Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50729
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

Summary

المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة.

Abstract

المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. وتشمل البروتوكولات الحالية لمعالجة هذه الأسئلة فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. العد مستعمرة وحماية الجنتاميسين فحوصات تقييم الجدوى فقط من السكان البكتيرية كامل وغير قادر على تحديد الجدوى البكتيرية الفردية. ويمكن استخدام المجهر الإلكتروني لتحديد الجدوى من البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن التوطين في الخلايا المضيفة. ومع ذلك، في كثير من الأحيان بكتيريا عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات، مما يجعل من الصعب تقييم الجدوى. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة. وقد وضعت هذه المقايسات أصلا لتقييم بقاء النيسرية البنية في العدلات الإنسان الأساسية، ولكن ينبغي أن يكونpplicable إلى أي تفاعل الخلية البكتيريا في استضافة. الجمع بين هذه البروتوكولات الأصباغ الفلورية غشاء نفاذية (SYTO9 و4 '،6-diamidino-2-phenylindole [دابي])، والتي وصمة عار جميع البكتيريا، مع الأصباغ غشاء كتيمة الفلورسنت (يوديد propidium وSYTOX الأخضر)، والتي يمكن الوصول إليها فقط ل البكتيريا غير قابل للحياة. قبل permeabilization الخلية حقيقية النواة، يتم إضافة الجسم المضاد أو كاشف الفلورسنت لتحديد البكتيريا خارج الخلية. وبالتالي هذه المقايسات تميز جدوى من البكتيريا تمسكا وداخل الخلايا حقيقية النواة. ويرد البروتوكول أيضا لاستخدام الأصباغ جدوى في تركيبة مع الأجسام المضادة لعلامات الفلورسنت خلية حقيقية النواة، من أجل تحديد توطين التحت خلوية من البكتيريا الفردية. الأصباغ البكتيرية الجدوى مناقشتها في هذه المقالة هي تكملة الحساسة و / أو بديل لتقنيات علم الأحياء المجهرية التقليدية لتقييم جدوى البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن مكان البقاء على قيد الحياة البكتيريا في الخلية المضيفةق.

Introduction

هناك ديناميكية التفاعل والتطور المشترك بين البكتيريا والمضيفين التي يقيمون فيها. وقد تطورت البكتيريا العضيات الالتزام، ونظم إفراز و / أو القدرة على إنتاج السموم التي تمكن العدوى الإنتاجية الخاصة بهم من أكلة المضيف والخلايا غير البلعمية. يجب على البكتيريا أيضا يتعامل مع الاعتراف والأنشطة المضادة للميكروبات الجهاز المناعي المضيف. ويتألف الجهاز المناعي مجموعة من المكونات الفطرية والتكيفية بما في ذلك الحواجز الفيزيائية والكيميائية، الخلايا المناعية، ونظام مكمل، وغيرها من عناصر الحصانة الخلطية. بينما العديد من أنواع البكتيريا هي عرضة للقتل والتطهير من قبل المضيف المناعي استجابة متعددة الطبقات، تطورت بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمراض الانتهازية وآليات لتصيب مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة وتخريب التخليص من قبل المضيف المناعي استجابة 1. النيسرية البنية هو مثال واحد من العوامل المسببة للأمراض البكتيرية التي يتم تكييفها للغاية أن تستمر في المضيف الإنسان. N. البنية يستعمر بسهولة السطوح اللمعية من الخلايا الظهارية المخاطية من الجهاز البولي التناسلي والبلعوم والملتحمة، والمستقيم. الاستعمار يتسبب في التوظيف وفيرة من العدلات في مواقع المخاطية. العدلات هي البالعات المهنية التي تمتلك مجموعة متنوعة من العمليات المضادة للجراثيم لقتل الكائنات الحية الدقيقة، ومع ذلك، N. البنية غير قادرة على البقاء في وجود العدلات 2-5. فهم كيفية مسببات الأمراض البكتيرية مثل N. البنية تخريب، وقمع، وخطف الاستجابة المناعية البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف في بيئات معادية المضيف عادة هو أمر حاسم في تطوير علاجات جديدة لمكافحة الأمراض المعدية.

البروتوكولات التجريبية غالبا ما تستخدم للتحقيق بقاء البكتيريا في الخلايا المضيفة تشمل فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. في فحوصات العد مستعمرة، ويبلغ عدد سكانها هي lysed الخلايا المصابة (على سبيل المثال، مع المنظفات لذوي الخوذات البيضاءمعنوى البكتيريا مقاومة) لتحرير البكتيريا. وتضعف لست] ومطلي على وسائل الاعلام القائمة على أجار، ويتم تعداد الوحدات المكونة للمستعمرة في لست] لكل نقطة زمنية و / أو حالة تجريبية. هذا النهج تقارير الجدوى من السكان البكتيرية بأكمله ولكن غير قادر على التفريق بين الخلايا والبقاء على قيد الحياة خارج الخلية. وهناك تباين في مقايسة العد مستعمرة، مقايسة حماية الجنتاميسين، يقيس على وجه التحديد بقاء البكتيريا داخل الخلايا، استنادا إلى عدم قدرة جنتاميسين مضاد حيوي لعبور حقيقية النواة غشاء البلازما 6. ومع ذلك، هذا الاختبار يعتمد على البكتيريا كونها عرضة للقتل من قبل جنتاميسين (أو مضاد حيوي آخر هو بالمثل حقيقية النواة غشاء impermeant) وعدم قدرة المضاد الحيوي على الوصول إلى البكتيريا الداخلية. وبالتالي، مقايسة حماية الجنتاميسين قد لا تكون فعالة لفحص كل أنواع البكتيريا أو عند النظر في البقاء على قيد الحياة البكتيرية للغايةخلايا pinocytic مثل العدلات. لم يكن أي من هذه الطرق يكشف توطين التحت خلوية أو أي سلوك آخر من البكتيريا الفردية (على سبيل المثال إذا كانت البكتيريا تشكيل المجاميع أو microcolonies أن تتصرف بشكل مختلف من الخلايا البكتيرية الفردية). آخر النهج كثيرا ما تستخدم لدراسة الجدوى من البكتيريا الخارجية والداخلية الفردية رقيقة المقطع انتقال الإلكترون المجهري (TEM). هذا النهج هو مفيد من حيث أنه يمكن أن توفر معلومات بشأن مكان وجود البكتيريا في الخلايا المضيفة (مثل يبلوع، السيتوبلازم، جسيم بلعمي ذاتي)، والتي يمكن أن تحقق مزيدا من immunoelectron المجهري مع الأجسام المضادة إلى جانب الذهب ضد علامات التحت خلوية. ومع ذلك، المجهر الإلكتروني ليست حساسة ولا سيما في تقييم الجدوى البكتيرية. عندما يتم ملطخة أقسام جزءا لا يتجزأ مع خلات اليورانيل، سترات الرصاص، أو غيرها من الكواشف الإلكترون الكثيفة والتقط بواسطة المجهر الإلكتروني، وتعتبر البكتيريا الإلكترون كثيفة قابلة للحياة وكهربائيTRON-وسنت غير قابل للحياة 7،8. ولكن هذا الافتراض يغالي بقاء البكتيرية، ومنذ تلك البكتيريا الميتة فقط مع الأغشية تعطلت بشدة وتخلو من السيتوبلازم تظهر الإلكترون لوسنت. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض الأنواع البكتيرية عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات اعتمادا على مرحلة نموها، مما يجعل من الصعب تحديد الجدوى.

كبديل أو بالإضافة إلى هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع، وهنا نقدم بروتوكولات والأساس المنطقي لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تشير إلى بقاء البكتيرية لتقييم بقاء البكتيريا التي تعلق على والمنضوية بواسطة الخلايا المضيفة. لتحديد البكتيريا خارج الخلية يتم، أولا، تتعرض الخلايا المصابة إلى كاشف الفلورسنت، مثل كتين أو الأجسام المضادة البكتيريا محددة. ثم يتم permeabilized الخلايا المصابة والمعرضة للالأصباغ الحمض النووي المحددة التي يمكن الوصول إليها بشكل مختلف للبكتيريا مع الأغشية سليمة مقابل المتدهورة، كبديل للبقاء البكتيرية. في ع الأولrotocol، يحدد غشاء منفذ صبغ SYTO9 مجموع السكان البكتيرية، في حين يوديد propidium هو فقط للوصول الى تلك البكتيريا التي أثرت سلبا الأغشية، وبالتالي فهي تعتبر غير قابل للحياة. وقد استخدمت يوديد propidium وSYTO9 لتقييم الجدوى البكتيرية في الأغشية الحيوية، تميز الممرضة من بكتيريا غير إمراضية، وتعداد البكتيريا التي تنتقل عن طريق المياه قابلة للحياة 9-12. في البروتوكول الثاني، 4 '، 6'-diamidino-2-phenylindole (دابي) يحدد مجموع البكتيريا، في حين SYTOX الأخضر هو فقط للوصول الى السكان غير قابل للحياة. هذه الأزواج بقاء الصبغة يمكن الجمع بين المناعي لتحديد موقع كل البكتيريا في ما يتعلق بروتين من الفائدة، على سبيل المثال لتعريف توطين التحت خلوية البكتيرية. استخدام هذه المقايسات يقدم رؤية المفتاح في التفاعلات التي تؤدي إلى قتل البكتيريا أو البقاء على قيد الحياة خلال العدوى من الخلايا المضيفة. تم استخدام البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة لتقييم جدوىN. البنية التي يتم تركيبها داخل والعدلات الإنسان الأساسية، بما في ذلك مجموعات مختلفة من phagosomes العدلة 5،13،14. ومع ذلك، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها لتقييم الجدوى من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام في البالعات المهنية، البالعات غير المهنية، والبروتوزوا 15-24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تقييم البكتيرية الجدوى مع يوديد propidium وSYTO9

  1. تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا من الفائدة. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية.
  2. شطف بلطف خلايا مرة واحدة في 0.1 م 3 - (N-morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف)، ودرجة الحموضة 7.2، يحتوي على 1 ملم MgCl 2 (اجتماعات الأطراف / MgCl 2).
  3. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية.

ملاحظة: يتحكم السلوك مع البكتيريا الحية والميتة، في غياب الخلايا المضيفة، لإظهار أن كتين أو الضد من مصلحة ملزم لجميع البكتيريا بغض النظر عن الجدوى (الشكل 1).

  1. شطف الخلايا مرتين مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  2. نضح مالقانونين من الخلايا وإضافة 0.5 مل لايف / الميت تلطيخ الحل. الحية / الميت تلطيخ الحل هو 5 ميكرومتر SYTO9، 30 ميكرومتر يوديد propidium، و 0.1٪ سابونين (تركيزات النهائي) في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  3. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  5. coverslips قلب وجهه لأسفل على الشرائح الزجاجية وختم بطلاء الأظافر واضحة. لا تستخدم وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
  6. الحصول على صور في غضون 30 دقيقة، وذلك باستخدام المجهر مضان مع مجموعات مرشح متوافق مع الأخضر والأحمر، والأحمر حتى الحصول على الصور.

ملاحظة: كلا التقليدية المجهري مضان، ويمكن استخدامها متحد البؤر المسح المجهري بالليزر. بعد 30 دقيقة تبدأ الأصباغ الفلورية لتسرب من البكتيريا والتي لم تعد البيانات المكتسبة دقيقة. تم الحصول على الصور المبينة في هذه المادة على نيكون الكسوف E800 مضان المجهر تستقيم مع كاميرا رقمية هاماماتسو أوركا-ER باستخدام برنامج Openlab. تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وباطل اللون الأزرق. تم الكشف عن مضان من يوديد propidium باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 540-580 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 600-660 نانومتر. تم الكشف عن مضان من SYTO9 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر.

  1. وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية أزرق + أحمر، تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الداخلية الحمراء فقط، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر أزرق + أخضر، والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر خضراء فقط. عد بالعين أعداد البكتيريا التي هي غير قابل للحياة الخارجية، الداخلية غير قابل للحياة، قابلة للحياة الخارجية، والداخلية قابلة للحياة.
  2. حساب في المئة من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية بقسمة عدد من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية من العدد الكلي للبكتيريا الخارجية (قابلة للحياة بالإضافة إلى nonviقادرة). حساب في المئة من البكتيريا الداخلية قابلة للحياة بقسمة عدد من البكتيريا الداخلية قابلة للحياة من العدد الكلي للبكتيريا الداخلية (قابلة للحياة بالإضافة إلى غير قابل للحياة) (الشكل 4).
  3. هناك نوعان من الضوابط الأساسية لأداء مع هذا البروتوكول. أولا، تحقق من أن كل البكتيريا غير قابل للحياة هي propidium يوديد-الإيجابية وجميع البكتيريا الحية هي SYTO9 إيجابية. وينبغي أن يكون ثقافة منتصف لوغاريتمي من البكتيريا (في حالة عدم وجود أية خلايا المضيف)> 95٪ SYTO9 إيجابية. هو مبين في الشكل 2 هي ثقافة منتصف لوغاريتمي من N. البنية (في 10 وحدة في مستعمرة 8 مل تشكيل) حضنت مع لايف / الميت تلطيخ الحل. الثانية، التحقق من أن كل من يوديد propidium وSYTO9 يمكن أن تدخل permeabilized، الخلايا المضيفة المصابة.
    1. لتوليد السكان من البكتيريا الميتة، وجمع 2 × 10 8 مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة في 1.5 مل microfuge أنبوب، إضافة 70٪ الأيزوبروبانول والجلوس لمدة 10 دقيقة. بيليه البكتيريا في microfuge لالثانية يغسل البكتيريا مرتين في برنامج تلفزيوني لإزالة الأيزوبروبانول المتبقية. ثم اتبع الخطوات بروتوكول 1،5-1،7. إضافة 5 ميكرولتر من تعليق البكتيرية لشريحة زجاجية وتراكب مع ساترة. عينات الصورة كما في البروتوكول الخطوة 1.9. في ظل هذه الظروف، يجب أن يكون 100٪ من السكان يوديد propidium إيجابية (الشكل 2). في بعض الأنواع البكتيرية، يوديد propidium قد لا تطغى تماما SYTO9 تلطيخ، وغير قابل للحياة قد تظهر البكتيريا الأصفر أو البرتقالي.
    2. لخلايا البلعمة مثل العدلات، تعرض الخلايا لقتل البكتيريا الأيزوبروبانول والتأكد من أن 100٪ من البكتيريا داخل الخلايا هي propidium يوديد إيجابية-(الشكل 3). لخلايا nonphagocytic التي قد لا تستوعب البكتيريا الميتة، قد تكون كافية لعلاج الخلايا المصابة مع أزيد الصوديوم أو غيرها من العوامل المضادة للجراثيم خلايا نفيذ قبل مضيفا ايف / الميت تلطيخ الحل.

2. تقييم الجدوى البكتيرية مع SYTOX GREEن ودابي

  1. البكتيريا التسمية في المصالح مع 10 ميكروغرام / مل دابي في مورس معرفة متوسطة 25 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  2. تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا دابي المسمى. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية.
  3. شطف خلايا مرة واحدة مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  4. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية. انظر الملاحظة في البروتوكول الخطوة 1.3 لعناصر المقترحة.
  5. وسائل الإعلام نضح من الخلايا وإضافة 0.5 مل 0.4 ميكرومتر SYTOX الخضراء في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  6. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  7. شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  8. غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق.

ملاحظة: تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وغير صحيح اللون الأحمر. تم الكشف عن مضان من SYTOX الأخضر باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر. تم الكشف عن مضان من دابي باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 355-375 نانومتر ومرشح حاجز 400 نانومتر.

  1. وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية الحمراء + الخضراء والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر أخضر + أزرق، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر أحمر + أزرق، والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر الزرقاء فقط (الشكل 4). قياس المئة من البكتيريا الخارجية والداخلية كما هو موضح في البروتوكول الظريفص 1.11.
  2. وتحدد الضوابط المبينة في البروتوكول خطوة 1.12 ينبغي أن يقوم مع دابي / SYTOX الأخضر صبغ مزيج (الشكلين 2 و 3).

3. تقييم الجدوى البكتيرية إلى جانب توطين التحت خلوية

  1. البكتيريا التسمية في المصالح مع 10 ميكروغرام / مل دابي في متوسطة مورس محدد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  2. تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا دابي المسمى. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية.
  3. شطف خلايا مرة واحدة مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  4. احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية. انظر الملاحظة في البروتوكول الخطوة 1.3 لعناصر المقترحة.
  5. وسائل الإعلام نضح من الخلايا وشطف خليتين منظمة الشفافية الدوليةMES في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  6. احتضان الخلايا مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-555 ضد علامة التحت خلوية من الفائدة لمدة 20 دقيقة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 تحتوي على 0.2٪ سابونين.
  7. شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  8. غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق.
  9. وسائل الإعلام نضح من الخلايا وإضافة 0.4 ميكرومتر SYTOX الخضراء في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  10. احتضان الخلايا 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  11. شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  12. غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق.
  13. الحصول على صور من الشرائح في غضون 30 دقيقة على المجهر مضان. انظر البروتوكول الخطوة 1.9 لوصف المجهر، والكاميرا الرقمية، والبرمجيات الاستحواذ.

ملاحظة: تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وتصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وباطل اللون الأرجواني. مضان وتم الكشف مدمج اليكسا فلور 555 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 540-580 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 600-660 نانومتر. تم الكشف عن مضان من SYTOX الأخضر باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر. تم الكشف عن مضان من دابي باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 355-375 نانومتر ومرشح حاجز 400 نانومتر.

  1. وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية الأرجواني + الخضراء والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر أخضر + أزرق، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر الأرجواني الأزرق + والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر الأزرق فقط، ويظهر بروتين التحت خلوية الحمراء (الشكل 4). قياس perecent من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية والداخلية كما هو موضح في البروتوكول الخطوات 1.11.
  2. وتحدد الضوابط المبينة في البروتوكول خطوة 1.12 ينبغي أن يقوم مع دابي / SYTOX الأخضر صبغ مزيج (الشكلين 2 و 3).
  3. فيبالإضافة إلى عد البكتيريا قادرة على البقاء وغير قابل للحياة، وتصنيف كل البكتيريا إما إيجابية أو سلبية على colocalization مع علامة التحت خلوية من الفائدة.
  4. حساب في المئة من البكتيريا قادرة على البقاء colocalized مع علامة التحت خلوية بقسمة عدد من البكتيريا قادرة على البقاء colocalized من العدد الكلي للبكتيريا قابلة للحياة. حساب في المئة من البكتيريا غير قابل للحياة colocalized مع علامة التحت خلوية بقسمة عدد من البكتيريا colocalized غير قابل للحياة من العدد الكلي للبكتيريا غير قابل للحياة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام البروتوكولات المحددة لدراسة بقاء N. البنية بعد التعرض لالإنسان الأساسية العدلات 5،26. أصيب العدلات مع N. البنية ومعالجتها مع بروتوكول 1، وذلك باستخدام الخضراء الفلورسنت SYTO9 الجدوى صبغ والحمراء الفلورسنت يوديد propidium (الشكل 4A). أضيفت الأصباغ في وجود سابونين، والتي تعزل الكولسترول لpermeabilize تفضيلي أغشية البلازما الخلية المضيفة، وليس N. الأغشية البنية. قد تحتاج المنظفات الأخرى لفحصها إذا أغشية البكتيريا التي تهم تحتوي على كميات عالية من الكولسترول. جميع N. البنية وصمة عار مع SYTO9، ولكن البكتيريا فقط مع الأغشية خطر وصمة عار مع يوديد propidium. يوديد propidium يتغلب على مضان SYTO9، لذلك تظهر البكتيريا الحية والميتة البكتيريا الخضراء تظهر الحمراء 27. في بعض الأنواع البكتيرية، يوديد propidium قد لا التغلب تماما SYTO9 staininز، مما أدى إلى ظهور البكتيريا الميتة الأصفر أو البرتقالي. قد تحتاج نسبة يوديد propidium لSYTO 9 إلى أن يكون الأمثل للأنواع البكتيرية المختلفة. قبل permeabilizing الخلايا وإضافة SYTO9 ويوديد propidium، تم إضافة فول الصويا إلى جانب اليكسا فلور-647 كتين إلى الخلايا المصابة للكشف N. خارج الخلية البنية، وإشارة مضان الحمراء حتى كان الأزرق كاذبة اللون. وهكذا، في هذا البروتوكول البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر الفيروز (أزرق + أخضر) وغير قابل للحياة الخارجية تظهر البنفسجي (أزرق + أحمر). البكتيريا قادرة على البقاء داخلية تظهر الخضراء فقط (السهم)، والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر حمراء فقط (رأس السهم). من المهم أن نلاحظ أنه في الخلايا المصابة، وسوف تكون ملطخة نواة الخلية حقيقية النواة من قبل SYTO9 ويوديد propidium ("N"، الشكل 4A). وتم قياس كمية وقابلة للحياة، غير قابل للحياة، والبكتيريا الداخلية الخارجية الخارجية قابلة للحياة، وغير قابل للحياة الداخلية من الصور مضان لتحقق في المئة من البكتيريا المنضوية لالثانية البكتيريا في المئة قابلة للحياة داخل الخلايا المضيفة وخارجها.

الرقم 4B هي صورة ممثل N. العدلات معالجتها مع بروتوكول 2 البنية المصابة، وذلك باستخدام الأصباغ جدوى SYTOX الأخضر ودابي. هذا البروتوكول يتجنب استخدام يوديد propidium التي تتفلور في كلتا القناتين الحمراء والأشعة فوق البنفسجية على المجهر مضان. جميع N. البنية وصمة عار مع دابي (الأزرق)، ولكن البكتيريا فقط مع الأغشية خطر وصمة عار مع SYTOX الأخضر. كما هو موضح أعلاه، قبل permeabilizing الخلايا، تم إضافة فول الصويا إلى جانب اليكسا فلور-647 كتين إلى الخلايا المصابة للكشف N. خارج الخلية البنية التي مضان في هذه الحالة هو كاذبة اللون الأحمر. وبالتالي، يبدو أن البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية البنفسجي (أحمر + أزرق) والبكتريا غير قابل للحياة الخارجية تظهر الصفراء (أحمر + أخضر / أزرق). البكتيريا قادرة على البقاء داخلية تظهر الزرقاء فقط (الأسهم)، والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر أخضر / أزرق (السهام). ديمعلقة على الكثافة النسبية للدابي مقابل SYTOX الأخضر مضان، قد تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الفيروز. مماثلة لخلايا يوديد propidium معالجتها مع وSYTO9، اتسخت نواة العدلة بواسطة SYTOX الأخضر ودابي في الشكل 4B (المشار إليها بواسطة "N"). تعرض الخلايا المصابة لSYTOX الأخضر ودابي يكشف عن استيعاب المئة وبقاء البكتيريا في الخلايا المضيفة، كميا كما هو موضح أعلاه ليوديد propidium وSYTO9. النتائج من N. معالجة العدلات البنية المصابة باستخدام SYTOX الأخضر ودابي هي مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها مع يوديد propidium وSYTO9 26.

كما هو مبين في الشكل 4C، والبروتوكول هو التكيف 3 من البروتوكول 2، الذي تم الجمع بين الأصباغ البكتيرية مع بقاء المناعي للبروتين العدلات الحبيبية الأولية أو أليف اللازورد CD63. وقد أجريت هذه التجربة من أجل تحديد تكوين حجرات يبلوع طالعدلات nside التي تحتوي N. قابلة للحياة أو غير قابل للحياة البنية 26. هذا البروتوكول يتطلب المجهر مضان لقدرة أربعة ألوان للكشف عن البكتيريا قادرة على البقاء، والبكتيريا غير قابل للحياة، والبكتيريا خارج الخلية، وعلامة التحت خلوية. منذ الأصباغ جدوى غير متوافقة مع تثبيت ألدهيد (الملاحظات غير منشورة لدينا)، أجرينا المناعي دون تثبيت، وذلك باستخدام الأجسام المضادة يقترن مباشرة إلى fluorophore لتقليل الوقت اللازم للكشف عن مستضد داخل الخلايا. ويقترن هذا الضد إلى fluorophore الحمراء اليكسا فلور 555. كما هو الحال في بروتوكول 2، تميزوا البكتيريا قادرة على البقاء وغير قابل للحياة باستخدام دابي وSYTOX الأخضر، على التوالي، وكانت ملطخة البكتيريا الخارجية باستخدام اليكسا 647-كتين إلى جانب فول الصويا. البكتيريا الخارجية يتألق تحت الحمراء البعيدة وكاذبة اللون الأرجواني. تظهر البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية الأرجواني الأزرق + والخارجية البكتيريا غير قابل للحياة تظهر الأرجواني + أخضر / أزرق. البكتيريا قادرة على البقاء داخلية تظهر الأزرق (سهم) وبينالبكتيريا غير قابل للحياة نال تظهر الخضراء (رأس السهم). حبيبات-CD63 الإيجابية وphagosomes تظهر حمراء. اتسخت نواة العدلة مع الأصباغ محددة الحمض النووي ("N"). عند تحليل هذه الصور، تم تصنيف كل البكتيريا الفردية والخارجية مقابل الداخلي، قابلة للحياة مقابل غير قابل للحياة، وإيجابية أو سلبية لحلقة من CD63 تلطيخ. N. واعتبر البنية الإقامة في العدلة-CD63 إيجابي يبلوع إذا كان هناك ≥ 50٪ من حلقة من CD63 مضان المحيطة البكتيريا، وفي يبلوع-CD63 السلبية إذا كان هناك <50٪ من حلقة من CD63 مضان المحيطة البكتيريا . البكتيريا داخل الخلايا غير قابل للحياة التي أشار إليها رأس السهم في الشكل 4C لديه حلقة من تلطيخ لCD63 المحيطة البكتيريا. يشير هذا الخاتم يتم إثراء حبيبات الأولية في هذا يبلوع. البكتيريا داخل الخلايا قابلة للحياة، الذي يشير إليه السهم، تفتقر لتلطيخ CD63، مشيرا لا يتم إثراء حبيبات الأولية في يبلوع لها. نحنتستخدم هذه التقنية لإظهار وجود علاقة بين بقاء N. البنية والإقامة في الحبيبية-السلبية يبلوع الابتدائية 26. لأن هذا الاختبار يقيس كلا الجدوى وتوطين البكتيرية باستخدام بروتين من الفائدة، فمن الممكن لتحديد ما إذا كان يقيم البكتيريا غير قابل للحياة وقابلة للحياة في المواقع نفسها أو مختلفة. يوفر هذه المعلومات البصيرة أولية هامة في الآليات التي تسهم في بقاء البكتيريا في الخلايا المضيفة.

الشكل 1
الشكل 1. مزيج من N. قابلة للحياة وغير قابل للحياة تعرضت البنية إلى اليكسا فلور كتين فول الصويا إلى جانب-647، يوديد propidium، وSYTO9 وفقا لبروتوكول 1، في غياب الخلايا المضيفة. جميع البكتيريا يمكن الوصول إلى كتين ويتألق باللون الأزرق. تظهر البكتيريا غير قابل للحياة البكتيريا أزرق + أحمر وغير قابل للحياة تظهر الزرقاء+ الخضراء.

الرقم 2
الشكل 2. (AB) منتصف المرحلة لوغاريتمي N. تعرضت البنية ليوديد propidium وSYTO9 كما في بروتوكول 1، مع (A) أو بدون (B) العلاج الأيزوبروبانول لقتل البكتيريا. البكتيريا غير قابل للحياة هي في متناول يوديد propidium وتظهر باللون الأحمر. هي ملطخة البكتيريا قادرة على البقاء مع SYTO9 وتظهر خضراء. (CD) منتصف المرحلة لوغاريتمي N. تعرضت البنية إلى دابي وSYTOX الأخضر كما في بروتوكول 2، مع (C) أو بدون (D) العلاج الأيزوبروبانول لقتل البكتيريا. البكتيريا غير قابل للحياة هي في متناول دابي وSYTOX الأخضر وتظهر أزرق + أخضر. هي ملطخة البكتيريا قادرة على البقاء مع دابي فقط وتظهر الزرقاء فقط.

بديل = "الشكل 3" FO: محتوى العرض = "6in" سرك = "/ files/ftp_upload/50729/50729fig3.jpg" />
الرقم 3. سمح (A) العدلات لربط واستيعاب قتلوا الأيزوبروبانول N. البنية، ثم تتعرض ليوديد propidium وSYTO9 وفقا لبروتوكول 1. هي ملطخة البكتيريا غير قابل للحياة مع يوديد propidium وتظهر حمراء. كما كل البكتيريا غير قابل للحياة، لا SYTO9 إيجابية، يتم الكشف عن البكتيريا الخضراء. سمح (B) العدلات لربط واستيعاب قتلوا الأيزوبروبانول N. البنية، ثم تتعرض لدابي وSYTOX الأخضر وفقا لبروتوكول 2. هي ملطخة البكتيريا غير قابل للحياة مع دابي وSYTOX الأخضر وتظهر أزرق + أخضر. كما كل البكتيريا غير قابل للحياة، لا دابي فقط، يتم الكشف عن البكتيريا الزرقاء فقط. N تسميات نواة العدلة. شريط النطاق = 5 ميكرون. السهام تشير بعض البكتيريا غير قابل للحياة.

في "سرك =" / files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg "/>
الشكل 4. (A) N. تعرضت العدلات الإنسان البنية المصابة إلى اليكسا فلور 647 يقترن كتين فول الصويا (الازرق كاذبة اللون)، ثم permeabilized مع سابونين في وجود جدوى الأصباغ يوديد propidium (الأحمر)، لتسمية البكتيريا الميتة، وSYTO9 (الأخضر)، لمباين البكتيريا الحية. تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية أزرق + أحمر والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر حمراء فقط، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر أزرق + أخضر، والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر خضراء فقط. (B) N. وصفت البنية مع دابي (الأزرق)، ثم قدم إلى العدلات. الخلايا المصابة ثم تعرضوا لاليكسا فلور يقترن-647 كتين فول الصويا (كاذبة اللون الأحمر)، ثم permeabilized مع سابونين بحضور SYTOX الأخضر (الأخضر) لتسمية البكتيريا الميتة. البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية تظهر حمراء + خضراء، تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الداخلية أخضر + أزرق، البكالوريا قابلة للحياة الخارجيةطريا تظهر أحمر + أزرق، والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر الزرقاء فقط. (C) N. تم تجهيز البنية العدلات المصابين كما هو الحال في (ب)، فيما عدا اليكسا فلور الأضداد مقرونة-555 ضد بروتين الحبيبية العدلة الابتدائي وأضيف CD63 (الحمراء) في وقت permeabilization. كان اليكسا فلور 647-كتين فول الصويا تلطيخ كاذبة اللون الأرجواني. تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية الأرجواني + الخضراء والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر الخضراء فقط، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر الأرجواني الأزرق + والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر الأزرق فقط، ويبدو CD63 تلطيخ الأحمر. يظهر أقحم مضان CD63 من مساحة الصورة وأشار مع مربع أبيض. في AC، N تسميات نواة العدلة. شريط النطاق = 5 ميكرون. النصال تشير البكتيريا غير قابل للحياة والسهام تشير البكتيريا قادرة على البقاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المقدمة هنا نوعان من البروتوكولات التي تستخدم الحمض النووي ملزمة والأصباغ جدوى بالتزامن مع كتين الفلورسنت لتحديد البكتيريا الحية والميتة وتعلق داخل الخلايا البشرية. لأن كلا من بروتوكولات تميز بفعالية الحية من البكتيريا الميتة، واختيار أي بروتوكول لاستخدام يعتمد على الهدف من التجربة. يستخدم بروتوكول الأولى يوديد propidium للكشف عن البكتيريا غير قابل للحياة وSYTO9 للكشف عن البكتيريا سليمة. هو مبين في الشكل 4A هي صورة ممثل البروتوكول 1 ينطبق على العدلات الإنسان المصابين N. البنية. تم الجمع بين هذه الأصباغ مع راصة كتين، وفول الصويا، إلى الاعتراف N. خارج الخلية البنية، ولكن الأجسام المضادة البكتيريا محددة مقرونة fluorescently يمكن استخدامها كبديل. بروتوكول 1 يكشف بسهولة بقاء البكتيريا الفردية، منذ استبعاد SYTO9 بواسطة يوديد propidium يجعل البكتيريا غير قابل للحياة يتألق البكتيريا الحمراء وقابلة للحياة يتألق الخضراء. Howeveص، وهذا البروتوكول لا يمكن الجمع بين المناعي للبروتينات المضيف، ويرجع ذلك إلى مضان من يوديد propidium في اثنتين من القنوات الأربعة المتاحة للفحص المجهري مضان التقليدية. لذلك، تم تطوير بروتوكول 2، والذي يستخدم لتحديد SYTOX الأخضر البكتيريا غير قابل للحياة ودابي للكشف عن مجموع السكان البكتيرية. مثال على N. البنية المرتبطة وداخل العدلات الإنسان ومعالجتها باستخدام SYTOX الأخضر ودابي هو مبين في الشكل 4B ويرد مثال في تركيبة مع المناعي في الشكل 4C. إلى جانب توافر قناتين مضان إضافية، وهذا البروتوكول هو مفيد للاستخدام من قبل الأفراد مع colorblindness الأحمر والأخضر. ومع ذلك، يمكن للبكتيريا غير قابل للحياة يتألق الأخضر أو ​​الأزرق والأخضر، اعتمادا على الكثافة النسبية للدابي وSYTOX الأخضر وتلطيخ على الصورة المعلمات الاستحواذ. عيب واحد لاستخدام دابي هو أنه يمكن أن يتسرب من N. البنيةأثناء العدوى، وعلى الرغم من أن هذا قد لا يكون مشكلة بالنسبة لغيرها من البكتيريا مثل المكورات العنقودية الذهبية (الملاحظات غير منشورة لدينا). لمواجهة هذه المشكلة، وصفت الخلايا المصابة مع دابي جنبا إلى جنب مع SYTOX الأخضر بعد الإصابة، ولكن لشدة تلطيخ دابي النووية تغلبوا مضان من N. البنية (الملاحظات غير منشورة لدينا). بالإضافة إلى هذين البروتوكولين، يمكن أن تستخدم الأصباغ الأخرى المتاحة تجاريا لتكشف عن جدوى البكتيرية. على سبيل المثال، يمكن أن carboxyfluorescein استر succinimidyl (CFSE) تسمية مجموع السكان البكتيرية، وSYTOX البرتقالي أو الأزرق يمكن تحديد البكتيريا غير قابل للحياة. منذ فعالية النسبية لهذه الإجراءات يمكن أن تختلف مع نوع البكتيريا والخلية المصابة، فمن المهم أن الباحثين مقارنة مختلف تركيبات بقاء الصبغة في نظم العدوى.

حاليا، ونحن فحص يدويا كل صورة تم الحصول عليها مع هذه البروتوكولات لتحديد فياستيعاب المائة، في المئة بقاء داخل الخلية وخارج الخلية، وcolocalization مع علامات التحت خلوية. بينما الأساليب القائمة على الحاسوب الآلي يمكن نظريا أن تستخدم لقياس هذه المعايير، فإنها قد تكون معقدة من قبل أي تلطيخ غير موحدة من البكتيريا مع الأصباغ جدوى وإشارة قوية مضان من نواة الخلية. أيضا، قد تحتاج إلى تعريف colocalization البكتيرية مع علامة التحت خلوية إلى أن يكون الأمثل للبكتيريا، نوع من الخلايا، وعلامة من الفائدة.

القيد واحد من هذه البروتوكولات هو افتراض أن نفاذية ليوديد propidium أو SYTOX الأخضر هو المقياس الحقيقي للوفاة البكتيرية. الوزن الجزيئي لليوديد propidium وSYTOX الأخضر هو 668.4 دا دا و 600، على التوالي. وتعتبر هذه الأصباغ غشاء impermeant ويجب أن لا وصول إلى السيتوبلازم البكتيري إلا إذا كان الضرر غشاء البكتيريا لديها دون اصلاح. ومع ذلك، يبقى احتمال أن البكتيريا تدخل حالة ركودأو حتى إصلاح الضرر الغشاء، وتستمر في النمو في أوقات لاحقة. والقيد الثاني هو أن البروتوكولات لا تسمح بقاء البكتيريا الفردية لتعقبها مع مرور الوقت. توصي تقنيات الحياة التي تقييم الجدوى البكتيرية مع يوديد propidium وSYTO9 أن يؤديها في غضون 30 دقيقة بعد التعرض للأصباغ، منذ البكتيريا سوف تفقد صلاحية أطول أنها هي التي شنت وتصويرها بواسطة المجهر مضان. وصفت الخلايا المصابة مع دابي / SYTOX تركيبة الصبغة الخضراء كما يجب تصويرها بسرعة بعد تصاعد (الملاحظات غير منشورة لدينا). الثالث، البروتوكولات غير متوافقة مع تقنيات تثبيت استخداما. سوف الميثانول أو الأسيتون تثبيت permeabilize وقتل البكتيريا المرتبطة مع الخلايا المضيفة، ومثبتات المستندة إلى ألدهيد permeabilize N. البنية داخل العدلات الإنسان ليوديد propidium وSYTOX الأخضر (الملاحظات غير منشورة). وبالتالي استخدام هذه البروتوكولات يتطلب الوصول الفوري إلى ميكر مضانoscope والقدرة على إنجاز البروتوكولات في يوم واحد. أخيرا، كل من الأصباغ المستخدمة في هذه البروتوكولات ربط المزدوج تقطعت بهم السبل الأحماض النووية والمضيف ربط الحمض النووي النووية فضلا عن الحمض النووي البكتيري (الشكل 1). لأن مضان من الحمض النووي النووية هو أكثر إشراقا بكثير من مضان من الحمض النووي للبكتيريا، والجدوى من البكتيريا التي هي في القرب من نواة حقيقية النواة لا يمكن تقييمها. متحد البؤر المجهر الليزر والبكتيريا prelabeling مع دابي يساعد على التقليل من إشارة مضان النووية. سوف مضان من الحمض النووي النووية لا تزال مضاعفات هذه البروتوكولات حتى يتم تطوير الأصباغ بقاء البكتيرية غير ملزم الحمض النووي.

على الرغم من هذه القيود، فإن البروتوكولات في هذه المقالة توفر طريقة حساسة لتقييم جدوى البكتيريا الفردية المرفقة وداخل الخلايا حقيقية النواة. كانت مستعمرة العد أو الجنتاميسين حماية فحوصات العمود الفقري للبحوث الجراثيم المرضية. ومع ذلك، فإنها الأقليمبيئة تطوير متكاملة تقييما للبقاء البكتيرية عبر السكان يحتمل أن تكون غير متجانسة. في المقابل، فإن البروتوكولات الجدوى صبغ الموصوفة هنا تسمح للسلامة البكتيريا الفردية التي سيجري بحثها. وبالتالي، يمكن للباحثين جمع البيانات المتعلقة مصائر خارج الخلية مقابل الخلايا البكتيريا والبكتيريا في أنواع مختلفة phagosomal، أو البكتيريا في يبلوع مقابل السيتوبلازم. وكثيرا ما استخدمت قسم رقيقة المجهر الإلكتروني إحالته إلى دراسة الجدوى من البكتيريا الفردية. بينما البكتيريا التي تظهر الإلكترون-وسنت أو لم تعد سليمة بواسطة TEM بشكل واضح غير قابل للحياة، فإنه من الصعب تقييم ما إذا كانت البكتيريا التي لا تزال تحتفظ ببعض كثافة الإلكترونات في السيتوبلازم بها هي في الواقع سليمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يستغرق ساعات طويلة من الوقت الإلكترون المجهر للحصول على ما يكفي لتحليل الميكروسكوب، بينما العديد من المجالات منخفضة الطاقة يمكن الحصول عليها من الخلايا المعرضة للبقاء الأصباغ القائمة على مضان، حتى في وقت قصير الممنوحة لاقتناء الصورة. في حين أن ال Øتم الأمثل بروتوكولات مع دائرة التنمية الاقتصادية N. البنية والعدلات الإنسان الأساسية، ويمكن تكييفها لتقييم جدوى العديد من أنواع البكتيريا سالبة الجرام والجرام إيجابية في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك جميع البلعمية والخلايا حقيقية النواة nonphagocytic 5،15-24،26. توفير الأصباغ البكتيرية الجدوى أداة تجريبية قوية لدراسة آليات المرضية البكتيرية في الخلايا حقيقية النواة وقدرة الخلايا حقيقية النواة للسيطرة على عدوى بكتيرية. في المستقبل، من المرجح أن تصبح أكثر فائدة مع أدوات أفضل لاكتساب صورة الآلي والمعالجة، جنبا إلى جنب مع تطور الأصباغ بقاء البكتيرية التي تتوافق مع ألدهيد التثبيت ومحددة لبدائيات النوى هذه البروتوكولات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر بنك آسيا سميرنوف ولورا Gonyar لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة وأيد منح R00 R01 TW008042 وAI097312 لAKCMBJ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة AI007046 T32.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection Becton Dickinson 367251  
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml Becton Dickinson 366480  
Sterile water for irrigation Baxter 07-09-64-070  
Dextran 500 Sigma 31392  
Sodium Chloride Fisher Scientific S641  
Dextrose Ricca Chemical Company RDCD0200  
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ Thermo Scientific SH3002802  
Ficoll solution GE Healthcare 17-1440-03  
Acetic Acid Fisher Scientific BP2401  
12 mm circular glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
24-well plates Corning Incorporated 3524  
Pooled Human Serum Sigma S7023  
RPMI Mediatech 15-040-CV  
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007103  
Human interleukin-8 R&D Systems 208-IL/CF  
MOPS Sigma M3183  
MgCl2 Fisher Scientific BP214  
Propidium Iodide Life Technologies L7007 or L7012  
SYTO9 Life Technologies L7007 or L7012  
Saponin Fluka Analytical 47036  
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin Life Technologies L-32463  
DAPI Sigma D8417  
SYTOX Green Life Technologies S7020  
Mouse anti-CD63 Developmental Studies Hybridoma Bank H5C6  
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit Life Technologies A20187  
Hemacytometer Bright Line Hausser Scientific 1492  
Forceps EMS 78320  
Sorvall Legend RT + Centrifuge Thermo Scientific 75004377  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Tags

علم الأحياء الدقيقة، العدد 79، المناعة، العدوى، علم الأحياء السرطان، علم الوراثة، علم الأحياء الخلوية والبيولوجيا الجزيئية والطب والهندسة الطبية الحيوية، المجهري، متحد البؤر، المجهري، الإسفار، والبكتيريا، الالتهابات البكتيرية وداء فطري جهازي والبكتيريا والعدوى، وقدرتها على البقاء، مضان المجهري، خلية والتصوير
مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, M. B., Criss, A. K.… More

Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (79), e50729, doi:10.3791/50729 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter