Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50729
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

Summary

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.

Abstract

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. פרוטוקולים הנוכחיים כדי לענות על שאלות אלה כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. מבחני ספירת מושבה והגנת גנטמיצין רק להעריך את הכדאיות של אוכלוסיית החיידקים כולה ואינם מסוגלים לקבוע כדאיות חיידקים בודדות. במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע לגבי הלוקליזציה שלהם בתאי מארח. עם זאת, לעתים קרובות חיידקים להציג מגוון רחב של צפיפויות אלקטרונים, ביצוע הערכה של יכולת קיום קשה. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח. מבחני אלו פותחו במקור כדי להעריך הישרדות של Neisseria gonorrhoeae בנויטרופילים אנושיים ראשוניים, אבל צריך להיותpplicable לכל אינטראקציה תא חיידק מארח. פרוטוקולים אלה משלבים צבעי קרום חדיר ניאון (SYTO9 ו4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), שמכתים את כל חיידקים, עם צבעי קרום בלתי חדיר ניאון (יודיד propidium וSytox ירוק), שהם נגישים רק ל חיידקי nonviable. לפני permeabilization תא אוקריוטים, נוגדן או מגיב ניאון מתווסף לזהות חיידקים תאיים. לכן מבחני אלה מפלים את הכדאיות של חיידקים חסידים ולבתוך תאי אוקריוטים. פרוטוקול הוא גם סיפק לשימוש בצבעי הכדאיות בשילוב עם נוגדני ניאון לסמני תא אוקריוטים, על מנת לקבוע את לוקליזציה subcellular של חיידקים בודדים. צבעי כדאיות החיידקים שנדונו במאמר זה הם מוצר משלים רגיש ו / או תחליף לטכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות כדי להעריך את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע בדבר שבו חיידקים לשרוד בתא מארחs.

Introduction

יש אינטראקציה דינמית ואבולוציה משותפת בין חיידקים והמארחים שבו הם מתגוררים. חיידקים התפתחו האברונים דבקות, מערכות הפרשה, ו / או את היכולת לייצר רעלים המאפשרים זיהום הפורה של phagocytic המארח ותאים שאינם phagocytic. החיידקים חייבים גם להתמודד עם הכרה ופעילות מיקרוביאלית של מערכת החיסון המארחת. המערכת החיסונית של המארח מורכבת ממרכיבים מולדים ובעלי כושר הסתגלות, כולל מחסומים פיסיקליים וכימיים, תאי מערכת החיסון, מערכת המשלימה, ורכיבים אחרים של חסינות הלחות. בעוד חיידקים רבים רגישים להרג ולאישור על ידי התגובה חיסונית מארח רב שכבתית, כמה חיידקים פתוגניים ואופורטוניסטיים התפתחו מנגנונים להדביק מגוון רחב של תאי מארח ולחתור תחת אישור על ידי התגובה חיסונית מארח 1. Neisseria gonorrhoeae הוא דוגמא אחת לפתוגן חיידקים כי הוא מותאם מאוד להתמיד במארח האנושי שלה. N. gonorrhoeae קלות colonizes משטחי luminal של תאי האפיתל ברירית של דרכי השתן ואברי המין, לוע, לחמית, ופי טבעת. קולוניזציה מעוררת את גיוס שפע של נויטרופילים באתרים ברירית. הנויטרופילים הם phagocytes המקצועי שיש להם מגוון רחב של תהליכים מיקרוביאלית להרוג מיקרואורגניזמים, עם זאת, נ ' gonorrhoeae הוא מסוגל לשרוד בנוכחות של נויטרופילים 2-5. הבנה כיצד חיידקים פתוגנים, כגון נ gonorrhoeae לערער, ​​לדכא, ולחטוף את התגובה החיסונית כדי לשרוד סופו של דבר בסביבות מארח בדרך כלל עוינות הוא קריטי לפיתוח של טיפולים חדשים למאבק במחלות זיהומיות.

