Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50729
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

Summary

Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen.

Abstract

Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Huidige protocollen om deze vragen te beantwoorden zijn onder kolonietelling assays, gentamicine protection assays en elektronenmicroscopie. Kiemgetal en bescherming gentamicine assays alleen de levensvatbaarheid van de totale bacteriële populatie te beoordelen en in staat zijn om individuele bacteriële levensvatbaarheid te bepalen. Elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van individuele bacteriën bepalen en informatie over hun lokalisatie in gastheercellen. Echter, bacteriën vertonen vaak een aantal elektron dichtheden, waardoor de beoordeling van de levensvatbaarheid moeilijk. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen. Deze testen werden oorspronkelijk ontwikkeld om de overleving van Neisseria gonorrhoeae beoordelen in primaire humane neutrofielen, maar moet eenpplicable aan een bacterie-gastheercel interactie. Deze protocollen gecombineerd membraan-permeabele fluorescente kleurstoffen (SYTO9 en 4 ',6-diamidino-2-fenylindool [DAPI]), die alle bacteriën kleuren met membraan-ondoorlaatbare fluorescerende kleurstoffen (propidiumjodide en SYTOX Green), die alleen toegankelijk zijn levensvatbaar bacteriën. Vóór eukaryotische cel permeabilisatie, wordt een antilichaam of fluorescerend reagens extracellulaire bacteriën te identificeren. Dus deze assays discrimineren de levensvatbaarheid van bacteriën aanhanger en in eukaryotische cellen. Een protocol is ook voorzien voor gebruik van de levensvatbaarheid kleurstoffen in combinatie met fluorescente antilichamen tegen eukaryote cel markers om de subcellulaire lokalisatie van individuele bacteriën te bepalen. De bacteriële levensvatbaarheid kleurstoffen besproken in dit artikel zijn een gevoelig aanvulling en / of alternatief voor de traditionele microbiologie technieken om de levensvatbaarheid van de individuele bacteriën evalueren en informatie verstrekken over waar bacteriën overleven in gastheercels.

Introduction

Er is een dynamische interactie en co-evolutie tussen bacteriën en de gastheren waar zij wonen. Bacteriën hechting organellen, secretie systemen, en / of de mogelijkheid om toxines die hun productieve infectie van gastheer fagocytische en niet-fagocytische cellen inschakelen produceren geëvolueerd. De bacteriën moet maken met herkenning en antimicrobiële activiteiten van het gastheerimmuunsysteem. De gastheer immuunsysteem bestaat uit aangeboren en adaptieve componenten, waaronder fysische en chemische barrières, immuuncellen, het complementsysteem, en andere onderdelen van humorale immuniteit. Hoewel veel bacteriën gevoelig voor doden en goedkeuring door het meerlagige immuunrespons hebben sommige pathogene en opportunistische bacteriën mechanismen van verschillende gastheercellen infecteren en ontwrichting goedkeuring door de immuunrespons 1 ontwikkeld. Neisseria gonorrhoeae is een voorbeeld van een bacterieel pathogeen dat is zeer geschikt om te volharden in zijn menselijke gastheer. N. gonorrhoeae koloniseert gemakkelijk de luminale oppervlakken van mucosale epitheliale cellen van het urogenitale kanaal, keelholte, conjunctiva en rectum. Kolonisatie leidt tot de overvloedige rekrutering van neutrofielen bij mucosale sites. Neutrofielen zijn professionele fagocyten die diverse antimicrobiële processen micro-organismen doden bezitten, maar N. gonorrhoeae kan overleven in de aanwezigheid van neutrofielen 2-5. Begrijpen hoe bacteriële pathogenen zoals N. gonorrhoeae ondermijnen, onderdrukken en kapen de immuunrespons uiteindelijk overleven in normaal vijandige hostomgevingen is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de bestrijding van infectieziekten.

