrelse fra boxed områder af panel C, viser, at omfattende regioner af værten rygmarven indeholder graft-afledte axonale projektioner i både hvide substans og grå substans. Målestokken: AB, 62 m; C, 700 m; DE, 62 mM. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En af de store forhindringer for NSC transplantation i såret rygmarven er dårlig overlevelse i læsionen center. Eventuelle huller eller hulrum i læsionssted potentielt kunne reducere eller svække dannelsen af funktionelle neuronale relæer mellem supraspinale axoner og adskilt rygmarv segmenter under skaden. Desuden kan ringe overlevelse af podede NSC påvirke deres integration med værtsvæv, og derfor reducere tilslutning af podede neuroner med værten neuroner. Potentielle mekanismer til at forklare celle tab omfatter cytotoksiske miljø skabt af akut SCI, sekundær degeneration af værten rygmarven, og utilstrækkelig vaskularisering af sårede område 4.
Fibrin har været anvendt til at levere celler, lægemidler og vækstfaktorer i forskellige eksperimentelle modeller og kliniske anvendelser, da det kan bevare celler og molekyler, når det bliver polymeriseret 23. En tidligere undersøgelse viste, at menneskelig fibrintætningsmiddelkan tjene som en biomatrix at styrke axon regenerering i subtotally transected rygmarven uden at fremkalde påviselige bivirkninger 24. Vi har tidligere brugt fibrin matricer til at indlejre knoglemarvsstromaceller til transplantation til kronisk skadet rygmarv 17.. Transplanterede celler overlevede godt i den kroniske læsionssted og godt integreret med vært rygmarven parenkym 17. Derfor udvidede vi brugen af fibrin at integrere NSC til transplantation i store åbne læsioner steder i transected rygmarven. Selv om overlevelse påhæftede NSC forbedret med fibrin forblev overlevelse påhæftede NSC noget variabel og podet NSC sjældent helt fyldt stor læsion hulrum.
Vi har derfor tilføjet en cocktail af vækstfaktorer i et forsøg på at øge overlevelse og proliferation af NSC i læsionsstedet. Vækstfaktorer er blevet påvist i mange undersøgelser til støtte for NSC in vitro 25. While tilsætning af vækstfaktorer til kulturer af NSC kan ændre deres skæbne, vi ikke kvalitativ påvisning tilsyneladende ændring i neuronal tæthed når vækstfaktor cocktails tilføjet til graft sammenligne dem delvist overlevede graft uden vækstfaktorer. En mere detaljeret analyse er nødvendig, før vi kan sætte pris med sikkerhed indflydelse af vækstfaktor cocktails på celle skæbne. Under normal neurale udvikling, overlevelse og vækst af neuroner afhænger af neurotrofiske faktorer, der ofte frigives af målvæv guide vækst axon, og i nogle tilfælde påvirke neuronal overlevelse 26.
Lignende, men enklere vækstfaktor cocktails er blevet anvendt af andre grupper, der kan forbedre overlevelse og differentiering af NSC både in vitro og in vivo 15,16. Disse bestræbelser har generelt resulteret i mindre omfattende NSC overlevelse end den faktor tilgang multiple, som vi har vedtaget. Et væsentligt næste skridt i denne udviklingindsatsen er at indsnævre listen af vækstfaktorer i den cocktail, der er afgørende for at støtte NSC overlevelse, en indsats, der er i gang. Det er absolut muligt, at et mere begrænset antal vækstfaktorer vil støtte lige grader af graft overlevelse, en konstatering, der ville forenkle denne eksperimentelle tilgang og dens potentielle oversættelse til humane studier.
Ud over anvendelse af fibrin-matricer og vækstfaktor cocktails, kan vellykket podning in vivo til den alvorlige læsionsstedet afhænge af mekaniske faktorer i læsionsstedet. Vi gør alt for at bevare integriteten af den ekstremt tynde dural membran, der ligger over gnaver rygmarven efter læsioner og podning, i et forsøg på mekanisk fastholde podede celler i læsion site. Således gør vi omhyggelige og flittige bestræbelser på at optimere konsekvent fyldning af læsionen webstedet celle. Uden disse mange bestræbelser, graft påfyldning er ufuldstændig. Disse teknikker kræver omfattende prakce.
I forsøget på at lære denne teknik til andre, har vi identificeret nogle udfordringer. Hvis celler injiceres i værten rygmarven stedet af læsionen hulrum, så celler kan fortrinsvis differentiere i glia. I dette tilfælde er antallet af nye axoner stærkt reduceret. Hvis stor omhu og flid ikke er lavet til at fylde læsionen hulrum ved hjælp af de mange teknikker og metoder, der er beskrevet i de foregående afsnit, celle overlevelse er mindre konsekvent og biologiske reaktioner, herunder axon udvækst, er begrænsede. Således er det vigtigt at bruge en stor tid, flid og omhyggelig teknik at kunne bruge disse metoder. Når teknikker er erhvervet er resultaterne meget ensartet fra dyr til dyr, hvilket giver evnen til at studere de bemærkelsesværdige biologiske egenskaber af disse NSC i centralnervesystemet læsionsområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Rat Resource og Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, for at give GFP rotter; Neuralstem Inc. til at tilvejebringe humane neurale stamceller. Dette arbejde blev støttet af Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, The Craig H. Neilsen Fonden samt Bernard og Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF (human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
| Note, use human reagents for grafts of human NSCs | |||
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