פרוטוקולי ניסוי משמשים לעתים קרובות כדי לחקור הישרדות חיידקים בתאי מארח כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. במבחני ספירת מושבה, אוכלוסייה של תאים נגועים lysed (למשל, עם חומר ניקוי ל"שich החיידקים עמידים) כדי לשחרר את החיידקים. Lysates הוא בדילול ומצופה על תקשורת מבוססת אגר, ומושבת יוצרי יחידות בlysates ממוספרת עבור כל נקודת זמן ו / או תנאי ניסוי. גישה זו מדווחת על יכולת הקיום של אוכלוסיית החיידקים כולה, אבל הוא לא מסוגל להבדיל בין תאיים והישרדות תאית. וריאציה על assay ספירת מושבה, assay הגנת גנטמיצין, במיוחד מודדת הישרדות חיידקים תאית, המבוסס על חוסר היכולת של גנטמיצין האנטיביוטיקה לחצות את קרום הפלזמה אוקריוטים 6. עם זאת, assay זה תלוי בחיידקים שרגישים להרג על ידי גנטמיצין (אנטיביוטי או אחר, כי הוא קרום impermeant דומה אוקריוטים) וחוסר היכולת של האנטיביוטיקה כדי לקבל גישה לחיידקים פנימיים. לכן, assay הגנת גנטמיצין לא יכול להיות יעיל לבדיקה של כל מיני החיידקים או כאשר בוחנים את הישרדות חיידקים במאודתאי pinocytic כגון נויטרופילים. אף אחת מהגישות הללו חושף את לוקליזציה subcellular או התנהגות של חיידקים בודדים אחרת (למשל, אם החיידקים ליצור אגרגטים או microcolonies שמתנהג בצורה שונה מתאי חיידקים בודדים). גישה בשימוש תכופה נוספת כדי לבחון את הכדאיות של חיידקים חיצוניים ופנימיים בודדים היא מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים דק סעיף (TEM). גישה זו יש יתרון בכך שהוא יכול לספק מידע לגבי מיקומם של החיידקים בתאי מארח (למשל phagosome, ציטופלסמה, autophagosome), אשר יכול להיחקר יותר על ידי מיקרוסקופ immunoelectron עם נוגדני מצמידים זהב נגד סמני subcellular. עם זאת, במיקרוסקופ אלקטרונים אינו רגיש במיוחד בהערכת כדאיות חיידקים. כאשר חלקים מוטבעים מגואלות אצטט uranyl, ציטראט עופרת, או חומרים כימיים אלקטרונים צפופים אחרים וצלמו על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, חיידקי אלקטרונים צפופים נחשבים קיימא וelecטרון-Lucent 7,8 nonviable. עם זאת, הנחה זו מגזים בהערכת כדאיות חיידקים, שכן חיידקים מתים האלה רק עם קרומים ונטולי ציטופלסמה שיבשו קשות מופיעה אלקטרונים לוסנט. בנוסף, חלק ממיני חיידקים עשויים להציג מגוון של צפיפויות אלקטרונים בהתאם לשלב צמיחה שלהם, ולכן קשה לקבוע כדאיות.

כחלופה או בנוסף לשיטות בשימוש נרחבת אלה, כאן אנו מספקים פרוטוקולים ורציונל לשימוש בצבעי ניאון שמצביעים על כדאיות בקטריאלי על מנת להעריך את ההישרדות של חיידקים מצורפים והפנימו על ידי תאי מארח. כדי לזהות חיידקים תאיים, תאים נגועים נחשפים ראשון למגיב ניאון, כגון קטינים או נוגדני חיידק ספציפי. לאחר מכן התאים הנגועים permeabilized ונחשפו לצבעי DNA ספציפי שהם באופן דיפרנציאלי נגישים לחיידקים עם שלם לעומת ממברנות מושפלים, כתחליף ליכולת קיום חיידקים. בעמ 'הראשונהrotocol, SYTO9 הצבע החדיר הקרום מזהה את אוכלוסיית חיידקים בסך הכל, בעוד יודיד propidium נגיש רק לאלה חיידקים שהתפשרו ממברנות ולכן הן נחשבות nonviable. Propidium יודיד וSYTO9 כבר משמשים להערכת כדאיות חיידקים בbiofilms, להפלות פתוגניים מחיידקי nonpathogenic, ולמנות את החיידקים שמקורן במי קיימא 9-12. בפרוטוקול השני, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מזהה חיידקי סך הכל, בעוד Sytox הירוק הוא נגיש רק לאוכלוסיית nonviable. ניתן לשלב זוגות צבע כדאיות אלה עם immunofluorescence כדי לקבוע את המיקום של כל חיידק ביחס לחלבון של עניין, למשל להגדרת לוקליזציה subcellular חיידקים. השימוש במבחנים אלה מספק תובנה מפתח לתוך האינטראקציות שתגרומנה להרג או להישרדות חיידקים במהלך ההדבקה של תאי מארח. הפרוטוקולים שתוארו במאמר זה שימשו להערכת הכדאיות שלנ gonorrhoeae המחובר ולבתוך נויטרופילים אנושיים ראשוניים, ובכלל זה באוכלוסיות שונות של phagosomes נויטרופילים 5,13,14. עם זאת, יכולים להיות מיושמים על פרוטוקולים אלה כדי להעריך את הכדאיות של חיידקי גרם חיוביים וגרמו שליליים בphagocytes המקצועי, phagocytes הלא מקצועי, ופרוטוזואה 15-24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הערכת הכדאיות בקטריאלי עם יודיד Propidium וSYTO9

  1. להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ"מ ב24 גם צלחות עם חיידקים של עניין. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים.
  2. יש לשטוף את תאי פעם אחת בעדינות ב0.1 M 3 - (N-morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים), pH 7.2, המכילה 1 מ"מ MgCl 2 (מגבים / MgCl 2).
  3. דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך בטמפרטורת חדר עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים.

הערה: ניהול שולט עם חיידקי חיים ומתים, בהיעדרם של תאי מארח, כדי להראות כי לקטינים או נוגדנים של עניין מחייבים את כל החיידקים ללא קשר לכדאיות (איור 1).

  1. יש לשטוף את תאים פעמיים עם מגבים / MgCl 2.
  2. לשאוב מ 'עדיה מהתאים ולהוסיף 0.5 מיליליטר בשידור חי / המלח מכתים פתרון. בשידור חי / המלח מכתים פתרון הוא 5 SYTO9 מיקרומטר, 30 מיקרומטר יודיד propidium, וsaponin 0.1% (ריכוזים סופיים) במגבים / MgCl 2.
  3. דגירה תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  4. יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2.
  5. coverslips מרחב זה עם הפנים כלפי מטה על גבי שקופיות זכוכית ולאטום עם לק השקוף. אל תשתמשו בחומרי הרכבה.
  6. לרכוש תמונות בתוך 30 דקות, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מערכות סינון בקנה אחד עם רכישת תמונה ירוקה, אדום, ומרחיק אדומה.

הערה: שני מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי וכן במיקרוסקופ לייזר confocal הסריקה ניתן להשתמש. לאחר 30 דקות צבעי הניאון מתחילים לדלוף מהחיידקים ואת הנתונים שנרכשו כבר לא מדויקים. תמונות מוצגות במאמר זה נרכשו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזקוף Nikon Eclipse E800 עם מצלמה דיגיטלית האמאמטסו אורקה-ER באמצעות תוכנת OpenLab. הקרינה של אלקסה פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שווא בצבע כחול. הקרינה מן יודיד propidium זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 540-580 ננומטר ומסנן פליטה של ​​600-660 ננומטר. הקרינה מן SYTO9 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר.

  1. פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים כחולים + אדומים, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים אדום בלבד, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים כחולים + ירוקים, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים ירוקים בלבד. לספור לפי העין את המספרים של חיידקים, כי הם nonviable nonviable קיימא חיצוני, פנימי, חיצוני ובת קיימא, ופנימי.
  2. לחשב אחוזים מחיידקי קיימא החיצוניים על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא חיצוניים על ידי המספר הכולל של חיידקים חיצוניים (קיימא תוספת nonviמסוגל). לחשב אחוזים מחיידקי קיימא הפנימיים על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא פנימיים במספר הכולל של חיידקים פנימיים (קיימא תוספת nonviable) (איור 4).
  3. ישנם שני פקדים חיוניים לבצע עם פרוטוקול זה. ראשית, לאמת שכל חיידקי nonviable הם יודיד חיובי propidium וכל החיידקים חיים הם SYTO9 חיוביים. תרבות אמצע לוגריתמים של חיידקים (בהעדר כל תאי מארח) צריכה להיות> SYTO9 חיובי 95%. שמוצגת באיור 2 היא תרבות אמצע לוגריתמים של נ ' gonorrhoeae (ב10 8 מושבה להרכיב יחידות למ"ל) הודגרו עם בשידור חי / המלח מכתים פתרון. שנית, לאמת כי שני יודיד propidium וSYTO9 יכולים להיכנס permeabilized תאי מארח נגועים,.
    1. כדי ליצור אוכלוסייה של חיידקים מתים, לאסוף 2 x 10 8 מושבה חיידקים ויוצרת יחידות בצינור microfuge 1.5 מיליליטר, להוסיף isopropanol 70% ולשבת ל10 דקות. גלולה החיידקים בmicrofugend לשטוף את החיידקים פעמים PBS להסיר isopropanol שיורית. לאחר מכן בצע פרוטוקול צעדים 1.5-1.7. הוסף 5 μl של השעיה חיידקים לשקופית זכוכית וכיסוי עם coverslip. דגימות תמונה כמו בשלב פרוטוקול 1.9. בתנאים אלה, של האוכלוסייה 100% צריכים להיות יודיד החיובי propidium (איור 2). בחלק ממיני חיידקים, יודיד propidium לא יכול להכניע לחלוטין מכתים SYTO9, וחיידקים nonviable עשויים להופיע צהובים או כתום.
    2. לתאי phagocytic כמו נויטרופילים, לחשוף את תאי חיידקים נהרג isopropanol ולהבטיח כי של החיידקים תאיים 100% יודיד החיובי propidium (איור 3). לתאים nonphagocytic שלא יכול להפנים חיידקים מתים, זה עשוי להיות מספיק כדי לטפל בתאים נגועים עם אזיד הנתרן או סוכני תא permeant אחרים מיקרוביאלית לפני הוספה בשידור חי / המלח מכתים פתרון.

2. קטריאלי הכדאיות הערכה עם Sytox Green וDAPI

  1. חיידקי תווית של עניין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בינונית מוגדר של מורס 25 ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  2. להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ"מ ב24 גם צלחות עם חיידקים שכותרתו DAPI. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים.
  3. יש לשטוף את תאי פעם עם מגבים / MgCl 2.
  4. דגירה תאים עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. ראה הערה בשלב פרוטוקול 1.3 עבור פקדים שהציע.
  5. תקשורת לשאוב מהתאים ולהוסיף 0.5 מיליליטר 0.4 מיקרומטר Sytox ירוק במגבים / MgCl 2.
  6. דגירה תאים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  7. יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2.
  8. שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות.

הערה: הקרינה מAlexa פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שגוי בצבע אדום. הקרינה מן Sytox הירוק זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. הקרינה מן DAPI זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 355-375 ננומטר ומסנן מחסום 400 ננומטר.

  1. פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים יופיעו אדום + ירוק, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים ירוקים + כחולים, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים אדום + כחול, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד (איור 4). לכמת אחוז מחיידקים החיצוניים ופנימיים כמתואר בפרוטוקול STEp 1.11.
  2. הבקרות מתוארות בשלב פרוטוקול 1.12 צריכה להתבצע עם שילוב הצבע DAPI / Sytox הירוק (איורים 2 ו -3).

3. הערכה בקטריאלי ליכולת הקיום לצד לוקליזציה subcellular

  1. חיידקי תווית של עניין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בינונית מוגדר של המורס ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  2. להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ"מ ב24 גם צלחות עם חיידקים שכותרתו DAPI. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים.
  3. יש לשטוף את תאי פעם עם מגבים / MgCl 2.
  4. דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. ראה הערה בשלב פרוטוקול 1.3 עבור פקדים שהציע.
  5. תקשורת לשאוב מהתאים ולשטוף תאים שני times במגבים / MgCl 2.
  6. דגירה תאים עם נוגדנים נגד סמן subcellular של ריבית ל20 דקות 555 יחד-Alexa פלואוריד, במגבים / MgCl 2 המכיל saponin 0.2%.
  7. יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2.
  8. שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות.
  9. תקשורת לשאוב מהתאים ולהוסיף 0.4 מיקרומטר Sytox ירוק במגבים / MgCl 2.
  10. דגירה תאים 5 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  11. יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2.
  12. שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות.
  13. לרכוש תמונות של שקופיות בתוך 30 דקות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה שלב פרוטוקול 1.9 לתיאור של מיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, ורכישת תוכנה.

הערה: הקרינה מAlexa פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שווא בצבע סגול. ו הקרינהrom אלקסה פלואוריד 555 זוהה באמצעות מסנן עם גל עירור של 540-580 ננומטר ומסנן פליטה של ​​600-660 ננומטר. הקרינה מן Sytox הירוק זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. הקרינה מן DAPI זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 355-375 ננומטר ומסנן מחסום 400 ננומטר.

  1. פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים סגולים + ירוקים, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים ירוקים + כחולים, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים סגולים + כחולים, חיידקי קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד, וחלבון subcellular מופיע אדום (איור 4). לכמת את perecent של חיידקי קיימא חיצוניים ופנימיים כמתואר בפרוטוקול הצעדים 1.11.
  2. הבקרות מתוארות בשלב פרוטוקול 1.12 צריכה להתבצע עם שילוב הצבע DAPI / Sytox הירוק (איורים 2 ו -3).
  3. בתוךבנוסף לספירת חיידקי קיימא וnonviable, לסווג כל חיידקים כחיוביים או שלילי לcolocalization עם סמן subcellular של עניין.
  4. לחשב אחוזים מחיידקי קיימא colocalized עם סמן subcellular על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא colocalized במספר הכולל של חיידקים ובת קיימא. לחשב אחוזים מחיידקי nonviable colocalized עם סמן subcellular על ידי חלוקת מספר חיידקי colocalized nonviable במספר הכולל של חיידקי nonviable.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקולים שתוארו שימשו כדי לבחון קיומה של נ ' gonorrhoeae לאחר חשיפה לאדם עיקרי נויטרופילים 5,26. הנויטרופילים היו נגועים בנ gonorrhoeae ומעובד עם פרוטוקול 1, באמצעות SYTO9 צבע כדאיות ירוקת הניאון ויודיד אדום ניאון propidium (איור 4 א). הצבעים נוספו בנוכחות saponin, אשר מפרידה כולסטרול לpermeabilize מעדיף קרום פלזמה תא מארח, ולא נ קרומי gonorrhoeae. דטרגנטים אחרים ייתכן שיצטרכו להיבדק אם ממברנות של החיידק של עניין מכילות כמויות גבוהות של כולסטרול. כל נ כתם gonorrhoeae עם SYTO9, אבל חיידקים רק עם ממברנות התפשרו להכתים עם יודיד propidium. יודיד propidium מתגבר על הקרינה SYTO9, כך חיידקים חיים מופיעים חיידקים ירוקים ומתים להיראות אדומים 27. בחלק ממיני חיידקים, יודיד propidium לא יכול להתגבר על stainin SYTO9 לחלוטיןגרם, וכתוצאה מכך חיידקים מתים מופיע צהוב או כתום. היחס של יודיד propidium ל9 SYTO ייתכן שיצטרך להיות מותאם למיני חיידקים שונים. לפני permeabilizing התאים והוספת SYTO9 ויודיד propidium, קטיני סויה 647 יחד-Alexa פלואוריד התווסף לתאים הנגועים כדי לזהות נ תאי gonorrhoeae, ואות הקרינה מרחיקות האדומה היה כוזבים בצבע כחול. כך, בפרוטוקול זה חיידקי קיימא חיצוניים יופיעו בצבע טורקיז (כחול + ירוק) וnonviable החיצוני מופיע מגנטה (כחול + אדום). חיידקי קיימא פנימיים מופיעים ירוק בלבד (חץ), וחיידקים nonviable פנימיים מופיעים אדום בלבד (ראש חץ). חשוב לציין כי בתאים נגועים, גרעין תא אוקריוטים יהיה מוכתם על ידי SYTO9 ויודיד propidium ("N", איור 4 א). החיידקים החיצוניים קיימא, חיצוניים nonviable, פנימיים ובת קיימא, והפנימיים nonviable היו לכמת מתמונות הקרינה להניב אחוזים מחיידקים הפנימוnd חיידקי קיימא אחוזים בתוך ומחוץ לתאי מארח.

איור 4 היא תמונה מייצגת של נ ' gonorrhoeae נגוע נויטרופילים מעובדים עם פרוטוקול 2, תוך שימוש בצבעי הכדאיות Sytox הירוק וDAPI. פרוטוקול זה ימנע את השימוש ביודיד propidium, שמאיר בשני הערוצים אדומים וסגולים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל נ כתם gonorrhoeae עם DAPI (כחול), אך חיידקים רק עם ממברנות התפשרו להכתים עם Sytox ירוק. כפי שתואר לעיל, לפני permeabilizing התאים, לקטינים סויה 647 יחד-Alexa פלואוריד התווסף לתאים הנגועים כדי לזהות נ תאי gonorrhoeae, הקרינה שבמקרה זה הוא כוזב בצבע אדום. לכן, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים מגנטה (אדום כחול +) וחיידקים nonviable חיצוניים מופיעים צהוב (אדום + ירוקים / כחולים). חיידקי קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד (חיצים), והחיידקים nonviable פנימיים מופיעים ירוק / כחול (ראשי חץ). דהתלוי ועומד על העצמה היחסית של DAPI לעומת הקרינה Sytox הירוקה, חיידקי nonviable עשויים להופיע בצבע טורקיז. בדומה לתאי מעובד עם יודיד propidium וSYTO9, גרעין נויטרופילים מוכתם על ידי Sytox ירוק וDAPI באיור 4 ב (מסומן על ידי "N"). חשיפה של תאים נגועים לSytox הירוק וDAPI חושפת את הפנמת אחוזים ויכולת הקיום של חיידקים בתאי מארח, לכמת כפי שתואר לעיל ליודיד propidium וSYTO9. תוצאות מנ נויטרופילים נגועים gonorrhoeae מעובד באמצעות Sytox הירוק וDAPI הם דומים לאלה שהושגו עם יודיד propidium וSYTO9 26.

כמתואר באיור 4C, פרוטוקול 3 הוא עיבוד של פרוטוקול 2, שבו צבעי כדאיות חיידקים היו בשילוב עם immunofluorescence לחלבון גרגר נויטרופילים הראשוני או azurophilic CD63. ניסוי זה נערך על מנת להגדיר את ההרכב של תאי phagosome iנויטרופילים nside המכילים נ קיימא או nonviable gonorrhoeae 26. פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ ליכולת הקרינה בארבעת צבעים כדי לזהות חיידקי קיימא, חיידקי nonviable, חיידקים תאיים, וסמן subcellular. מאז צבעי הכדאיות אינם תואמים לקיבוע אלדהיד (התצפיות שלא פורסמו שלנו), ביצענו immunofluorescence ללא קיבעון, באמצעות נוגדן מצמידים ישירות לfluorophore כדי לצמצם את הזמן הדרוש כדי לזהות את האנטיגן בתוך תאים. נוגדן זה בשילוב לfluorophore האדום אלקסה פלואוריד 555. כמו בפרוטוקול 2, חיידקי קיימא וnonviable נבדלו באמצעות DAPI וSytox ירוק, בהתאמה, וחיידקים חיצוניים הוכתמו באמצעות קטיני סויה Alexa 647 בשילוב. חיידקים חיצוניים לזרוח מרחיק אדומים והם שקריים בצבע סגול. חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים חיידקי nonviable סגולים + כחולים וחיצוניים מופיעים סגולים + ירוקים / כחולים. חיידקי קיימא פנימיים מופיעים כחולים (חץ) ושארחיידקי nonviable nal מופיעים ירוק (ראש חץ). גרגרי CD63 החיובי וphagosomes מופיעים אדומים. גרעין נויטרופילים מוכתם בצבעי DNA הספציפיים ("N"). כאשר מנתח את התמונות האלה, כל חיידק בודד סווג כחיצוני לעומת פנימי, בת קיימא לעומת nonviable, וחיובי או שלילי לטבעת של מכתים CD63. נ gonorrhoeae נחשב להתגורר בphagosome CD63 החיובי נויטרופילים אם יש ≥ 50% מטבעת של הקרינה CD63 המקיפה את החיידקים, ובphagosome CD63 שלילי אם יש <50% מטבעת של הקרינה CD63 המקיפה את החיידקים . יש החיידק תאיים nonviable שצוין על ידי ראש החץ באיור 4C טבעת של מכתים את CD63 המקיף את החיידקים. טבעת זו מעידה גרגרים עיקריים מועשרים בphagosome זה. חיידק קיימא תאיים, מצויינים על ידי החץ, חסר מכתים עבור CD63, המצביע על גרגרים עיקריים אינם מועשרים בphagosome. אנחנוהשתמש בטכניקה זו כדי להראות מתאם בין הכדאיות של נ ' gonorrhoeae ומגורים בphagosome גרגיר שלילי עיקרי 26. בגלל assay זה עוקב אחר שני כדאיות ולוקליזציה חיידקים באמצעות חלבון של עניין, ניתן לקבוע אם חיידקי nonviable ובת קיימא מתגוררים באותו או מיקומים שונים. מידע זה מספק תובנה ראשונית חשובה למנגנונים שתורמים להישרדות חיידקים בתאי מארח.

איור 1
איור 1. שילוב של נ 'בת קיימא וnonviable gonorrhoeae נחשף לקטיני אלקסה פלואוריד סויה 647 מצמידה, יודיד propidium, וSYTO9 על פי פרוטוקול 1, בהעדר תאי מארח. כל החיידקים נגישים לקטינים ולזרוח כחול. חיידקי nonviable מופיעים חיידקים כחולים + אדומים וnonviable מופיעים כחולים+ ירוק.

איור 2
איור 2. נ 'שלב אמצע לוגריתמים (AB) gonorrhoeae נחשף ליודיד propidium וSYTO9 כמו בפרוטוקול 1, עם () או ללא טיפול isopropanol (ב ') כדי להרוג את החיידקים. חיידקי nonviable נגישים ליודיד propidium ולהיראות אדום. חיידקי קיימא מגואלות SYTO9 ומופיעים ירוק. נ 'שלב אמצע לוגריתמים (CD) gonorrhoeae נחשף לDAPI וSytox הירוק כמו בפרוטוקול 2, עם (C) או ללא טיפול isopropanol (ד ') כדי להרוג את החיידקים. חיידקי nonviable נגישים לDAPI וSytox הירוק ומופיעים כחול + ירוק. חיידקי קיימא מגואלות DAPI בלבד ומופיעים כחול בלבד.

alt = "איור 3" עבור: תוכן ברוחב = src "6in" = "/ files/ftp_upload/50729/50729fig3.jpg" />
איור 3. נויטרופילים () הותר לאגד ולהפנים נ-נהרג isopropanol gonorrhoeae, ולאחר מכן נחשף ליודיד propidium וSYTO9 על פי פרוטוקול 1. חיידקי nonviable מגואלות יודיד propidium ולהיראות אדום. כפי שכל החיידקים הם nonviable, לא SYTO9 חיובי, חיידקים ירוקים מזוהים. נויטרופילים (ב ') הותר לאגד ולהפנים נ-נהרג isopropanol gonorrhoeae, ולאחר מכן נחשף לDAPI וSytox גרין פי פרוטוקול 2. חיידקי nonviable מגואלות DAPI וSytox ירוקים ומופיעים ירוק + כחול. כפי שכל החיידקים הם nonviable, לא DAPI בלבד, חיידקים רק כחולים מזוהים. N תוויות גרעין נויטרופילים. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. ראשי החץ מצביעים על חלק מחיידקי nonviable.

ב" src = "/ files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg" />
איור 4. נ '() נויטרופילים אנושיים נגועים ב-gonorrhoeae נחשפו לAlexa פלואוריד 647 מצמידים לקטינים סויה (שווא בצבע כחול), ואז permeabilized עם saponin בנוכחות הכדאיות צובעת יודיד propidium (אדום), לתייג את החיידקים מתים, וSYTO9 (ירוק), לcounterstain חיידקים חיים. חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים כחול + אדום, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים אדומים בלבד, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים כחולים + ירוקים, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים ירוקים בלבד. נ (ב) gonorrhoeae תויג עם DAPI (כחול), ולאחר מכן הוצג לנויטרופילים. תאים נגועים ולאחר מכן נחשפו לAlexa פלואוריד לקטינים 647 מצמידים סויה (אדום שווא בצבע), ואז permeabilized עם saponin בנוכחות Sytox גרין (ירוק) כדי לתייג את החיידקים מתים. חיידקי nonviable חיצוניים יופיעו אדום + ירוק, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים + bac הירוק הכחול, חיצוני קיימאteria מופיע אדום + כחול, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד. נ (C) נויטרופילים נגועים gonorrhoeae עובדו כמו בB, למעט נוגדני 555 יחד-Alexa פלואוריד נגד חלבון הגרגר העיקרי נויטרופילים CD63 (אדום) נוספו בעת permeabilization. הצביעה לקטינים 647-סויה אלקסה פלואוריד הייתה כוזבת בצבע סגול. חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים חיידקים סגולים + ירוקים, פנימיים nonviable מופיעים ירוקים בלבד, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים סגולים + כחולים, חיידקי קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד, ומכתימים CD63 מופיע אדום. הבלעה מראה את הקרינה CD63 של האזור בתמונה מסומנת בריבוע הלבן. בAC, N תוויות גרעין נויטרופילים. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. ראשי החץ מצביעים על חיידקים וחצים nonviable מצביעים על חיידקים ובת קיימא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מוצגים כאן הם שני פרוטוקולים המשתמשים DNA מחייב וצבעי כדאיות בשיתוף עם קטיני ניאון כדי לזהות חיידקים חיים ומתים מצורפים ובתוך תאים אנושיים. מכיוון ששני הפרוטוקולים ביעילות להפלות חיים מחיידקים מתים, הבחירה באיזה פרוטוקול של להשתמש תלויה במטרה הניסוי. הפרוטוקול הראשון משתמש יודיד propidium כדי לזהות חיידקים וSYTO9 כדי לזהות חיידקים בשלמות nonviable. שמוצג באיור 4 א היא תמונה מייצגת של פרוטוקול 1 תחול על נויטרופילים אנושיים נגועים בנ gonorrhoeae. צבעים אלה בשילוב עם agglutinin לקטינים, סויה, להכיר נ תאי gonorrhoeae, אבל נוגדני חיידקים ספציפיים בשילוב fluorescently יכול לשמש כחלופה. פרוטוקול 1 בקלות מגלה את הכדאיות של חיידקים בודדים, שכן הרחקה של SYTO9 ידי יודיד propidium עושה חיידקי nonviable לזרוח חיידקים אדומים וקיימא לזרוח ירוקים. However, פרוטוקול זה לא יכול להיות משולב עם immunofluorescence לחלבוני מארח, בשל הקרינה של יודיד propidium בשתיים מארבעת הערוצים הזמינים למיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי. לכן, פרוטוקול 2 פותח, אשר משתמש Sytox ירוק כדי לזהות חיידקי nonviable וDAPI לזהות את אוכלוסיית חיידקים בסך הכל. דוגמא לנ gonorrhoeae קשור ובתוך נויטרופילים אנושיים ומעובד באמצעות Sytox ירוק וDAPI מוצג באיור 4 ב 'ודוגמא בשילוב עם immunofluorescence מוצגת באיור 4C. חוץ מהזמינות של שני ערוצי הקרינה נוספים, פרוטוקול זה הוא יתרון לשימוש על ידי אנשים עם עיוורון צבעים אדומים וירוק. עם זאת, חיידקי nonviable יכולים לזרוח ירוקים או כחולים, ירוקים, תלוי בעוצמתו היחסית של מכתים DAPI וSytox הירוק ועל הפרמטרים רכישת תמונה. חסרון אחד לשימוש בDAPI הוא שזה יכול לדלוף מנ gonorrhoeaeבמהלך הזיהום, אם כי זה לא יכול להיות נושא לחיידקים אחרים כגון Staphylococcus aureus (התצפיות שלא פורסמו שלנו). כדי לנטרל את הבעיה זו, תאים נגועים תויגו עם DAPI יחד עם Sytox הירוק לאחר הדבקה, אבל עוצמת מכתים DAPI הגרעיני השתלטה על הקרינה של נ ' gonorrhoeae (התצפיות שלא פורסמו שלנו). בנוסף לשני פרוטוקולים אלה, יכולים לשמש צבעים זמינים מסחרי אחרים כדי לחשוף את הכדאיות בקטריאלי. לדוגמא, אסתר carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) יכולה לתייג את אוכלוסיית חיידקים בסך הכל, וSytox כתום או כחול יכול לזהות חיידקי nonviable. מאז את היעילות היחסית של נהלים אלה עשויות להשתנות עם החיידק וסוג תא נגוע, חשוב שחוקרים להשוות שילובי צבע כדאיות שונים במערכות הזיהום שלהם.