Experimentele protocollen vaak gebruikt om bacteriële overleving onderzoeken gastheercellen omvatten kolonietelling assays, gentamicine protection assays en elektronenmicroscopie. In kiemgetal assays wordt een populatie van geïnfecteerde cellen gelyseerd (bijvoorbeeld met een wasmiddel which de bacteriën resistent) om de bacteriën te bevrijden. De lysaten verdund en uitgeplaat op agar media en kolonievormende eenheden in de lysaten worden geteld voor elk tijdstip en / of experimentele conditie. Deze benadering meldt de levensvatbaarheid van de totale bacteriële populatie, maar is niet in staat onderscheid te maken tussen de intracellulaire en extracellulaire overleving. Een variatie op het kiemgetal assay bescherming gentamicine assay specifiek meet intracellulaire bacteriële overleving, gebaseerd op het onvermogen van de antibiotica gentamicine de eukaryote plasmamembraan 6 steken. Echter, deze test is afhankelijk van de bacteriën gevoelig voor doding door gentamicine (of een ander antibioticum dat eveneens eukaryote membraan-impermeant) en het onvermogen van het antibioticum toegang tot interne bacteriën. Daarom kan een bescherming gentamicine assay niet effectief zijn voor de behandeling van bacteriële soort of bij de behandeling van bacteriële overleving in sterkpinocytose cellen zoals neutrofielen. Geen van deze benaderingen onthult de subcellulaire lokalisatie of ander gedrag van individuele bacteriën (bijvoorbeeld als de bacteriën vormen aggregaten of microkolonies die anders individuele bacteriële cellen zich gedragen). Een andere vaak gebruikte benadering om de levensvatbaarheid van individuele externe en interne bacteriën worden onderzocht dunne plaat transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Deze benadering heeft het voordeel dat het kan informatie over de locatie van de bacteriën in gastheercellen (bijvoorbeeld fagosoom, cytoplasma, autophagosome), die verder kunnen worden onderzocht door immuno-elektronenmicroscopie met goud gekoppelde antilichamen tegen subcellulaire markers. Echter, elektronenmicroscopie is niet bijzonder gevoelig op het beoordelen van bacteriële levensvatbaarheid. Wanneer ingebedde secties worden gekleurd met uranylacetaat, loodcitraat of andere elektron-dichte reagentia en afgebeeld door elektronenmicroscopie worden elektron-dichte levensvatbare bacteriën en elektronische beschouwdtron-Lucent nonviable 7,8. Echter, deze veronderstelling overschat bacteriële levensvatbaarheid, omdat alleen die dode bacteriën met ernstig verstoord membranen en verstoken van cytoplasma verschijnen elektron-Lucent. Bovendien kunnen sommige bacteriesoorten verschillende elektronendichtheden beeldscherm afhankelijk van het stadium van de groei, waardoor het moeilijk levensvatbaar bepalen.

Als alternatief of in aanvulling op deze gebruikte methoden, hier bieden wij protocollen en redenen voor het gebruik van fluorescente kleurstoffen die bacteriële levensvatbaarheid aan om de overleving van bacteriën bevestigd aan en geïnternaliseerd door gastheercellen te beoordelen. Om extracellulaire bacteriën te identificeren, worden geïnfecteerde cellen eerst blootgesteld aan een fluorescerend reagens, zoals een lectine of bacterie-specifiek antilichaam. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens permeabel en blootgesteld aan DNA-specifieke kleurstoffen die differentieel toegankelijk bacteriën met intacte versus gedegradeerde membranen als een surrogaat voor bacteriële levensvatbaarheid. In de eerste pROTOCOL, het membraan permeabel kleurstof SYTO9 identificeert de totale bacteriële populatie, terwijl propidiumjodide is alleen toegankelijk voor de bacteriën die membranen hebben gecompromitteerd en worden dus beschouwd als niet-levensvatbaar. Propidiumjodide en SYTO9 zijn gebruikt om bacteriële levensvatbaarheid evalueren biofilms, onderscheiden van pathogene pathogene bacteriën en opsommen levensvatbare watergedragen bacteriën 9-12. In het tweede protocol, 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindool (DAPI) identificeert totale bacteriën, terwijl SYTOX Groen is alleen toegankelijk voor de niet-levensvatbaar bevolking. De levensvatbaarheid kleurstof paren te combineren met immunofluorescentie op locatie elke bacterie bepalen met betrekking tot een eiwit van belang, bijvoorbeeld bacteriële subcellulaire lokalisatie definiëren. Het gebruik van deze assays biedt belangrijke inzicht in de interacties die resulteren in bacteriële doden of overleving tijdens infectie van gastheercellen. De in dit artikel protocollen werden gebruikt om de levensvatbaarheid van beoordelenN. gonorrhoeae die van en in primaire humane neutrofielen, ook in verschillende populaties van neutrofielen phagosomes 5,13,14 bevestigd. Echter, deze protocollen worden toegepast om de levensvatbaarheid van gram-positieve en gram-negatieve bacteriën beoordelen professionele fagocyten, niet-professionele fagocyten en protozoa 15-24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Het beoordelen van Bacteriële levensvatbaarheid met propidiumjodide en SYTO9

  1. Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met bacteriën van belang. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen.
  2. Spoel cellen eenmaal voorzichtig in 0,1 M 3 - (N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS), pH 7,2, bevattende 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl2).
  3. Incubeer cellen gedurende 10 min in het donker bij kamertemperatuur met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren.

OPMERKING: Gedrag controles met levende en dode bacteriën, in afwezigheid van gastheercellen aan te tonen dat het lectine of antilichaam van belang bindt alle bacteriën ongeacht levensvatbaarheid (figuur 1).

  1. Spoel cellen twee keer met MOPS / MgCl2.
  2. Aspireren media uit cellen en voeg 0,5 ml Levend / Dead Kleuroplossing. Levend / Dead Kleuroplossing is 5uM SYTO9, 30 uM propidiumjodide, en 0,1% saponine (uiteindelijke concentraties) in MOPS / MgCl2.
  3. Incubeer cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2.
  5. Omkeren coverslips gezicht naar beneden op glasplaatjes en afdichting met duidelijke nagellak. Heeft montage media niet gebruiken.
  6. Acquire beelden binnen 30 minuten, met behulp van een fluorescentiemicroscoop met filter sets compatibel met groen, rood en ver-rood afbeelding acquisitie.

OPMERKING: Beide conventionele fluorescentiemicroscopie en confocale laser scanning microscopie worden gebruikt. Na 30 min de fluorescente kleurstoffen beginnen te lekken uit de bacteriën en de verkregen gegevens niet langer juist zijn. De afbeeldingen in dit artikel zijn verkregen op een Nikon Eclipse E800 rechtop fluorescentiemicroscoop met Hamamatsu Orca-ER digitale camera met Openlab software. Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 590-650 nm en een emissie-filter van 663-735 nm en vals-kleur blauw. Fluorescentie van propidiumjodide werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 540-580 nm en een emissie-filter van 600-660 nm. Fluorescentie van SYTO9 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm.

  1. Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen blauw + rood, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen alleen rood, externe levensvatbare bacteriën verschijnen blauw + groen, en de interne levensvatbare bacteriën verschijnen alleen groen. Tellen door het oog van de aantallen bacteriën die externe levensvatbaar, interne niet-levensvatbare, externe levensvatbaar, en interne levensvatbaar zijn.
  2. Bereken het percentage externe levensvatbare bacteriën door het aantal externe levensvatbare bacteriën door het totale aantal externe bacteriën (levensvatbare plus nonvistaat). Bereken het percentage interne levensvatbare bacteriën door het aantal interne levensvatbare bacteriën door het totale aantal interne bacteriën (levensvatbare plus levensvatbaar) (Figuur 4).
  3. Er zijn twee essentiële controles uit te voeren met dit protocol. Eerste, valideren dat alle levensvatbare bacteriën propidiumiodide-positieve en alle levende bacteriën zijn SYTO9-positief. Een mid-logaritmische kweek van bacteriën (in de afwezigheid van gastheercellen) moet> 95% SYTO9-positief zijn. Weergegeven in figuur 2 is een half-logaritmische kweek van N. gonorrhoeae (at 10 8 kolonievormende eenheden per ml) geïncubeerd met Live / Dead Kleuroplossing. Ten tweede, valideren dat zowel propidiumiodide en SYTO9 gepermeabiliseerd, geïnfecteerde gastheercellen kunt invoeren.
    1. Een populatie van dode bacteriën genereren, verzamelen 2 x 10 8 bacteriële kolonievormende eenheden in een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 70% isopropanol en 10 minuten zitten. Pellet de bacteriën in een microcentrifuge eennd tweemaal spoelen de bacteriën in PBS resterende isopropanol te verwijderen. Volg dan de stappen protocol 1,5-1,7. Voeg 5 ul van bacteriële suspensie aan een glasplaatje en overlay met een dekglaasje. Afbeelding monsters zoals in protocol stap 1.9. Onder deze omstandigheden moet 100% van de bevolking propidiumjodide-positieve (Figuur 2) zijn. In sommige bacteriesoorten kunnen propidiumjodide niet volledig overweldigen SYTO9 kleuring, en niet-levensvatbare bacteriën kan geel of oranje verschijnen.
    2. Voor fagocytische cellen zoals neutrofielen, blootstellen van de cellen te doden bacteriën en isopropanol toe dat 100% van de intracellulaire bacteriën propidiumjodide-positieve (figuur 3). Voor nonphagocytic cellen die geen dode bacteriën kunnen internaliseren, kan het voldoende zijn om geïnfecteerde cellen behandeld met natriumazide of andere cel-permeant antimicrobiële middelen voorafgaand aan het toevoegen Levend / Dead Kleuroplossing zijn.

2. Het beoordelen van Bacteriële rentabiliteit SYTOX Green en DAPI

  1. Etiket bacteriën van belang met 10 ug / ml DAPI in Morse's Defined Medium 25 gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
  2. Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met DAPI-gemerkte bacteriën. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen.
  3. Spoel cellen eenmaal met MOPS / MgCl2.
  4. Incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren. Zie opmerking in protocol stap 1.3 voor aanbevolen controles.
  5. Zuig media uit cellen en voeg 0,5 ml 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl2.
  6. Incubeer cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  7. Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2.
  8. Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten.

OPMERKING: Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 590-650 nm en een emissie-filter van 663-735 nm en vals-rood. Fluorescentie van SYTOX Green werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm. Fluorescentie van DAPI werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 355-375 nm en barrière-filter van 400 nm.

  1. Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen rood + groen, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen groen + blauw, externe levensvatbare bacteriën verschijnen rood + blauw, en de interne levensvatbare bacteriën verschijnen blauw alleen (figuur 4). Kwantificeren van de procent van de externe en interne bacteriën zoals beschreven in het protocol step 1.11.
  2. De in protocol stap 1.12 beschreven controles moeten worden uitgevoerd met de DAPI / SYTOX groene kleurstof combinatie (fig. 2 en 3).

3. Het beoordelen van Bacteriële Leefbaarheid Naast subcellulaire lokalisatie

  1. Etiket bacteriën van belang met 10 ug / ml DAPI in Morse's beschreven medium gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  2. Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met DAPI-gemerkte bacteriën. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen.
  3. Spoel cellen eenmaal met MOPS / MgCl2.
  4. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren. Zie opmerking in protocol stap 1.3 voor aanbevolen controles.
  5. Zuig media uit cellen en spoel cellen twee times in MOPS / MgCl2.
  6. Incubeer cellen met Alexa Fluor 555-gekoppeld antilichaam tegen subcellulaire marker van belang zijn voor 20 min, in MOPS / MgCl2 met 0,2% saponine.
  7. Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2.
  8. Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten.
  9. Zuig media uit cellen en voeg 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl2.
  10. Incubeer de cellen 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  11. Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2.
  12. Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten.
  13. Acquire beelden van dia's binnen 30 min op fluorescentiemicroscoop. Zie protocol stap 1.9 voor een beschrijving van de microscoop, digitale camera, en acquisitie software.

OPMERKING: Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met behulp van een filter met een golflengte van 590-650 nm en emissie filter van 663-735 nm, en vals-gekleurde paars. Fluorescentie from Alexa Fluor 555 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 540-580 nm en een emissie-filter van 600-660 nm. Fluorescentie van SYTOX Green werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm. Fluorescentie van DAPI werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 355-375 nm en barrière-filter van 400 nm.

  1. Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen paars + groen, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen groen + blauw, externe levensvatbare bacteriën verschijnen paars + blauw, interne levensvatbare bacteriën verschijnen blauw alleen, en subcellulaire eiwit lijkt rood (figuur 4). Kwantificeren van de perecent van externe en interne levende bacteriën, zoals beschreven in het protocol stappen 1.11.
  2. De in protocol stap 1.12 beschreven controles moeten worden uitgevoerd met de DAPI / SYTOX groene kleurstof combinatie (fig. 2 en 3).
  3. InNaast het tellen van levensvatbare en niet-levensvatbare bacteriën, classificeren elk bacteriën als positief of negatief voor colocalization met de subcellulaire marker van belang.
  4. Bereken het percentage van levensvatbare bacteriën colocalized de subcellulaire markering door deling van het aantal levensvatbare bacteriën colocalized door het totaal aantal levensvatbare bacteriën. Bereken het percentage levensvatbare bacteriën colocalized de subcellulaire markering door deling van het aantal niet-levensvatbaar colocalized bacteriën door het totaal aantal levensvatbare bacteriën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De geschetste protocollen werden gebruikt om overleving van N. onderzoeken gonorrhoeae na blootstelling aan primaire humane neutrofielen 5,26. Neutrofielen werden geïnfecteerd met N. gonorrhoeae en verwerkt met protocol 1, met behulp van de groene fluorescerende kleurstof SYTO9 levensvatbaarheid en de rood-fluorescerende propidiumiodide (Figuur 4A). De kleurstoffen werden toegevoegd in aanwezigheid van saponine, die cholesterol sequesters preferentieel permeabilize gastheercel plasmamembranen, niet N. gonorrhoeae membranen. Andere detergentia moeten worden getest of de membranen van de bacteriën van belang bevatten grote hoeveelheden cholesterol. Alle N. gonorrhoeae vlek met SYTO9, maar alleen bacteriën met een gecompromitteerd membranen kleuren met propidiumjodide. De propidiumiodide overwint de SYTO9 fluorescentie, dus levende bacteriën verschijnen groene en dode bacteriën verschijnen rode 27. In sommige bacteriesoorten kunnen propidiumjodide niet volledig overwonnen SYTO9 staining, wat resulteert in dode bacteriën verschijnen geel of oranje. De verhouding propidiumjodide om SYTO mei 9 moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende bacteriesoorten. Vóór de cellen permeabilisatie en het toevoegen SYTO9 en propidiumjodide werd een Alexa Fluor 647-gekoppelde sojaboon lectine toegevoegd aan de geïnfecteerde cellen extracellulaire N. detecteren gonorrhoeae, en de ver-rode fluorescentie signaal was vals-gekleurde blauw. Dus in dit protocol externe levensvatbare bacteriën verschijnen turquoise (blauw + groen) en externe nonviable verschijnen magenta (blauw + rood). Interne levensvatbare bacteriën verschijnen alleen groen (pijl), en de interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen alleen rood (pijlpunt). Het is belangrijk op te merken dat in geïnfecteerde cellen, wordt het eukaryotische celkern worden gekleurd door SYTO9 en propidiumjodide ("N", Figuur 4A). De externe levensvatbare, niet-levensvatbare externe, interne levensvatbare en niet-levensvatbare interne bacteriën werden gekwantificeerd van fluorescentiebeelden om het percentage van geïnternaliseerde bacteriën een opbrengstnd het percentage levende bacteriën binnen en buiten gastheercellen.

Figuur 4B is een representatief beeld van N. gonorrhoeae-geïnfecteerde verwerkt met protocol 2 neutrofielen, met behulp van de levensvatbaarheid kleurstoffen SYTOX Groen en DAPI. Dit protocol vermijdt het gebruik van propidiumjodide, die fluoresceert in zowel rode en ultraviolet kanalen op de fluorescentiemicroscoop. Alle N. gonorrhoeae vlek met DAPI (blauw), maar alleen bacteriën met een gecompromitteerd membranen vlek met SYTOX Green. Zoals hierboven beschreven, voor permeabilisatie van de cellen, werd een Alexa Fluor 647-gekoppelde sojaboon lectine toegevoegd aan de geïnfecteerde cellen extracellulaire N. detecteren gonorrhoeae, wiens fluorescentie in dit geval onjuiste kleur rood. Daarom externe levensvatbare bacteriën verschijnen magenta (rood + blauw) en externe niet-levensvatbare bacteriën verschijnen geel (rood + groen / blauw). Interne levensvatbare bacteriën verschijnen alleen blauw (pijlen), en de interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen groen / blauw (pijlpunten). DeAfhankelijk van de relatieve intensiteit van DAPI vs SYTOX Groene fluorescentie, kan levensvatbare bacteriën turquoise weergegeven. Vergelijkbaar met cellen verwerkt met propidiumjodide en SYTO9 wordt neutrofielen kern gekleurd door SYTOX Groene en DAPI in figuur 4B (aangeduid met "N"). Blootstelling van geïnfecteerde cellen SYTOX Green en DAPI toont het percentage internalisatie en de levensvatbaarheid van bacteriën in gastheercellen, gekwantificeerd zoals hierboven beschreven voor propidium iodide en SYTO9. Resultaten van N. gonorrhoeae-geïnfecteerde neutrofielen verwerkt met SYTOX Groen en DAPI zijn vergelijkbaar met die verkregen met propidiumjodide en SYTO9 26.

Zoals weergegeven in figuur 4C, protocol 3 is een aanpassing van protocol 2, waarbij de bacteriële levensvatbaarheid kleurstoffen gecombineerd met immunofluorescentie voor de primaire of azurofiele neutrofielen granule eiwit CD63. Dit experiment werd uitgevoerd om de samenstelling van phagosome compartimenten definiëren inside neutrofielen dat levensvatbare als niet-levensvatbare N. bevatten gonorrhoeae 26. Dit protocol is een microscoop voor vier-kleuren fluorescentie mogelijkheid om levensvatbare bacteriën, niet-levensvatbare bacteriën, extracellulaire bacteriën en subcellulaire marker te detecteren. Aangezien de levensvatbaarheid kleurstoffen niet geschikt aldehyde fixatie (onze niet gepubliceerde waarnemingen), voerden we immunofluorescentie zonder fixatie, gebruik van een antilichaam direct gekoppeld met een fluorofoor om de tijd die nodig is om het antigeen te detecteren in cellen minimaliseren. Het antilichaam wordt gekoppeld aan de rode fluorofoor Alexa Fluor 555. Zoals in protocol 2, werden levensvatbare en niet-levensvatbare bacteriën onderscheiden met DAPI en SYTOX Green, respectievelijk, en externe bacteriën werden gekleurd met Alexa 647-gekoppelde sojaboon lectine. Externe bacteriën fluoresceren ver-rood en zijn vals-gekleurde paars. Externe levensvatbare bacteriën verschijnen paars + blauw en externe niet-levensvatbare bacteriën verschijnen paars + groen / blauw. Interne levensvatbare bacteriën verschijnen blauw (pijl) en internal levensvatbaar bacteriën verschijnen groen (pijlpunt). CD63-positieve korrels en phagosomes verschijnen rood. De neutrofielen kern wordt gekleurd met de DNA specifieke kleurstoffen ("N"). Bij het ​​analyseren van deze beelden werd elke individuele bacterie geclassificeerd als externe versus interne, levensvatbare versus niet-levensvatbare en positief of negatief voor een ring van CD63 kleuring. N. gonorrhoeae werd geacht te verblijven in een CD63-positieve neutrofielen phagosome als er ≥ 50% van een ring van CD63 fluorescentie rondom de bacteriën, en een CD63-negatieve phagosome als er <50% van een ring van CD63 fluorescentie rondom de bacterie . De levensvatbaar intracellulaire bacterie aangegeven door de pijl in figuur 4C heeft een ring van kleuring voor CD63 rondom de bacteriën. Deze ring geeft aan primaire korrels worden verrijkt op dit phagosome. De levensvatbare intracellulaire bacterie, aangeduid door de pijl, mist kleuring voor CD63, aan primaire korrels niet verrijkt zijn phagosome. Wijdeze techniek om een correlatie tussen de levensvatbaarheid van N. tonen gonorrhoeae en verblijf in een primaire korrel-negatieve phagosome 26. Omdat deze test circuits zowel bacteriële levensvatbaarheid en lokalisatie met een eiwit van belang, is het mogelijk te bepalen of levensvatbaar en levensvatbare bacteriën in dezelfde of verschillende locaties bevinden. Deze informatie geeft belangrijke eerste inzicht in mechanismen die bijdragen aan bacteriële overleving in gastheercellen.

Figuur 1
Figuur 1. Een mengsel van levensvatbare en niet-levensvatbaar N. gonorrhoeae werd blootgesteld aan de Alexa Fluor 647-gekoppelde sojaboon lectine, propidiumjodide en SYTO9 volgens protocol 1, in afwezigheid van gastheercellen. Alle bacteriën zijn toegankelijk voor de lectine en fluoresceren blauw. Niet-levensvatbare bacteriën verschijnen blauw + rood en niet-levensvatbare bacteriën verschijnen blauw+ Groen.

Figuur 2
Figuur 2. (AB) Mid-logaritmische fase N. gonorrhoeae werd blootgesteld aan propidiumjodide en SYTO9 zoals in protocol 1, met (A) of zonder (B) isopropanol behandeling om de bacteriën te doden. levensvatbare bacteriën zijn toegankelijk voor propidium jodide en worden rood. Levensvatbare bacteriën worden gekleurd met SYTO9 en groen weergegeven. (CD) Mid-logaritmische fase N. gonorrhoeae werd blootgesteld aan DAPI en SYTOX Groen als in protocol 2, met (C) of zonder (D) isopropanol behandeling om de bacteriën te doden. Niet-levensvatbare bacteriën zijn toegankelijk voor DAPI en SYTOX Groen en verschijnen blauw + groen. Levensvatbare bacteriën worden gekleurd met alleen DAPI en verschijnen alleen blauw.

alt = "Figuur 3" fo: content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50729/50729fig3.jpg" />
Figuur 3. (A) Neutrofielen werden toegestaan ​​te binden en te internaliseren isopropanol gedood N. gonorrhoeae, vervolgens blootgesteld aan propidiumiodide en SYTO9 volgens protocol 1. Niet-levensvatbare bacteriën worden gekleurd met propidiumjodide en zijn rood. Aangezien alle bacteriën zijn niet levensvatbaar, geen SYTO9 positieve, groene bacteriën worden zichtbaar. (B) Neutrofielen mochten binden en te internaliseren-isopropanol gedood N. gonorrhoeae, vervolgens blootgesteld aan DAPI en SYTOX Green volgens protocol 2. Niet-levensvatbare bacteriën worden gekleurd met DAPI en SYTOX Groen en verschijnen blauw + groen. Zoals alle bacteriën zijn niet levensvatbaar, geen DAPI alleen, blauw alleen bacteriën worden zichtbaar. N labelt de neutrofielen kern. Schaal bar = 5 micrometer. Pijlpunten geven sommige levensvatbaar bacteriën.

in "src =" / files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg "/>
Figuur 4. (A) N. gonorrhoeae-geïnfecteerde menselijke neutrofielen werden blootgesteld aan Alexa Fluor 647-gekoppelde sojaboon lectine (false kleur blauw) en permeabel gemaakt met saponine in aanwezigheid van de levensvatbaarheid kleurstoffen propidiumjodide (rood), dode bacteriën label en SYTO9 (groen), om levende bacteriën tegenkleuring. Externe nonviable bacteriën verschijnen blauw + rood, interne niet-levensvatbare bacteriën lijken rood, enkel extern levensvatbare bacteriën verschijnen blauw + groen, en de interne levensvatbare bacteriën verschijnen alleen groen. (B) N. gonorrhoeae werd gelabeld met DAPI (blauw), voorgelegd aan neutrofielen. Geïnfecteerde cellen werden vervolgens blootgesteld aan Alexa Fluor 647-gekoppelde sojaboon lectine (false kleur rood), daarna permeabel gemaakt met saponine in aanwezigheid van SYTOX Green (groen) om dode bacteriën label. Externe niet-levensvatbare bacteriën verschijnen rood + groen, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen groen + blauw, externe levensvatbare bacria verschijnen rood + blauw, en de interne levensvatbare bacteriën verschijnen alleen blauw. (C) N. gonorrhoeae-geïnfecteerde neutrofielen werden verwerkt zoals in B, behalve een Alexa Fluor 555-gekoppelde antilichaam tegen neutrofiel primaire granule eiwit CD63 (rood) werd toegevoegd bij de permeabilisatie. De Alexa Fluor 647-soja lectine kleuring was vals-gekleurde paars. Externe niet-levensvatbare bacteriën verschijnen paars + groen, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen alleen groen, externe levensvatbare bacteriën verschijnen paars + blauw, interne levensvatbare bacteriën verschijnen blauw alleen, en CD63 kleuring verschijnt rood. De inzet toont de CD63 fluorescentie van het gebied van de afbeelding aangeduid met het witte vierkant. In AC, N labelt de neutrofielen kern. Schaal bar = 5 micrometer. Pijlpunten geven levensvatbaar bacteriën en pijlen geven levensvatbare bacteriën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier voorgesteld zijn twee protocollen die gebruik maken DNA binding en levensvatbaarheid kleurstoffen in combinatie met een fluorescerend lectine om levende en dode bacteriën bevestigd aan en in menselijke cellen te identificeren. Aangezien beide protocollen effectief discrimineren live vanuit dode bacteriën, de keuze van welk protocol te gebruiken hangt af van het doel van het experiment. Het eerste protocol gebruikt propidiumjodide om levensvatbaar bacteriën en SYTO9 om intacte bacteriën detecteren detecteren. Weergegeven in Figuur 4A is een representatief beeld van protocol 1 toegepast op menselijke neutrofielen geïnfecteerd met N. gonorrhoeae. Deze kleurstoffen werden gecombineerd met een lectine, soja agglutinine, extracellulaire N. herkennen gonorrhoeae, maar een fluorescent gekoppelde bacterie-specifiek antilichaam kunnen worden gebruikt als alternatief. Protocol nr. 1 gemakkelijk onthult de levensvatbaarheid van individuele bacteriën, omdat uitsluiting van SYTO9 door propidiumiodide maakt levensvatbare bacteriën fluoresceren rood en levensvatbare bacteriën fluoresceren groen. However, kan dit protocol niet worden gecombineerd met immunofluorescentie voor host eiwitten vanwege de fluorescentie van propidiumjodide in twee van de vier kanalen conventionele fluorescentiemicroscopie. Derhalve protocol 2 ontwikkeld, die gebruik maakt SYTOX Groen naar levensvatbaar bacteriën en DAPI identificeren de totale bacteriële populatie te detecteren. Een voorbeeld van N. gonorrhoeae verbonden en in menselijke neutrofielen en verwerkt met behulp SYTOX Green en DAPI is getoond in fig. 4B en een voorbeeld in combinatie met immunofluorescentie is getoond in figuur 4C. Naast de beschikbaarheid van twee extra fluorescentie kanalen, dit protocol is voordelig voor het gebruik door personen met rood-groen kleurenblindheid. Echter, levensvatbare bacteriën groen of blauw-groen fluoresceren, afhankelijk van de relatieve intensiteit van DAPI en SYTOX groene kleuring en de beeldacquisitie parameters. Een nadeel van het gebruik van DAPI is dat het kan lekken uit N. gonorrhoeaetijdens infectie, hoewel dit geen probleem voor andere bacteriën zoals Staphylococcus aureus (onze niet gepubliceerde waarnemingen) zijn. Om dit probleem tegen te gaan, werden geïnfecteerde cellen gelabeld met DAPI met SYTOX Green na infectie, maar de intensiteit van de nucleaire DAPI kleuring overweldigd de fluorescentie van N. gonorrhoeae (onze gepubliceerde waarnemingen). Naast deze twee protocollen kunnen andere commercieel verkrijgbare kleurstoffen worden gebruikt om bacteriële levensvatbaarheid onthullen. Zo kan carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) de totale bacteriële populatie label en SYTOX oranje of blauw kan levensvatbare bacteriën te identificeren. Aangezien de relatieve werkzaamheid van deze procedure is afhankelijk van de bacterie geïnfecteerde celtype, is het belangrijk dat onderzoekers vergelijken verschillende levensvatbaarheid kleurstof combinaties hun besmetting systemen.

Momenteel zijn we handmatig onderzoeken elk beeld verkregen met deze protocollen te kwantificeren percent internalisatie, percentage levensvatbaarheid intracellulair en extracellulair en colocalization met subcellulaire markers. Hoewel geautomatiseerde gecomputeriseerde methode kan theoretisch worden gebruikt om deze parameters te kwantificeren, kunnen zij worden gecompliceerd door niet-uniforme kleuring van de bacteriën levensvatbaarheid kleurstoffen en sterke fluorescentie signaal van de celkern. Ook kan het nodig zijn de definitie van bacteriële colocalization met een subcellulaire marker worden geoptimaliseerd voor de bacteriën, celtype en marker van belang.

Een beperking van deze protocollen is de aanname dat de doorlaatbaarheid voor propidium jodide of SYTOX Green is een ware maat van bacteriële dood. Het molecuulgewicht van propidiumjodide en SYTOX Groen is 668,4 Da en 600 Da, respectievelijk. Deze kleurstoffen worden beschouwd membraan-impermeant en mogen geen toegang tot de bacteriële cytoplasma tenzij de bacteriën niet herstelde membraan schade. Toch blijft de mogelijkheid bestaan ​​dat de bacteriën in een toestand van stasisof zelfs hun membraan schade te herstellen en blijven groeien op latere tijdstippen. Een tweede beperking is dat de protocollen niet toestaan ​​dat de levensvatbaarheid van individuele bacteriën worden gevolgd in de tijd. Life Technologies beveelt evaluatie van bacteriële levensvatbaarheid met propidiumjodide en SYTO9 worden uitgevoerd binnen 30 minuten na blootstelling aan de kleurstoffen, aangezien de bacteriën levensvatbaarheid verliezen langer ze gemonteerd en afgebeeld door fluorescentiemicroscopie. Geïnfecteerde cellen gelabeld met de DAPI / SYTOX Groene kleurstof combinatie moet ook snel worden afgebeeld nadat de montage (onze gepubliceerde waarnemingen). Ten derde, de protocollen zijn niet compatibel met gebruikelijke fixatietechnieken. Methanol of aceton fixatie zal doorlaatbaar en doodt de bacteriën in verband met gastheercellen en-aldehyde gebaseerde fixatieven permeabilize N. gonorrhoeae in menselijke neutrofielen te propidiumjodide en SYTOX Green (ongepubliceerde waarnemingen). Dus via deze protocollen vereist onmiddellijke toegang tot een fluorescentie MICRoscope en de mogelijkheid om de protocollen voltooien in een dag. Tenslotte elk van de kleurstoffen die in deze protocollen binden dubbelstrengs nucleïnezuren en binden gastheer nucleair DNA en het bacterieel DNA (Figuur 1). Door fluorescentie van nucleair DNA aanzienlijk helderder dan de fluorescentie van bacterieel DNA, kan de levensvatbaarheid van de bacteriën die in de nabijheid van de eukaryotische kern niet worden beoordeeld. Confocale laser scanning microscopie en voormerkend bacteriën met DAPI bijdragen tot het verminderen van de nucleaire fluorescentie-signaal. Fluorescentie van nucleair DNA is een complicatie van deze protocollen totdat de niet-DNA-bindende bacteriële levensvatbaarheid kleurstoffen worden ontwikkeld.

Ondanks deze beperkingen, de protocollen in dit artikel voorzien gevoelige manier om de levensvatbaarheid van individuele bacteriën bevestigd aan en in eukaryotische cellen te bepalen. Kiemgetal of gentamicine-bescherming assays zijn de ruggengraat van microbiële pathogenese onderzoek. Echter, ze provide evaluatie van bacteriële overleving in een potentieel heterogene populatie. Daarentegen werd de levensvatbaarheid kleurstof protocollen beschreven kan de integriteit van individuele bacteriën worden onderzocht. Daarom kunnen onderzoekers gegevens over het lot van extracellulaire tegen intracellulaire bacteriën, bacteriën in verschillende phagosomal of bacteriën in een fagosoom versus cytoplasma verzamelen. Slijpplaatje transmissie elektronenmicroscopie is vaak gebruikt om de levensvatbaarheid van individuele bacteriën te onderzoeken. Hoewel bacteriën die elektronen-lucent of niet meer intact TEM verschijnt duidelijk levensvatbaar, is het moeilijker te beoordelen of bacteriën die sommige elektronendichtheid behouden hun cytoplasma zijn ongeschonden. Bovendien kan het vele uren van elektronenmicroscoop tijd nemen om voldoende micro-opnamen te analyseren verwerven, terwijl veel low-power velden kan worden verkregen van cellen blootgesteld aan fluorescentie gebaseerde levensvatbaarheid kleurstoffen, zelfs in de korte tijd geboden voor het verwerven. Terwijl de bepaded protocollen werden geoptimaliseerd met N. gonorrhoeae en primaire humane neutrofielen, kunnen ze worden aangepast om de levensvatbaarheid van veel soorten van gram-negatieve en gram-positieve bacteriën in verschillende celtypes, met inbegrip van alle fagocytische en nonphagocytic eukaryote cellen 5,15-24,26 beoordelen. Bacteriële levensvatbaarheid kleurstoffen een krachtige experimentele methode mechanismen van bacteriële pathogenese in eukaryote cellen en het vermogen van eukaryote cellen om bacteriële besmetting te bestrijden onderzoeken. In de toekomst deze protocollen waarschijnlijk nog handiger betere instrumenten voor automatische beeld en verwerken, samen met de ontwikkeling van bacteriële levensvatbaarheid kleurstoffen die geschikt aldehyde fixatie en specifiek voor prokaryoten zijn geworden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Asya Smirnov en Laura Gonyar voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH R00 TW008042 en R01 AI097312 om AKCMBJ werd mede ondersteund door NIH T32 AI007046.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection Becton Dickinson 367251  
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml Becton Dickinson 366480  
Sterile water for irrigation Baxter 07-09-64-070  
Dextran 500 Sigma 31392  
Sodium Chloride Fisher Scientific S641  
Dextrose Ricca Chemical Company RDCD0200  
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ Thermo Scientific SH3002802  
Ficoll solution GE Healthcare 17-1440-03  
Acetic Acid Fisher Scientific BP2401  
12 mm circular glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
24-well plates Corning Incorporated 3524  
Pooled Human Serum Sigma S7023  
RPMI Mediatech 15-040-CV  
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007103  
Human interleukin-8 R&D Systems 208-IL/CF  
MOPS Sigma M3183  
MgCl2 Fisher Scientific BP214  
Propidium Iodide Life Technologies L7007 or L7012  
SYTO9 Life Technologies L7007 or L7012  
Saponin Fluka Analytical 47036  
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin Life Technologies L-32463  
DAPI Sigma D8417  
SYTOX Green Life Technologies S7020  
Mouse anti-CD63 Developmental Studies Hybridoma Bank H5C6  
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit Life Technologies A20187  
Hemacytometer Bright Line Hausser Scientific 1492  
Forceps EMS 78320  
Sorvall Legend RT + Centrifuge Thermo Scientific 75004377  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Tags

Microbiologie Immunologie Infectie Cancer Biology genetica celbiologie moleculaire biologie Geneeskunde Biomedische Technologie microscopie confocale microscopie fluorescentie bacteriën bacteriële infecties en Mycoses bacteriën infectie levensvatbaarheid fluorescentie microscopie cel imaging
Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, M. B., Criss, A. K.… More

Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (79), e50729, doi:10.3791/50729 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter