Fluorescensmikroskopi Metoder til bestemmelse af levedygtighed Bakterier i foreningen med pattedvrceller

Summary

Centralt i området af bakteriel patogenese er evnen til at definere, om og hvordan mikrober overlever efter udsættelse for eukaryote celler. Denne artikel beskriver protokoller for brugen af ​​fluorescerende farvestoffer, der afslører levedygtigheden af ​​de enkelte bakterier inde og forbundet med værtsceller.

Abstract

Centralt i området af bakteriel patogenese er evnen til at definere, om og hvordan mikrober overlever efter udsættelse for eukaryote celler. Aktuelle protokoller til at løse disse spørgsmål omfatter kimtal assays, gentamicin beskyttelse assays og elektronmikroskopi. Kimtal og gentamicin beskyttelse assays kun vurdere levedygtigheden af ​​hele den bakterielle population og ikke er i stand til at afgøre individuelle bakteriel levedygtighed. Elektronmikroskopi kan anvendes til at bestemme levedygtigheden af ​​de enkelte bakterier og give oplysninger om deres lokalisering i værtsceller. Bakterier ofte en række elektron tætheder, hvilket gør bedømmelse af levedygtighed vanskelig. Denne artikel beskriver protokoller for brugen af ​​fluorescerende farvestoffer, der afslører levedygtigheden af ​​de enkelte bakterier inde og forbundet med værtsceller. Disse assays blev oprindeligt udviklet til at vurdere overlevelsen af Neisseria gonorrhoeae i primære humane neutrofiler, men bør være etpplicable enhver bakterie-vært-interaktion celle. Disse protokoller kombinere membran-gennemtrængelige fluorescerende farvestoffer (SYTO9 og 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), der farver alle bakterier med membran-impermeabel fluorescerende farvestoffer (propidiumiodid og SYTOX Green), som kun er tilgængelig for levedygtige bakterier. Forud for eukaryot celle permeabilisering tilsættes et antistof eller fluorescerende reagens til at identificere ekstracellulære bakterier. Således disse assays diskriminere levedygtigheden af ​​bakterier klæbende til og inde i eukaryote celler. En protokol er også tilvejebragt til anvendelse levedygtighed farvestoffer i kombination med fluorescerende antistoffer til eukaryote cellemarkører, for at bestemme den subcellulære lokalisering af de enkelte bakterier. De bakterielle levedygtighed farvestoffer omtales i denne artikel er en følsom supplement og / eller alternativ til traditionelle mikrobiologi teknikker til at vurdere levedygtigheden af ​​de enkelte bakterier og give oplysninger om, hvor bakterier overleve i værtscellesek.

Introduction

Der er en dynamisk interaktion og samarbejde evolution mellem bakterier og værter, hvor de bor. Bakterier har udviklet compliance organeller, sekretion systemer, og / eller evnen til at producere toksiner, der giver deres produktiv infektion af værtens fagocytiske og ikke-fagocytceller. Bakterierne skal også kæmpe med anerkendelse og antimikrobielle aktiviteter af værtens immunsystem. Værtens immunsystem består af medfødte og adaptive komponenter, herunder fysiske og kemiske barrierer, immunceller, komplementsystemet, og andre dele af humoral immunitet. Mens mange bakterier er modtagelige for drab og efter en flerlaget værtens immunrespons, har nogle patogene og opportunistiske bakterier udviklet mekanismer til at inficere en række værtsceller og undergrave efter værtens immunrespons ^1. Neisseria gonorrhoeae er et eksempel på et bakterielt patogen der er meget tilpasset til at fortsætte i sin menneskelige vært. N. gonorrhoeae let koloniserer de luminale overflader af mucosale epithelceller urogenitalkanalen, svælget, bindehinde og endetarmen. Colonization udløser rigelige rekruttering af neutrofiler på slimhinder. Neutrofiler er professionelle fagocytter, der besidder en række antimikrobielle fremgangsmåder til at dræbe mikroorganismer, men N. gonorrhoeae er i stand til at overleve i nærvær af neutrofiler ^2-5. Forstå, hvordan bakterielle patogener som N. gonorrhoeae undergrave, undertrykke og kapre immunrespons til sidst at overleve i normalt fjendtlige værtsmiljøer er afgørende for udviklingen af nye behandlingsformer til bekæmpelse af smitsomme sygdomme.

Forsøgsprotokoller ofte bruges til at undersøge bakteriel overlevelse i værtsceller indbefatter kimtal assays, gentamicin beskyttelse assays og elektronmikroskopi. I kimtal analyser, er en population af inficerede celler lyseres (for eksempel med et rengøringsmiddel til which bakterierne er resistente) at befri bakterier. Lysaterne fortyndet og udpladet på agar-baserede medier, og kolonidannende enheder i lysaterne optælles for hvert tidspunkt og / eller eksperimentel betingelse. Denne fremgangsmåde rapporterer levedygtigheden af ​​hele bakteriepopulation, men ikke er i stand til at skelne mellem intracellulære og ekstracellulære overlevelse. En variation på kimtal assay gentamicin beskyttelse assayet specifikt måler intracellulær bakteriel overlevelse, baseret på den manglende evne af de antibiotiske gentamicin at krydse eukaryot plasmamembranen ^6. Men dette assay er afhængig af bakterierne bliver modtagelige for drab med gentamicin (eller et andet antibiotikum, som er tilsvarende eukaryot membran-impermeabel) og den manglende evne af antibiotikummet at have adgang til interne bakterier. Derfor kan en gentamicin beskyttelse assay ikke være effektiv for undersøgelse af alle bakteriearter eller i undersøgelsen af ​​bakteriel overlevelse i stærktpinocytic celler såsom neutrofiler. Ingen af disse tilgange afslører den subcellulære lokalisering eller anden adfærd enkelte bakterier (fx hvis bakterierne danner aggregater eller mikrokolonier der opfører sig forskelligt fra de enkelte bakterieceller). Et andet ofte anvendt metode til at undersøge levedygtigheden af ​​de enkelte eksterne og interne bakterier tynd sektion transmissionselektronmikroskopi (TEM). Denne fremgangsmåde er fordelagtig, idet den kan give oplysninger om placeringen af bakterierne i værtsceller (f.eks phagosome, cytoplasma, autophagosome), som kan undersøges nærmere af immunoelektronmikroskopi med guld-koblede antistoffer mod subcellulære markører. Men elektronmikroskopi er ikke specielt følsom på at vurdere bakteriel levedygtighed. Når indlejrede sektioner farves med uranylacetat, bly-citrat eller andre elektron-tætte reagenser, og afbildet ved elektronmikroskopi, er elektron-tætte bakterier betragtes som levedygtige og elektrotron-Lucent nonviable ^7,8. Men denne antagelse overvurderer bakteriel levedygtighed, da kun de døde bakterier med alvorligt forstyrret membraner og blottet for cytoplasma vises elektron-Lucent. Desuden kan nogle bakteriearter vise en række elektron tætheder afhængig af deres vækststadium, hvilket gør det vanskeligt at bestemme levedygtighed.

Som et alternativ eller i tillæg til disse udbredte metoder, vi her give protokoller og rationale for anvendelse af fluorescerende farvestoffer, som indikerer bakteriel levedygtighed til at vurdere overlevelsen af ​​bakterierne, der er knyttet til og er internaliseret gennem værtsceller. For at identificere ekstracellulære bakterier er inficerede celler først udsat for et fluorescerende reagens, såsom et lectin eller bakterie-specifikke antistof. De inficerede celler bliver derefter permeabiliseret og udsættes for DNA-specifikke farvestoffer, der er differentielt tilgængelige for bakterier med intakt vs uregelmæssige membraner, som et surrogat for bakteriel levedygtighed. I den første protokol membranen gennemtrængelig farvestof SYTO9 identificerer den totale bakterielle population, mens propidiumiodid kun er tilgængelig for de bakterier, der har kompromitteret membraner og anses derfor nonviable. Propidiumiodid og SYTO9 er blevet anvendt til at evaluere bakteriel levedygtighed biofilm diskriminere patogene fra ikke-patogene bakterier, og optælle levedygtige vandbårne bakterier ^9-12. I den anden protokol, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindol (DAPI) identificerer samlede bakterier, mens SYTOX Green er kun tilgængelig for nonviable befolkning. Disse levedygtighed farvning par kan kombineres med immunfluorescens for at bestemme hver bakterie placering i forhold til et protein af interesse, for eksempel til at definere bakteriel subcellulære lokalisering. Anvendelsen af ​​disse assays giver vigtige indblik i de interaktioner, der resulterer i bakteriel drab eller overlevelse under infektion af værtsceller. De protokoller, der er skitseret i denne artikel er anvendt til at vurdere levedygtigheden afN. gonorrhoeae, der er fastgjort til og inde primære humane neutrofiler, herunder i forskellige populationer af neutrofile phagosomes ^5,13,14. Dog kan anvendes disse protokoller til at vurdere levedygtigheden af gram-positive og gram-negative bakterier i professionelle fagocytter, ikke-erhvervsmæssige fagocytter, og protozoer ^15-24.

Protocol

1.. Vurdere bakteriel levedygtighed med Propidiumiodid og SYTO9

1. Inficere celler, der er klæbende til 12 mm i diameter cirkulære dækglas i 24-brønds plader med bakterier af interesse. IKKE fikseres cellerne med aldehyder eller organiske opløsningsmidler.
2. Skyl celler en gang forsigtigt i 0,1 M 3 - (N-morpholino) propansulfonsyre (MOPS), pH 7,2, indeholdende 1 mM _MgCl2 (MOPS / _MgCl2).
3. Cellerne inkuberes i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur med Alexa Fluor 647-koblet antistof eller lectin, som binder til de bakterielle arter af interesse, MOPS / _MgCl2, for at opdage eksterne bakterier.

BEMÆRK: Conduct styrer med levende og døde bakterier, i mangel af værtsceller, at vise, at lectin eller antistof af interesse binder alle bakterier uanset rentabilitet (figur 1).

4. Skyl celler to gange med MOPS / _MgCl2.
5. Aspirer media fra celler, og der tilsættes 0,5 ml Levende / Dead farveopløsning. Levende / Dead Farvning Solution er 5uM SYTO9, 30 pM propidiumiodid, og 0,1% saponin (slutkoncentrationer) i MOPS / _MgCl2.
6. Cellerne inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
7. Skyl celler to gange i MOPS / _MgCl2.
8. Inverter dækglas nedad på objektglas og forsegle med klar neglelak. Brug ikke montering medier.
9. Anskaf billeder inden for 30 minutter, ved hjælp af en fluorescens mikroskop med filtersæt er kompatible med billedet erhvervelse grøn, rød, og langt-rød.

BEMÆRK: Både konventionel fluorescensmikroskopi og konfokal laser scanning mikroskopi kan anvendes. Efter 30 minutter blev fluorescerende farvestoffer begynder at lække fra bakterier, og de indhentede data ikke længere er nøjagtige. Illustrationerne i denne artikel blev erhvervet på et Nikon Eclipse E800 opretstående fluorescens mikroskop med Hamamatsu Orca-ER digitalkamera ved hjælp Openlab software. Fluorescens af Alexa Fluor 647 blev påvist ved hjælp af et filter med excitation bølgelængde på 590-650 nm og en emission filter på 663-735 nm, og er falsk-farvet blå. Fluorescens fra propidiumiodid blev opdaget ved hjælp af et filter med excitationsbølgelængde på 540-580 nm og en emission filter på 600-660 nm. Fluorescens fra SYTO9 blev påvist ved hjælp af et filter med excitationsbølgelængde på 465-495 nm og en emission filter på 515-555 nm.

10. Denne protokol vil resultere i billeder, hvor eksterne levedygtige bakterier vises blå + rød, ser røde kun interne levedygtige bakterier, eksterne levedygtige bakterier forekommer blå + grøn, og interne levedygtige bakterier kun fremtræder grønt. Tæl med øje antallet af bakterier, der er ekstern nonviable, intern nonviable, ekstern levedygtig, og intern levedygtige.
11. Beregn procent af eksterne levedygtige bakterier ved at dividere antallet af eksterne levedygtige bakterier med det samlede antal eksterne bakterier (levedygtige plus nonvistand). Beregn procentdelen af interne levedygtige bakterier ved at dividere antallet af interne levedygtige bakterier med det samlede antal interne bakterier (levedygtige plus nonviable) (figur 4).
12. Der er to vigtige kontroller for at udføre med denne protokol. Først, validere, at alle ikke-levedygtige bakterier er propidiumiodid-positive, og alle levende bakterier er SYTO9-positive. En midt-logaritmisk kultur af bakterier (i mangel af værtsceller) skal være> 95% SYTO9-positive. Vist i figur 2 er en mid-logaritmisk kultur N. gonorrhoeae (ved 10 ⁸ kolonidannende enheder pr ml) inkuberes med live / Dead farveopløsning. For det andet, validere, at både propidiumiodid og SYTO9 kan indtaste permeabiliseres inficerede værtsceller.
    1. For at generere en population af døde bakterier, indsamle 2 x 10 ⁸ bakterielle kolonidannende enheder i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der tilsættes 70% isopropanol og sidde i 10 minutter. Pelletere bakterierne i en mikrocentrifuge ennd vaske bakterier to gange i PBS for at fjerne tilbageværende isopropanol. Derefter følger protokol trin 1,5-1,7. Tilsæt 5 ul bakteriesuspension til en glasplade og overlay med et dækglas. Billede prøver som i protokol trin 1.9. Under disse betingelser, bør 100% af befolkningen være propidiumiodid-positive (figur 2). I nogle bakteriearter kan propidiumiodid ikke fuldstændigt overvælde SYTO9 farvning og levedygtige bakterier kan forekomme gul eller orange.
    2. For fagocytceller som neutrofiler udsætte cellerne til isopropanol-dræbte bakterier og sikre, at 100% af de intracellulære bakterier er propidiumiodid-positive (figur 3). For nonphagocytic celler, der ikke internaliserer døde bakterier, kan det være tilstrækkeligt at behandle inficerede celler med natriumazid eller andre celle-gennemtrængende antimikrobielle midler før tilsætning live / Dead farveopløsning.

2. Vurdere bakteriel levedygtighed SYTOX Green og DAPI

1. Label bakterier af interesse med 10 ug / ml DAPI i Morse er defineret medium ²⁵ i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
2. Inficere celler, der er klæbende til 12 mm i diameter cirkulære dækglas i 24-brønds plader med DAPI-mærkede bakterier. IKKE fikseres cellerne med aldehyder eller organiske opløsningsmidler.
3. Skyl celler en gang med MOPS / _MgCl2.
4. Cellerne inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke med Alexa Fluor 647-koblet antistof eller lectin, som binder til de bakterielle arter af interesse, MOPS / _MgCl2, for at opdage eksterne bakterier. Se note i protokollen trin 1.3 for foreslåede kontroller.
5. Aspirer medier fra celler og tilsættes 0,5 ml 0,4 uM SYTOX Green i MOPS / _MgCl2.
6. Cellerne inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur i mørke.
7. Skyl celler to gange i MOPS / _MgCl2.
8. Vask cellerne én gang i MOPS / _MgCl2 i 5 min.

BEMÆRK: Fluorescens fra Alexa Fluor 647 blev påvist ved hjælp af et filter med excitation bølgelængde på 590-650 nm og en emission filter på 663-735 nm, og er falsk-farvet rød. Fluorescens fra SYTOX Green blev opdaget ved hjælp af et filter med excitationsbølgelængde på 465-495 nm og en emission filter på 515-555 nm. Fluorescens fra DAPI blev detekteret ved anvendelse af et filter med excitationsbølgelængde på 355 til 375 nm og spærrefilter på 400 nm.

10. Denne protokol vil resultere i billeder, hvor eksterne levedygtige bakterier synes rød + grøn, interne levedygtige bakterier fremtræder grønt + blå, eksterne levedygtige bakterier synes rød + blå, og interne levedygtige bakterier forekommer kun blå (Figur 4). Kvantificer procent af eksterne og interne bakterier som beskrevet i protokol stes. 1.11.
11. De er beskrevet i protokol trin 1.12 kontroller bør udføres med DAPI / SYTOX Green farvestof kombination (figur 2 og 3).

3. Vurdering af bakteriel levedygtighed Sideløbende Subcellulær Lokalisering

1. Label bakterier af interesse med 10 ug / ml DAPI i Morse er defineret medium i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
2. Inficere celler, der er klæbende til 12 mm i diameter cirkulære dækglas i 24-brønds plader med DAPI-mærkede bakterier. IKKE fikseres cellerne med aldehyder eller organiske opløsningsmidler.
3. Skyl celler en gang med MOPS / _MgCl2.
4. Inkuber 10 min ved stuetemperatur i mørke med Alexa Fluor 647-koblet antistof eller lectin, som binder til de bakterielle arter af interesse, MOPS / _MgCl2, for at opdage eksterne bakterier. Se note i protokollen trin 1.3 for foreslåede kontroller.
5. Aspirer medier fra celler og skyl cellerne to times i MOPS / _MgCl2.
6. Cellerne inkuberes med Alexa Fluor 555-koblet antistof mod subcellulær markering af interesse i 20 minutter, i MOPS / _MgCl2 indeholdende 0,2% saponin.
7. Skyl celler to gange i MOPS / _MgCl2.
8. Vask cellerne én gang i MOPS / _MgCl2 i 5 min.
9. Aspirer medier fra celler og tilføje 0,4 uM SYTOX Green i MOPS / _MgCl2.
10. Cellerne inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur i mørke.
11. Skyl celler to gange i MOPS / _MgCl2.
12. Vask cellerne én gang i MOPS / _MgCl2 i 5 min.
13. Anskaf billeder af dias i 30 min på fluorescens mikroskop. Se protokol trin 1.9 for beskrivelse af mikroskop, et digitalt kamera, og erhvervelse software.

BEMÆRK: Fluorescens fra Alexa Fluor 647 blev påvist ved hjælp af et filter med excitation bølgelængde på 590-650 nm og emission filter på 663-735 nm, og er falsk-farvet lilla. Fluorescens from Alexa Fluor 555 blev påvist ved hjælp af et filter med excitationsbølgelængde på 540-580 nm og en emission filter på 600-660 nm. Fluorescens fra SYTOX Green blev opdaget ved hjælp af et filter med excitationsbølgelængde på 465-495 nm og en emission filter på 515-555 nm. Fluorescens fra DAPI blev detekteret ved anvendelse af et filter med excitationsbølgelængde på 355 til 375 nm og spærrefilter på 400 nm.

14. Denne protokol vil resultere i billeder, hvor eksterne levedygtige bakterier vises lilla + grøn, interne levedygtige bakterier fremtræder grønt + blå, eksterne levedygtige bakterier synes lilla + blå, interne levedygtige bakterier vises kun blå og subcellulære protein synes rød (Figur 4). Kvantificer perecent af eksterne og interne levedygtige bakterier, som beskrevet i protokol trin 1.11.
15. De er beskrevet i protokol trin 1.12 kontroller bør udføres med DAPI / SYTOX Green farvestof kombination (figur 2 og 3).
16. IUdover at tælle levedygtige og ikke-levedygtige bakterier, klassificere hver bakterie som enten positiv eller negativ for colokalisering med subcellulære markør af interesse.
17. Beregn procentdelen af ​​levedygtige bakterier colocalized med subcellulære markør ved at dividere antallet af colocalized levedygtige bakterier med det samlede antal af levedygtige bakterier. Beregn procent af levedygtige bakterier colocalized med den subcellulære markør ved at dividere antallet af levedygtige colocalized bakterier med det samlede antal af levedygtige bakterier.

Representative Results

Protokollerne beskrevet blev anvendt til at undersøge overlevelsen af N. gonorrhoeae efter udsættelse for primær humane neutrofiler ^5,26. Neutrofiler blev inficeret med N. gonorrhoeae og behandles med protokol nr. 1, ved hjælp af den grønne fluorescerende levedygtighed farvestof SYTO9 og røde fluorescerende propidiumiodid (figur 4A). Farvestofferne blev tilsat i nærvær af saponin, som isolerer kolesterol til fortrinsvis at permeabilisere værtscelle plasmamembraner, ikke N. gonorrhoeae membraner. Kan skal testes Andre detergenter, hvis membraner i bakterier af interesse indeholder store mængder af kolesterol. Alle N. gonorrhoeae pletten med SYTO9, men kun bakterier med kompromitterede membraner pletten med propidiumiodid. Propidiumiodid overvinder SYTO9 fluorescens, så levende bakterier fremtræder grønt og døde bakterier ser røde ^27. I nogle bakteriearter kan propidiumiodid ikke helt overvundet SYTO9 staining, hvilket resulterer i døde bakterier optræder gul eller orange. Forholdet propidiumiodid til syto 9 maj skal optimeres for forskellige bakteriearter. Forud for permeabilisering af cellerne og tilsætning SYTO9 og propidiumiodid en Alexa Fluor 647-koblede sojabønnelectin blev tilsat til de inficerede celler til påvisning af ekstracellulært N. gonorrhoeae, og langt-rød fluorescens signal var falsk-farvet blå. Således i denne protokol eksterne levedygtige bakterier forekommer turkis (blå + grøn) og ekstern nonviable vises magenta (blå + rød). Interne levedygtige bakterier vises kun grøn (pil), og interne levedygtige bakterier vises kun rød (pilespids). Det er vigtigt at bemærke, at i inficerede celler, vil den eukaryote cellekerne farves ved SYTO9 og propidiumiodid ("N", figur 4A). De eksterne levedygtige eksterne levedygtige, interne levedygtige, og interne levedygtige bakterier blev kvantificeret fra fluorescens billeder at give procent af internaliserede bakterier and procent levedygtige bakterier i og uden værtsceller.

Figur 4B er et repræsentativt billede af N. gonorrhoeae-inficerede neutrofiler behandles med protokol nr. 2, ved hjælp af levedygtighed farvestoffer SYTOX Green og DAPI. Denne protokol undgår anvendelsen af ​​propidiumiodid, der fluorescerer i både røde og ultraviolette kanaler på fluorescensmikroskop. Alle N. gonorrhoeae pletten med DAPI (blå), men kun bakterier med kompromitterede membraner pletten med SYTOX Green. Som beskrevet ovenfor, før permeabilisering af cellerne blev en Alexa Fluor 647-koblede sojabønnelectin tilsat til de inficerede celler til påvisning af ekstracellulært N. gonorrhoeae, hvis fluorescens i dette tilfælde er falsk-farvet rød. Derfor eksterne levedygtige bakterier vises magenta (rød + blå) og eksterne levedygtige bakterier forekommer gul (rød + grøn / blå). Interne levedygtige bakterier vises kun blå (pile), og interne levedygtige bakterier forekommer grøn / blå (pilespidser). Deindtil den relative intensitet af DAPI vs SYTOX grøn fluorescens kan levedygtige bakterier forekomme turkis. Svarende til celler, der behandles med propidiumiodid og SYTO9 er neutrofil kerne farves af SYTOX Grøn og DAPI i figur 4B (indikeret med "N"). Eksponering af inficerede celler til SYTOX Grøn og DAPI afslører procent internalisering og levedygtighed af bakterier i værtsceller kvantificeres som beskrevet ovenfor for propidiumiodid og SYTO9. Resultater fra N. gonorrhoeae-smittede neutrofiler behandles ved hjælp af SYTOX Grøn og DAPI er sammenlignelige med dem, der opnås med propidiumiodid og SYTO9 ^26.

Som vist i figur 4C, protokol 3 er en tilpasning af protokol 2, hvor de bakterielle levedygtighed farvestoffer blev kombineret med immunfluorescens til primær eller azurofile neutrofile granula protein CD63. Dette eksperiment blev udført for at fastlægge sammensætningen af ​​phagosome rum inside neutrofiler, der indeholder levedygtige eller ikke-levedygtigt N. gonorrhoeae ^26. Denne protokol kræver et mikroskop til fire-farve fluorescens muligheden for at opdage levedygtige bakterier, levedygtige bakterier, ekstracellulære bakterier og subcellulære markør. Da levedygtighed farvestoffer er ikke kompatibel med aldehyd fiksering (vores upublicerede observationer), udførte vi immunfluorescens uden fiksering ved hjælp af et antistof direkte koblet til en fluorophor at minimere den nødvendige tid til at påvise antigen i celler. Dette antistof er koblet til den røde fluorofor Alexa Fluor 555. Som i protokol 2 blev levedygtige og ikke-levedygtige bakterier skelnes ved hjælp af DAPI og SYTOX Green henholdsvis og eksterne bakterier blev farvet ved hjælp af Alexa 647-koblede sojabønnelectin. Eksterne bakterier fluorescerer langt rødt og er falsk farvet lilla. Eksterne levedygtige bakterier synes lilla + blå og eksterne levedygtige bakterier synes lilla + grøn / blå. Interne levedygtige bakterier forekommer blå (pil) og internale levedygtige bakterier fremtræder grønt (pilespids). CD63-positive granulater og phagosomes røde. Neutrofil kerne farves med DNA specifikke farvestoffer ("N"). Når man analyserer disse billeder blev hver enkelt bakterie klassificeret som ekstern versus intern, levedygtig vs levedygtige, og positiv eller negativ for en ring af CD63 farvning. N. gonorrhoeae blev anset for at opholde sig i en neutrofil CD63-positive phagosome hvis der er ≥ 50% af en ring af CD63 fluorescens omkring bakterier, og i en CD63-negative phagosome hvis der er <50% af en ring af CD63 fluorescens omkring bakterier . Den levedygtige intracellulær bakterie angivet ved pil i figur 4C har en ring af farvning for CD63 omgiver bakterierne. Denne ring angiver primære granuler er beriget på dette phagosome. Levedygtige intracellulære bakterie, angivet ved pilen mangler farvning for CD63, hvilket indikerer primære granuler ikke beriget på sin phagosome. Vibrugt denne teknik til at vise en sammenhæng mellem levedygtigheden af N. gonorrhoeae og ophold i en primær granulat-negative phagosome ^26. Fordi dette assay sporer både levedygtigheden og bakteriel lokalisering ved hjælp af et protein af interesse, er det muligt at afgøre, om ikke-levedygtige og levedygtige bakterier opholde sig i de samme eller forskellige steder. Disse oplysninger giver vigtige indledende indsigt i mekanismer, der bidrager til bakteriel overlevelse i værtsceller.

Figur 1. En blanding af levedygtige og ikke-levedygtige N. gonorrhoeae blev udsat for Alexa Fluor 647 koblet sojabønnelectin, propidiumiodid og SYTO9 henhold til protokol 1, i mangel af værtsceller. Alle bakterier er tilgængelige for lektin og fluorescerer blåt. Levedygtige bakterier synes blå + rød og levedygtige bakterier synes blå+ Grøn.

Figur 2. (AB) Mid-logaritmisk fase N. gonorrhoeae var udsat for propidiumiodid og SYTO9 som i protokol 1, med (A) eller uden (B) isopropanol behandling for at dræbe bakterierne. levedygtige bakterier er tilgængelige for propidiumiodid og røde. Levedygtige bakterier farves med SYTO9 og grønne. (CD) Mid-logaritmisk fase N. gonorrhoeae var udsat for DAPI og SYTOX Green som i protokol 2, med (C) eller uden (D) isopropanol behandling for at dræbe bakterier. Levedygtige bakterier er tilgængelige for DAPI og SYTOX Green og vises blå + grøn. Levedygtige bakterier farves med kun DAPI og synes kun blå.

alt = "Figur 3" fo: content-width = "6tommer" src = "/ files/ftp_upload/50729/50729fig3.jpg" />
Figur 3. (A) Neutrophile fik lov til at binde og internalisere isopropanol-dræbte N. gonorrhoeae, derefter udsat for propidiumiodid og SYTO9 henhold til protokol 1. Levedygtige bakterier farves med propidiumiodid og røde. Da alle bakterier er levedygtige, ingen SYTO9 positive, opdages grønne bakterier. (B) Neutrophile fik lov til at binde og internalisere isopropanol-dræbte N. gonorrhoeae, derefter udsat for DAPI og SYTOX Green i henhold til protokol nr. 2. Levedygtige bakterier farves med DAPI og SYTOX Green og vises blå + grøn. Da alle bakterier er levedygtige, ikke DAPI kun detekteres kun blå bakterier. N etiketter neutrofil kernen. Scale bar = 5 um. Pilespidser angiver nogle af de levedygtige bakterier.

i "src =" / files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg "/>
Figur 4.. (A) N. gonorrhoeae-inficerede humane neutrofiler blev udsat for Alexa Fluor 647-koblede sojabønnelectin (falsk-farvet blå), derefter permeabiliseret med saponin i nærvær af levedygtighed farvestoffer propidiumiodid (rød) til at mærke døde bakterier og SYTO9 (grøn), at kontrastfarve levende bakterier. Eksterne levedygtige bakterier forekommer blå + rød, interne levedygtige bakterier kun ser røde eksterne levedygtige bakterier forekommer blå + grøn, og interne levedygtige bakterier kun fremtræder grønt. (B) N. gonorrhoeae blev mærket med DAPI (blå), derefter forelægges for neutrofiler. Inficerede celler blev derefter udsat for Alexa Fluor 647-koblede sojabønnelectin (falsk-farvet rød), derefter permeabiliseret med saponin i nærvær af SYTOX Green (grøn) til at mærke døde bakterier. Eksterne levedygtige bakterier synes rød + grøn, interne levedygtige bakterier fremtræder grønt + blå, ekstern levedygtig bacrier synes rød + blå, og interne levedygtige bakterier kun vises blå. (C) N. gonorrhoeae-inficerede neutrofiler blev forarbejdet som i B, bortset fra en Alexa Fluor 555-koblet antistof mod neutrofil primære granule protein CD63 (rød) blev tilsat på tidspunktet for permeabilisering. Den Alexa Fluor 647-sojabønnelectin farvning var falsk-farvet lilla. Eksterne levedygtige bakterier synes lilla + grøn, interne levedygtige bakterier kun fremtræder grønt, eksterne levedygtige bakterier synes lilla + blå, interne levedygtige bakterier vises kun blå og CD63 farvning ser rødt. Det indsatte viser CD63 fluorescens område af billedet angivet med hvide firkant. I AC, N etiketter neutrofil kernen. Scale bar = 5 um. Pilespidser indikerer levedygtige bakterier og pile angiver levedygtige bakterier.

Discussion

Her præsenteres to protokoller, der anvender DNA-binding og levedygtighed farvestoffer i forbindelse med en fluorescerende lectin at identificere levende og døde bakterier er knyttet til og inde humane celler. Da begge protokoller effektivt diskriminere live fra døde bakterier, valget af hvilken protokol til at bruge, afhænger af målet for forsøget. Den første protokol bruger propidiumiodid at opdage levedygtige bakterier og SYTO9 at opdage intakte bakterier. Vist i figur 4A er et repræsentativt billede af protokol 1 anvendes på humane neutrofiler inficeret med N. gonorrhoeae. Disse farvestoffer blev kombineret med et lectin, sojabønne-agglutinin, at anerkende ekstracellulære N. gonorrhoeae, men en fluorescens koblet bakterie-specifikke antistof kan anvendes som et alternativ. Protokol 1 let afslører levedygtigheden af ​​de enkelte bakterier, da udelukkelsen af ​​SYTO9 ved propidiumiodid gør levedygtige bakterier fluorescerer rødt og levedygtige bakterier fluorescerer grønt. However, kan denne protokol ikke kombineres med immunofluorescens for værtsproteiner, på grund af fluorescensen af ​​propidiumiodid i to af de fire kanaler til konventionel fluorescensmikroskopi. Derfor protokol 2 blev udviklet, som bruger SYTOX Green til at identificere levedygtige bakterier og DAPI til påvisning af det samlede bakterielle population. Et eksempel på N. gonorrhoeae forbundet med og inde i humane neutrofiler og behandles ved hjælp SYTOX Grøn og DAPI er vist i figur 4B og et eksempel i kombination med immunfluorescens er vist i figur 4C. Udover tilgængeligheden af ​​yderligere to fluorescens-kanaler, denne protokol er fordelagtig til brug for personer med rød-grøn farveblindhed. Dog kan ikke-levedygtige bakterier fluorescerer grøn eller blå-grøn, afhængigt af den relative intensitet af DAPI og SYTOX Green farvning og de billedparametre erhvervelse. En ulempe ved anvendelsen af DAPI er, at det kan lække fra N. gonorrhoeaei løbet af infektion, selv om dette ikke være et problem for andre bakterier, såsom Staphylococcus aureus (vores upublicerede observationer). For at modvirke dette problem blev inficerede celler mærket med DAPI sammen med SYTOX Green efter infektion, men intensiteten af den nukleare DAPI farvning overmandet fluorescens N. gonorrhoeae (vores upublicerede observationer). Ud over disse to protokoller kan andre kommercielt tilgængelige farvestoffer anvendes til at afsløre bakteriel levedygtighed. For eksempel kan carboxyfluoresceindiacetat succinimidyl ester (CFSE) mærke den samlede bakteriepopulation, og SYTOX orange eller blå kunne identificere levedygtige bakterier. Da den relative effekt af disse procedurer kan variere med bakterien og inficerede celletype, er det vigtigt, at forskerne sammenligne forskellige levedygtighed farvning kombinationer i deres infektionssystemer.

I øjeblikket har vi manuelt undersøge hvert billede opnås med disse protokoller at kvantificere percent internalisering procent levedygtighed intracellulært og ekstracellulært, og colokalisering med subcellulære markører. Mens automatiserede computerbaserede metoder kan teoretisk anvendes til at kvantificere disse parametre, kan de være kompliceret af en uensartet farvning af bakterier med levedygtighed farvestoffer og stærkt fluorescenssignal af cellekernen. Desuden kan definitionen af ​​bakteriel colokalisering med en subcellulær markør skal optimeres for bakterierne, celletype og markering af interesse.

En begrænsning af disse protokoller er den antagelse, at permeabiliteten til propidiumiodid eller SYTOX Green er et sandt mål for bakteriel død. Molekylvægten af ​​propidiumiodid og SYTOX Green er 668,4 Da og 600 Da, hhv. Disse farvestoffer betragtes membran-impermeabel og må ikke få adgang til den bakterielle cytoplasma medmindre bakterierne har udbedrede skader membran. , Muligheden er dog fortsat, at de bakterier ind i en tilstand af stasiseller endda reparere deres skader membran og fortsætte med at vokse på senere tidspunkter. En anden begrænsning er, at de protokoller, ikke tillader levedygtighed af de enkelte bakterier, der skal spores over tid. Life Technologies anbefaler, at vurderinger af bakteriel levedygtighed med propidiumiodid og SYTO9 udføres inden for 30 minutter efter udsættelse for farvestofferne, da bakterierne mister levedygtighed, jo længere de er monteret og afbildet af fluorescens mikroskopi. Inficerede celler mærket med DAPI / SYTOX Green farvestof kombination skal også afbildes hurtigt efter montering (vores upublicerede observationer). Tredje protokollerne er ikke kompatible med almindeligt anvendte fikseringen teknikker. Methanol eller acetone fiksering vil permeabilisere og dræbe bakterier associeret med værtsceller, og aldehyd-baserede fikseringsmidler permeabilisere N. gonorrhoeae indenfor humane neutrofiler til propidiumiodid og SYTOX Grøn (upublicerede observationer). Således ved hjælp af disse protokoller kræver øjeblikkelig adgang til et fluorescens MICRoscope og evne til at fuldføre de protokoller på én dag. Endelig binder hver af de farvestoffer, der anvendes i disse protokoller dobbeltstrenget nucleinsyrer og binder vært kerne-DNA samt bakterie-DNA (figur 1). Eftersom fluorescensen af ​​kerne-DNA er væsentligt lysere end fluorescensen af ​​bakteriel DNA, kan levedygtighed bakterier, der er i nærheden af ​​den eukaryote kerne ikke vurderes. Konfokal laser scanning mikroskopi og prelabeling bakterier med DAPI medvirke til at reducere den nukleare fluorescens signal. Fluorescens af kerne-DNA vil fortsat være en komplikation af disse protokoller, indtil der ikke DNA-bindende bakterielle rentabilitet farvestoffer er udviklet.

På trods af disse begrænsninger, protokollerne i denne artikel give en følsom måde at vurdere levedygtigheden af ​​de enkelte bakterier er knyttet til og inde eukaryote celler. Kimtal eller gentamicin-beskyttelse assays har været rygraden i mikrobiel patogenese forskning. Men de provide en vurdering af bakteriel overlevelse på tværs af en potentielt heterogen population. I modsætning hertil levedygtighed farvning protokoller beskrevet her tillader integriteten af ​​de enkelte bakterier der skal undersøges. Derfor kan forskerne indsamle data om skæbner ekstracellulære vs intracellulære bakterier, bakterier i forskellige phagosomal typer eller bakterier i en phagosome vs cytoplasmaet. Tyndslib transmission elektronmikroskopi er ofte blevet brugt til at undersøge levedygtigheden af ​​de enkelte bakterier. Mens bakterier, der vises elektron-Lucent eller ikke længere intakt ved TEM klart nonviable, er det vanskeligere at vurdere, om bakterier, der bevarer en vis elektron tæthed i deres cytoplasma er faktisk intakt. Derudover kan det tage mange timer af elektronmikroskop tid til at erhverve nok mikrografer at analysere, mens mange energibesparende felter kan erhverves fra celler udsat for fluorescens-baserede levedygtighed farvestoffer, selv i den korte tid, der ydes til billede erhvervelse. Mens bestemded protokoller blev optimeret med N. gonorrhoeae og primære humane neutrofiler, kan de være indrettet til at vurdere levedygtigheden af mange arter af gram-negative og gram-positive bakterier i en række celletyper, herunder alle fagocytiske og nonphagocytic eukaryote celler ^5,15-24,26. Bakteriel levedygtighed farvestoffer giver en kraftig eksperimentel værktøj til at undersøge mekanismerne i bakteriel patogenese i eukaryote celler og evnen af ​​eukaryote celler til at kontrollere bakteriel infektion. I fremtiden må forventes at blive endnu mere nyttigt med bedre redskaber til erhvervelse og behandling automatiseret billede, sammen med udviklingen af ​​bakterielle levedygtighed farvestoffer, der er kompatible med aldehyd fiksering og specifikt for prokaryoter disse protokoller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377