נכון לעכשיו, אנו בוחנים באופן ידני כל תמונה שהושגה עם פרוטוקולים אלה כדי לכמת כלהפנמת אחוזים, כדאיות אחוזים intracellularly וextracellularly, וcolocalization עם סמני subcellular. אמנם באופן תיאורטי ניתן להשתמש בשיטות מבוססות מחשב אוטומטי כדי לכמת את הפרמטרים הללו, הם עשויים להיות מסובכים ידי כל מכתים לא אחיד של החיידקים עם צבעי כדאיות ואת אות הקרינה החזקה של גרעין התא. כמו כן, ההגדרה של colocalization חיידקים עם סמן subcellular ייתכן שתצטרך להיות מותאמת לחיידקים, סוג התא, וסמן של עניין.

מגבלה אחת של פרוטוקולים אלה היא ההנחה כי חדירות ליודיד propidium או Sytox הירוק היא מדד אמיתי של מוות בקטריאלי. המשקל המולקולרי של יודיד propidium וSytox הירוק הוא 668.4 דה ו600 דא, בהתאמה. צבעים אלה נחשבים קרום impermeant ולא צריך לגשת לציטופלסמה החיידקים, אלא אם כן יש להם את החיידקים נזק קרום שלא תוקן. עם זאת, יש הסבירות הגבוהה שהחיידקים להיכנס למצב של קיפאוןאו אפילו לתקן את נזק הממברנה שלהם ולהמשיך לגדול בתקופות מאוחרות יותר. מגבלה שנייה היא שהפרוטוקולים אינם מאפשרים את הכדאיות של חיידקים בודדים כדי להיות במעקב לאורך זמן. חיים טכנולוגיות ממליצה כי הערכות של כדאיות חיידקים עם יודיד propidium וSYTO9 להתבצע בתוך 30 דקות לאחר חשיפה לצבעים, שכן החיידקים יאבדו את יכולת הקיום ארוך יותר הם רכובים וצלמו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים נגועים שכותרתו עם שילוב הצבע הירוק DAPI / Sytox גם חייבים להיות צילמו במהירות לאחר ההרכבה (התצפיות שלא פורסמו שלנו). שלישית, הפרוטוקולים אינם תואמים עם טכניקות קיבוע נפוצות. קיבעון מתנול או אצטון יהיה permeabilize ולהרוג את החיידקים הקשורים לתאי מארח, וfixatives מבוסס אלדהיד permeabilize נ gonorrhoeae בתוך נויטרופילים אנושיים ליודיד propidium וSytox הירוק (תצפיות לא פורסמו). וכך תוך שימוש בפרוטוקולים אלה דורש גישה מיידית לMICR הקרינהoscope והיכולת להשלים את הפרוטוקולים ביום אחד. לבסוף, כל אחד מהצבעים בשימוש בפרוטוקולים אלה להיקשר גדילים כפולים חומצות גרעין וה-DNA המארח לאגד גרעיני, כמו גם את ה-DNA החיידקים (איור 1). בגלל הקרינה של ה-DNA הגרעיני היא בהירה יותר באופן משמעותי מקרינה של ה-DNA בקטריאלי, את הכדאיות של חיידקים הנמצאים בסמיכות לגרעין אוקריוטים לא ניתן להעריך. מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר והחיידקים prelabeling בעזרת DAPI להפחית את אות הקרינה הגרעינית. הקרינה של ה-DNA הגרעיני תישאר סיבוך של פרוטוקולים אלה עד צבעי כדאיות חיידקים שאינם מחייב DNA מפותחים.

למרות מגבלות אלה, הפרוטוקולים במאמר זה מספקים דרך רגישה כדי להעריך את הכדאיות של חיידקים בודדים מצורפים ובתוך תאי אוקריוטים. מבחני ספירת מושבה או גנטמיצין הגנה היו עמוד השדרה של מחקר פתוגנזה של חיידקים. עם זאת, הם provIDE הערכה של הישרדות חיידקים על פני אוכלוסייה שעלול להיות הטרוגנית. לעומת זאת, פרוטוקולי צבע כדאיות המתוארים כאן מאפשרים את השלמות של חיידקים בודדים כדי להיבחן. לכן, חוקרים יכולים לאסוף נתונים לגבי גורלם של תאיים לעומת חיידקים, חיידקים תאיים בסוגים שונים phagosomal, או חיידקים בphagosome לעומת ציטופלסמה. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים סעיף דק יש לעתים קרובות נעשה שימוש כדי לבחון את הכדאיות של חיידקים בודדים. בעוד חיידקים המופיעים אלקטרונים לוסנט או כבר לא בשלמותה על ידי TEM בבירור nonviable, קשה יותר להעריך אם חיידקים ששומרים על כמה צפיפות אלקטרונים בציטופלסמה שלהם הם למעשה ללא שינוי. בנוסף, זה יכול לקחת שעות רבות מהזמן מיקרוסקופ אלקטרונים לרכוש מספיק micrographs לנתח, בעוד שניתן לרכוש בתחומים רבים בעצמה נמוכה מהתאים שנחשפו לצבעי כדאיות הקרינה מבוססת, אפילו בזמן הקצר שהעניק לרכישת תמונה. בעוד proviפרוטוקולי ded היו מותאמים עם נ ' gonorrhoeae ונויטרופילים אנושיים ראשוניים, הם יכולים להיות מותאמים כדי להעריך את הכדאיות של מינים רבים של חיידקי גרם שליליים וגרמו חיוביים במגוון רחב של סוגי תאים, כולל כל phagocytic ותאי אוקריוטים nonphagocytic 5,15-24,26. צבעי כדאיות חיידקים לספק כלי ניסיוני רב עוצמה לבחינת מנגנוני פתוגנזה של חיידקים בתאי אוקריוטים ואת היכולת של תאי אוקריוטים לשלוט זיהום חיידקים. בעתיד, פרוטוקולים אלה עשויים להיות אפילו יותר שימושיים עם כלים טובים יותר לרכישה אוטומטית תמונה ועיבוד, יחד עם הפיתוח של צבעי כדאיות חיידקים התואמים את קיבעון אלדהיד וספציפיים לפרוקריוטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לאסיה סמירנוב ולורה Gonyar לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH r00 TW008042 וR01 AI097312 לAKCMBJ נתמכים בחלקו על ידי NIH T32 AI007046.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection Becton Dickinson 367251  
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml Becton Dickinson 366480  
Sterile water for irrigation Baxter 07-09-64-070  
Dextran 500 Sigma 31392  
Sodium Chloride Fisher Scientific S641  
Dextrose Ricca Chemical Company RDCD0200  
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ Thermo Scientific SH3002802  
Ficoll solution GE Healthcare 17-1440-03  
Acetic Acid Fisher Scientific BP2401  
12 mm circular glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
24-well plates Corning Incorporated 3524  
Pooled Human Serum Sigma S7023  
RPMI Mediatech 15-040-CV  
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007103  
Human interleukin-8 R&D Systems 208-IL/CF  
MOPS Sigma M3183  
MgCl2 Fisher Scientific BP214  
Propidium Iodide Life Technologies L7007 or L7012  
SYTO9 Life Technologies L7007 or L7012  
Saponin Fluka Analytical 47036  
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin Life Technologies L-32463  
DAPI Sigma D8417  
SYTOX Green Life Technologies S7020  
Mouse anti-CD63 Developmental Studies Hybridoma Bank H5C6  
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit Life Technologies A20187  
Hemacytometer Bright Line Hausser Scientific 1492  
Forceps EMS 78320  
Sorvall Legend RT + Centrifuge Thermo Scientific 75004377  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Tags

מיקרוביולוגיה גיליון 79 אימונולוגיה זיהום סרטן ביולוגיה גנטיקה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית רפואה ההנדסה ביו רפואית מיקרוסקופית confocal מיקרוסקופית הקרינה חיידקים זיהומים חיידקיים וMycoses חיידקים זיהום כדאיות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא הדמיה
שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, M. B., Criss, A. K.… More

Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (79), e50729, doi:10.3791/50729 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter