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Immunology and Infection

स्तनधारी कोशिकाओं के सहयोग से बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का निर्धारण के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तरीके

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50729
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

Summary

बैक्टीरियल रोगजनन के क्षेत्र के लिए केन्द्रीय रोगाणुओं कोशिकाओं के लिए जोखिम के बाद जीवित कैसे यदि और परिभाषित करने की क्षमता है. इस लेख के अंदर और मेजबान कोशिकाओं के साथ जुड़े व्यक्ति बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का पता चलता है कि फ्लोरोसेंट रंगों के इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा.

Abstract

बैक्टीरियल रोगजनन के क्षेत्र के लिए केन्द्रीय रोगाणुओं कोशिकाओं के लिए जोखिम के बाद जीवित कैसे यदि और परिभाषित करने की क्षमता है. इन सवालों का पता करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल कॉलोनी गिनती assays, gentamicin संरक्षण assays, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल हैं. कालोनी की गिनती और gentamicin संरक्षण assays ही पूरे बैक्टीरियल आबादी की व्यवहार्यता का आकलन और व्यक्तिगत बैक्टीरियल व्यवहार्यता का निर्धारण करने में असमर्थ हैं. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी व्यक्तिगत बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का निर्धारण और मेजबान कोशिकाओं में उनके स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, बैक्टीरिया अक्सर व्यवहार्यता का आकलन मुश्किल बना इलेक्ट्रॉन घनत्व की एक श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं. इस लेख के अंदर और मेजबान कोशिकाओं के साथ जुड़े व्यक्ति बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का पता चलता है कि फ्लोरोसेंट रंगों के इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा. ये assays प्राथमिक मानव neutrophils में नेइसेरिया gonorrhoeae के अस्तित्व का आकलन करने के लिए मूल रूप से विकसित किए गए, लेकिन एक होना चाहिएकिसी भी जीवाणु मेजबान सेल बातचीत करने pplicable. इन प्रोटोकॉल झिल्ली पारगम्य फ्लोरोसेंट रंगों गठबंधन करने के लिए ही उपलब्ध हैं, जो झिल्ली अभेद्य फ्लोरोसेंट रंजक (propidium आयोडाइड और Sytox ग्रीन), के साथ, सभी बैक्टीरिया दाग जो (SYTO9 और 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), nonviable बैक्टीरिया. पिछले यूकेरियोटिक सेल permeabilization के लिए, एक एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट अभिकर्मक कोशिकी बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए जोड़ा गया है. इस प्रकार इन assays कोशिकाओं को और अंदर पक्षपाती बैक्टीरिया की व्यवहार्यता भेदभाव. एक प्रोटोकॉल भी व्यक्ति बैक्टीरिया के subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने के क्रम में, यूकेरियोटिक सेल मार्कर फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ संयोजन में व्यवहार्यता रंगों का उपयोग के लिए प्रदान की जाती है. इस लेख में चर्चा बैक्टीरियल व्यवहार्यता रंगों व्यक्तिगत बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का मूल्यांकन और बैक्टीरिया मेजबान सेल में जीवित जहां के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए पारंपरिक सूक्ष्म जीव विज्ञान तकनीक के लिए एक संवेदनशील पूरक और / या वैकल्पिक हैंएस.

Introduction

एक गतिशील बातचीत और जिसमें वे रहते बैक्टीरिया और मेजबान के बीच सह विकास है. जीवाणु पालन organelles, स्राव प्रणाली, और / या मेजबान phagocytic और गैर phagocytic कोशिकाओं की उनकी उत्पादक संक्रमण को सक्षम है कि विषाक्त पदार्थों का उत्पादन करने की क्षमता विकसित किया है. बैक्टीरिया भी मान्यता और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की रोगाणुरोधी गतिविधियों के साथ संघर्ष करना होगा. मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली भौतिक और रासायनिक बाधाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, पूरक प्रणाली, और humoral रोगक्षमता के अन्य घटकों सहित सहज और अनुकूली घटकों के शामिल है. कई बैक्टीरिया बहुस्तरीय मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया द्वारा हत्या और निकासी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, कुछ रोगजनक और अवसरवादी बैक्टीरिया मेजबान कोशिकाओं की एक किस्म को संक्रमित और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 से निकासी नाश के लिए तंत्र विकसित किया है. नेइसेरिया gonorrhoeae एक जीवाणु रोगज़नक़ का एक उदाहरण है कि अत्यधिक अपने मानव मेजबान. एन में जारी रहती है के लिए अनुकूल है. gonorrhoeae आसानी मूत्रजननांगी पथ, ग्रसनी, कंजाक्तिवा, और मलाशय के mucosal उपकला कोशिकाओं की luminal सतहों colonizes. औपनिवेशीकरण mucosal स्थलों पर neutrophils की प्रचुर मात्रा में भर्ती हो सके. न्यूट्रोफिल सूक्ष्मजीवों को मारने के लिए रोगाणुरोधी प्रक्रियाओं की एक किस्म के अधिकारी हैं कि पेशेवर फ़ैगोसाइट हैं, लेकिन, एन gonorrhoeae neutrophils 2-5 की उपस्थिति में जीवित करने में सक्षम है. ऐसी एन के रूप में कैसे बैक्टीरियल रोगज़नक़ों को समझना gonorrhoeae, नाश को दबाने, और अंत में सामान्य रूप से प्रतिकूल मेजबान वातावरण में जीवित रहने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अपहरण संक्रामक रोगों का मुकाबला करने के लिए नए उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है.

अक्सर मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया जीवित रहने की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल कॉलोनी गिनती assays, gentamicin संरक्षण assays, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल हैं. कॉलोनी की गिनती assays में संक्रमित कोशिकाओं की आबादी क एक साबुन के साथ, उदाहरण के लिए (lysed हैआईसीएच बैक्टीरिया बैक्टीरिया को आजाद कराने के लिए) प्रतिरोधी रहे हैं. lysates पतला और अगर आधारित मीडिया पर चढ़ाया, और lysates में कॉलोनी के गठन इकाइयों हर समय बिंदु और / या प्रयोगात्मक हालत के लिए enumerated हैं कर रहे हैं. यह दृष्टिकोण पूरी बैक्टीरियल आबादी की व्यवहार्यता रिपोर्ट लेकिन intracellular और बाह्य अस्तित्व के बीच फर्क करने में सक्षम नहीं है. कॉलोनी की गिनती परख, gentamicin संरक्षण परख, पर एक बदलाव विशेष रूप से यूकेरियोटिक प्लाज्मा झिल्ली 6 पार करने के लिए एंटीबायोटिक gentamicin की अक्षमता के आधार पर intracellular बैक्टीरियल अस्तित्व, के उपाय. हालांकि, इस परख gentamicin (या इसी यूकेरियोटिक झिल्ली impermeant है कि एक और एंटीबायोटिक) और आंतरिक बैक्टीरिया के लिए उपयोग करने के लिए एंटीबायोटिक की अक्षमता से हत्या करने के लिए अतिसंवेदनशील किया जा रहा है बैक्टीरिया पर निर्भर है. इसलिए, एक gentamicin संरक्षण परख सभी प्रजातियों के जीवाणु की परीक्षा के लिए प्रभावी हो सकता है या नहीं हो सकता है अत्यधिक में बैक्टीरिया जीवित रहने की जब जांचऐसे neutrophils के रूप pinocytic कोशिकाओं. (बैक्टीरिया समुच्चय या अलग ढंग से व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं से व्यवहार करते हैं कि microcolonies फार्म अगर उदाहरण के लिए) इन तरीकों से न तो subcellular स्थानीयकरण या व्यक्तिगत बैक्टीरिया के अन्य व्यवहार का पता चलता है. व्यक्तिगत बाह्य और आंतरिक बैक्टीरिया की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए एक और अक्सर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण पतली धारा ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) है. यह दृष्टिकोण यह आगे subcellular मार्कर के खिलाफ सोने युग्मित एंटीबॉडी के साथ immunoelectron माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जा सकती है, जो मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया के स्थान (जैसे फेगोसोम, कोशिका द्रव्य, autophagosome), के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं कि में फायदेमंद है. हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी बैक्टीरियल व्यवहार्यता का आकलन करने पर विशेष रूप से संवेदनशील नहीं है. एम्बेडेड वर्गों uranyl एसीटेट, नेतृत्व साइट्रेट, या अन्य इलेक्ट्रॉन घने अभिकर्मकों के साथ दाग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged रहे हैं, इलेक्ट्रॉन घने बैक्टीरिया व्यवहार्य और चुनाव में माना जाता हैTron-LUCENT nonviable 7,8. हालांकि, इस धारणा को गंभीर रूप से बाधित झिल्ली और कोशिका द्रव्य से रहित साथ ही उन मृत बैक्टीरिया के बाद से इलेक्ट्रॉन प्रकाशमान दिखाई देते हैं, बैक्टीरियल व्यवहार्यता overestimates. इसके अलावा, कुछ प्रजातियों के जीवाणु के लिए यह मुश्किल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए कर रही है, विकास के अपने स्तर पर निर्भर करता है इलेक्ट्रॉन घनत्व की एक श्रृंखला प्रदर्शित कर सकता है.

एक विकल्प या इन व्यापक रूप से इस्तेमाल के तरीकों के अलावा, यहाँ हम से जुड़ी है और मेजबान कोशिकाओं से भली भाँति बैक्टीरिया के अस्तित्व का आकलन करने के लिए जीवाणु व्यवहार्यता से संकेत मिलता है कि फ्लोरोसेंट रंगों के इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल और औचित्य प्रदान करते हैं. कोशिकी बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए, संक्रमित कोशिकाओं को पहले इस तरह के एक लेक्टिन या बैक्टीरिया विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक, के संपर्क में हैं. संक्रमित कोशिकाओं को फिर permeabilized और बैक्टीरियल व्यवहार्यता के लिए एक किराए के रूप में, अपमानित झिल्ली बनाम बरकरार के साथ बैक्टीरिया को विभिन्न प्रकार से सुलभ हैं कि डीएनए विशिष्ट रंगों के संपर्क में हैं. पहले पी मेंpropidium आयोडाइड झिल्ली से समझौता किया है और इस तरह nonviable माना जाता है कि उन बैक्टीरिया को ही सुलभ है, जबकि rotocol, झिल्ली पारगम्य डाई SYTO9, कुल बैक्टीरियल आबादी को पहचानती है. Propidium आयोडाइड और SYTO9, biofilms में बैक्टीरियल व्यवहार्यता का मूल्यांकन nonpathogenic बैक्टीरिया से रोगजनक भेदभाव, और व्यवहार्य जल जनित बैक्टीरिया 9-12 गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Sytox ग्रीन nonviable आबादी के लिए ही उपलब्ध है, जबकि दूसरा प्रोटोकॉल में, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI), कुल बैक्टीरिया की पहचान करता है. ये व्यवहार्यता डाई जोड़े बैक्टीरियल subcellular स्थानीयकरण परिभाषित करने के लिए उदाहरण के लिए, ब्याज की एक प्रोटीन के संबंध में प्रत्येक जीवाणु के स्थान को निर्धारित करने के लिए immunofluorescence के साथ जोड़ा जा सकता है. इन assays का उपयोग मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के दौरान बैक्टीरियल हत्या या अस्तित्व में होने वाली बातचीत में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है. इस अनुच्छेद में उल्लिखित प्रोटोकॉल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गयान्युट्रोफिल phagosomes 5,13,14 के विभिन्न आबादी में सहित प्राथमिक मानव neutrophils, करने के लिए और अंदर संलग्न है कि एन gonorrhoeae. हालांकि, इन प्रोटोकॉल पेशेवर फ़ैगोसाइट, गैर पेशेवर फ़ैगोसाइट, और प्रोटोजोआ 15-24 में ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

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Protocol

1. Propidium आयोडाइड और SYTO9 साथ बैक्टीरियल व्यवहार्यता का आकलन

  1. ब्याज की बैक्टीरिया से 24 अच्छी तरह प्लेटें में 12 मिमी व्यास परिपत्र कांच coverslips के अनुयायी हैं कि कोशिकाओं को संक्रमित. Aldehydes या कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ कोशिकाओं को ठीक नहीं है.
  2. एक बार धीरे में कोशिकाओं कुल्ला 0.1 एम 3 - (एन morpholino) 1 मिमी 2 MgCl (MOPS / 2 MgCl) युक्त propanesulfonic एसिड (MOPS), 7.2 पीएच,.
  3. बाहरी बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए, mops / 2 MgCl में, ब्याज की प्रजातियों के जीवाणु को बांधता है कि एलेक्सा Fluor 647 युग्मित एंटीबॉडी या लेक्टिन के साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.

नोट: आचार ब्याज की लेक्टिन या एंटीबॉडी (चित्रा 1) की परवाह किए बिना व्यवहार्यता के सभी बैक्टीरिया है कि बांध को दिखाने के लिए, मेजबान कोशिकाओं के अभाव में रहते हैं और मृत बैक्टीरिया से नियंत्रित करता है.

  1. MOPS / 2 MgCl के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला.
  2. महाप्राण एमकोशिकाओं से edia और 0.5 मिलीलीटर लाइव / मृत धुंधला समाधान जोड़ने. लाइव / मृत धुंधला समाधान MOPS / 2 MgCl में 5 माइक्रोन SYTO9, 30 माइक्रोन propidium आयोडाइड, और 0.1% सैपोनिन (अंतिम सांद्रता) है.
  3. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  4. MOPS / 2 MgCl में कोशिकाओं को दो बार कुल्ला.
  5. उलटा coverslips गिलास स्लाइड पर नीचे चेहरा और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील. बढ़ते मीडिया का उपयोग न करें.
  6. हरे, लाल, और दूर की लाल छवि अधिग्रहण के साथ संगत फिल्टर सेट के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग, 30 मिनट के भीतर छवियों मोल.

नोट: पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग इस्तेमाल किया जा सकता है, दोनों. 30 मिनट के बाद फ्लोरोसेंट रंगों बैक्टीरिया से रिसाव शुरू हो और प्राप्त डेटा नहीं रह गया है सही कर रहे हैं. इस लेख में दिखाया गया छवियाँ Openlab सॉफ्टवेयर का उपयोग कर हमामात्सू ORCA-ईआर डिजिटल कैमरा के साथ एक Nikon ग्रहण E800 ईमानदार प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर हासिल किया गया. 650 एनएम और 663 के एक उत्सर्जन फिल्टर - - एलेक्सा Fluor 647 प्रतिदीप्ति 590 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था 735 एनएम, और झूठी रंग नीला है. 580 एनएम और 600 के एक उत्सर्जन फिल्टर - - 660 एनएम propidium आयोडाइड से प्रतिदीप्ति 540 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था. 495 एनएम और 515 के एक उत्सर्जन फिल्टर - - 555 एनएम SYTO9 से प्रतिदीप्ति 465 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था.

  1. इस प्रोटोकॉल बाहरी nonviable बैक्टीरिया लाल + नीला दिखाई देते हैं, जहां छवियों में परिणाम होगा, आंतरिक nonviable बैक्टीरिया लाल ही दिखाई देते हैं, बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया ग्रीन + नीला दिखाई देते हैं, और आंतरिक रूप से व्यवहार्य बैक्टीरिया ही हरे रंग दिखाई देते हैं. आंखों से बाहरी nonviable, आंतरिक nonviable, बाहरी व्यवहार्य, और आंतरिक रूप से व्यवहार्य हैं कि बैक्टीरिया की संख्या गिनती.
  2. बाहरी जीवाणुओं की कुल संख्या (बाहरी व्यवहार्य जीवाणुओं की संख्या से विभाजित करके बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया के प्रतिशत की गणना व्यवहार्य प्लस nonviसक्षम). आंतरिक बैक्टीरिया की कुल संख्या (व्यवहार्य प्लस nonviable) (चित्रा 4) के द्वारा आंतरिक रूप से व्यवहार्य जीवाणुओं की संख्या से विभाजित करके आंतरिक व्यवहार्य बैक्टीरिया के प्रतिशत की गणना.
  3. इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदर्शन करने के लिए दो आवश्यक नियंत्रण कर रहे हैं. पहला, सभी nonviable बैक्टीरिया propidium आयोडाइड पॉजिटिव हैं और सभी जीवित बैक्टीरिया SYTO9 पॉजिटिव हैं कि मान्य. (किसी भी मेजबान कोशिकाओं के अभाव में) बैक्टीरिया की एक मध्य लघुगणक संस्कृति> 95% SYTO9 पॉजिटिव होना चाहिए. एन की एक मध्य लघुगणक संस्कृति चित्रा 2 में दिखाया गया है gonorrhoeae लाइव / मृत धुंधला समाधान के साथ incubated (10 पर 8 कॉलोनी मिलीलीटर प्रति इकाइयों के गठन). दूसरा, propidium आयोडाइड और SYTO9 दोनों permeabilized, संक्रमित मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं कि मान्य.
    1. मृत बैक्टीरिया की आबादी उत्पन्न करने के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में इकाइयों के गठन 2 एक्स 10 8 बैक्टीरियल कॉलोनी जमा है, 70% isopropanol जोड़ने के लिए और 10 मिनट के लिए बैठते हैं. एक microfuge एक में बैक्टीरिया गोलीएन डी अवशिष्ट isopropanol दूर करने के लिए पीबीएस में दो बार बैक्टीरिया धो लो. 1.7 - तो फिर पालन प्रोटोकॉल 1.5 दोहराएँ. एक गिलास स्लाइड के लिए जीवाणु निलंबन के 5 μl जोड़ें और एक coverslip साथ ओवरले. प्रोटोकॉल कदम 1.9 में के रूप में छवि नमूनों. इन शर्तों के तहत, आबादी की 100% propidium आयोडाइड पॉजिटिव (चित्रा 2) होना चाहिए. कुछ बैक्टीरियल प्रजातियों में, propidium आयोडाइड पूरी तरह से SYTO9 धुंधला डूब नहीं सकता, और nonviable बैक्टीरिया पीले या नारंगी प्रकट हो सकता है.
    2. Neutrophils तरह phagocytic कोशिकाओं के लिए, isopropanol मारे बैक्टीरिया को कोशिकाओं को बेनकाब और intracellular जीवाणुओं की 100% propidium आयोडाइड पॉजिटिव (चित्रा 3) यह सुनिश्चित करें कि. मृत बैक्टीरिया भली नहीं हो सकता है कि nonphagocytic कोशिकाओं के लिए, यह सोडियम azide या पूर्व लाइव / मृत धुंधला समाधान जोड़ने के लिए अन्य सेल permeant रोगाणुरोधी एजेंटों के साथ संक्रमित कोशिकाओं के इलाज के लिए पर्याप्त हो सकता है.

2. Sytox Gree के साथ आकलन बैक्टीरियल व्यवहार्यताn और DAPI

  1. लेबल अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मोर्स परिभाषित मध्यम 25 में से 10 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI के साथ ब्याज के बैक्टीरिया.
  2. DAPI लेबल बैक्टीरिया के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें में 12 मिमी व्यास परिपत्र कांच coverslips के अनुयायी हैं कि कोशिकाओं को संक्रमित. Aldehydes या कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ कोशिकाओं को ठीक नहीं है.
  3. MOPS / 2 MgCl साथ कोशिकाओं को एक बार कुल्ला.
  4. बाहरी बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए, mops / 2 MgCl में, ब्याज की प्रजातियों के जीवाणु को बांधता है कि एलेक्सा Fluor 647 युग्मित एंटीबॉडी या लेक्टिन के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. सुझाव नियंत्रण के लिए प्रोटोकॉल 1.3 चरण में नोट मिलते हैं.
  5. महाप्राण कोशिकाओं से मीडिया और mops / 2 MgCl में 0.5 मिलीलीटर 0.4 माइक्रोन Sytox ग्रीन जोड़ें.
  6. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  7. MOPS / 2 MgCl में कोशिकाओं को दो बार कुल्ला.
  8. 5 मिनट के लिए MOPS / 2 MgCl में कोशिकाओं एक बार धोएं.

नोट: एलेक्सा Fluor 647 से प्रतिदीप्ति 590 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था - 650 एनएम और 663 के एक उत्सर्जन फिल्टर - 735 एनएम, और झूठी रंग लाल है. 495 एनएम और 515 के एक उत्सर्जन फिल्टर - - 555 एनएम Sytox ग्रीन से प्रतिदीप्ति 465 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था. 375 एनएम और 400 एनएम का अवरोध फिल्टर - DAPI से प्रतिदीप्ति 355 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था.

  1. इस प्रोटोकॉल बाहरी nonviable बैक्टीरिया ग्रीन + लाल दिखाई देते हैं, जहां छवियों में परिणाम होगा, आंतरिक nonviable बैक्टीरिया नीले + ग्रीन दिखाई देते हैं, बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया नीले + लाल दिखाई देते हैं, और आंतरिक रूप से व्यवहार्य बैक्टीरिया केवल (चित्रा 4) नीला दिखाई देते हैं. प्रोटोकॉल काएं में वर्णित के रूप में बाहरी और आंतरिक बैक्टीरिया का प्रतिशत योंपी 1.11.
  2. प्रोटोकॉल कदम 1.12 में वर्णित नियंत्रण DAPI / Sytox ग्रीन डाई संयोजन (आंकड़े 2 और 3) के साथ किया जाना चाहिए.

3. Subcellular स्थानीयकरण के बगल बैक्टीरियल व्यवहार्यता का आकलन

  1. लेबल अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मोर्स परिभाषित मध्यम में 10 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI के साथ ब्याज के बैक्टीरिया.
  2. DAPI लेबल बैक्टीरिया के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें में 12 मिमी व्यास परिपत्र कांच coverslips के अनुयायी हैं कि कोशिकाओं को संक्रमित. Aldehydes या कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ कोशिकाओं को ठीक नहीं है.
  3. MOPS / 2 MgCl साथ कोशिकाओं को एक बार कुल्ला.
  4. बाहरी बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए, mops / 2 MgCl में, ब्याज की प्रजातियों के जीवाणु को बांधता है कि एलेक्सा Fluor 647 युग्मित एंटीबॉडी या लेक्टिन के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट सेते हैं. सुझाव नियंत्रण के लिए प्रोटोकॉल 1.3 चरण में नोट मिलते हैं.
  5. महाप्राण कोशिकाओं से मीडिया और कोशिकाओं दो ती कुल्लाMOPS / 2 MgCl में एमईएस.
  6. 0.2% सैपोनिन युक्त MOPS / 2 MgCl में, 20 मिनट के लिए ब्याज की subcellular मार्कर के खिलाफ एलेक्सा Fluor 555 युग्मित एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  7. MOPS / 2 MgCl में कोशिकाओं को दो बार कुल्ला.
  8. 5 मिनट के लिए MOPS / 2 MgCl में कोशिकाओं एक बार धोएं.
  9. महाप्राण कोशिकाओं से मीडिया और mops / 2 MgCl में 0.4 माइक्रोन Sytox ग्रीन जोड़ें.
  10. अंधेरे में कमरे के तापमान पर कोशिकाओं 5 मिनट सेते हैं.
  11. MOPS / 2 MgCl में कोशिकाओं को दो बार कुल्ला.
  12. 5 मिनट के लिए MOPS / 2 MgCl में कोशिकाओं एक बार धोएं.
  13. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर 30 मिनट के भीतर स्लाइड प्राप्त चित्रों. माइक्रोस्कोप, डिजिटल कैमरा, और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के विवरण के लिए प्रोटोकॉल कदम 1.9 देखें.

नोट: एलेक्सा Fluor 647 से प्रतिदीप्ति 590 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था - 650 एनएम और 663 के उत्सर्जन फिल्टर - 735 एनएम, और झूठी रंग बैंगनी है. प्रतिदीप्ति च580 एनएम और 600 के एक उत्सर्जन फिल्टर - - 660 एनएम ROM एलेक्सा Fluor 555 540 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था. 495 एनएम और 515 के एक उत्सर्जन फिल्टर - - 555 एनएम Sytox ग्रीन से प्रतिदीप्ति 465 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था. 375 एनएम और 400 एनएम का अवरोध फिल्टर - DAPI से प्रतिदीप्ति 355 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था.

  1. इस प्रोटोकॉल बाहरी nonviable बैक्टीरिया ग्रीन + बैंगनी दिखाई देते हैं, जहां छवियों में परिणाम होगा, आंतरिक nonviable बैक्टीरिया नीले + ग्रीन दिखाई देते हैं, बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया नीले + बैंगनी दिखाई देते हैं, आंतरिक व्यवहार्य बैक्टीरिया केवल नीला दिखाई देते हैं, और subcellular प्रोटीन (चित्रा 4) लाल दिखाई देता है. प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में बाहरी और आंतरिक रूप से व्यवहार्य बैक्टीरिया के perecent 1.11 कदमों यों.
  2. प्रोटोकॉल कदम 1.12 में वर्णित नियंत्रण DAPI / Sytox ग्रीन डाई संयोजन (आंकड़े 2 और 3) के साथ किया जाना चाहिए.
  3. मेंव्यवहार्य और nonviable बैक्टीरिया गिनती के अलावा, ब्याज की subcellular मार्कर के साथ colocalization के लिए सकारात्मक या नकारात्मक रूप में या तो प्रत्येक बैक्टीरिया को वर्गीकृत.
  4. व्यवहार्य बैक्टीरिया की कुल संख्या से colocalized व्यवहार्य जीवाणुओं की संख्या से विभाजित करके subcellular मार्कर के साथ colocalized व्यवहार्य बैक्टीरिया के प्रतिशत की गणना. Nonviable बैक्टीरिया की कुल संख्या से nonviable colocalized जीवाणुओं की संख्या से विभाजित करके subcellular मार्कर के साथ colocalized nonviable बैक्टीरिया के प्रतिशत की गणना.

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Representative Results

उल्लिखित प्रोटोकॉल एन के अस्तित्व की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया gonorrhoeae प्राथमिक मानव से संपर्क के बाद 5,26 neutrophils. न्यूट्रोफिल एन से संक्रमित थे gonorrhoeae और हरी फ्लोरोसेंट व्यवहार्यता डाई SYTO9 और लाल फ्लोरोसेंट propidium आयोडाइड (चित्रा -4 ए) का उपयोग कर, प्रोटोकॉल 1 के साथ कार्रवाई की. रंगों preferentially मेजबान सेल प्लाज्मा झिल्ली, नहीं एन permeabilize करने के लिए कोलेस्ट्रॉल sequesters जो सैपोनिन की उपस्थिति में जोड़ा गया gonorrhoeae झिल्ली. ब्याज की जीवाणुओं की झिल्ली कोलेस्ट्रॉल की उच्च मात्रा में होते हैं, तो अन्य डिटर्जेंट परीक्षण किया जाना पड़ सकता है. सभी एन SYTO9 साथ gonorrhoeae दाग, लेकिन साथ छेड़छाड़ की झिल्ली के साथ ही बैक्टीरिया propidium आयोडाइड के साथ दाग. propidium आयोडाइड SYTO9 प्रतिदीप्ति पर काबू, तो जीवित बैक्टीरिया हरे और मृत बैक्टीरिया 27 लाल दिखाई देते दिखाई देते हैं. कुछ बैक्टीरियल प्रजातियों में, propidium आयोडाइड पूरी तरह से SYTO9 stainin को दूर नहीं कर सकते हैंजी, मृत बैक्टीरिया में जिसके परिणामस्वरूप पीले या नारंगी दिखाई दे. SYTO 9 को propidium आयोडाइड का अनुपात अलग प्रजातियों के जीवाणु के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है. कोशिकाओं permeabilizing से पहले और SYTO9 और propidium आयोडाइड जोड़ने, एक एलेक्सा Fluor 647 युग्मित सोयाबीन लेक्टिन बाह्य एन का पता लगाने के लिए संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ा गया gonorrhoeae, और दूर की लाल प्रतिदीप्ति संकेत नीले झूठी रंग का था. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया फ़िरोज़ा नीले (+) हरे दिखाई देते हैं और बाहरी nonviable रानी (नीले + लाल) दिखाई देते हैं. आंतरिक रूप से व्यवहार्य बैक्टीरिया हरी ही (तीर) दिखाई देते हैं, और आंतरिक nonviable बैक्टीरिया लाल केवल (Arrowhead) दिखाई देते हैं. यह संक्रमित कोशिकाओं में, यूकेरियोटिक सेल नाभिक SYTO9 और propidium आयोडाइड ("एन", चित्रा -4 ए) से दाग दिया जाएगा कि नोट करना महत्वपूर्ण है. बाहरी व्यवहार्य, बाहरी nonviable, आंतरिक रूप से व्यवहार्य, और आंतरिक nonviable बैक्टीरिया भाँति बैक्टीरिया एक का प्रतिशत उपज के लिए प्रतिदीप्ति छवियों से मात्रा निर्धारित किया गयाएन डी मेजबान कोशिकाओं के अंदर और बाहर प्रतिशत व्यवहार्य बैक्टीरिया.

चित्रा 4 बी एन के एक प्रतिनिधि छवि है व्यवहार्यता रंगों Sytox ग्रीन और DAPI का उपयोग, प्रोटोकॉल 2 के साथ कार्रवाई की neutrophils gonorrhoeae संक्रमित. इस प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर दोनों लाल और पराबैंगनी चैनलों में fluoresces जो propidium आयोडाइड का उपयोग बचा जाता है. सभी एन gonorrhoeae DAPI (नीला) के साथ दाग, लेकिन साथ छेड़छाड़ की झिल्ली के साथ ही बैक्टीरिया Sytox ग्रीन के साथ दाग. कोशिकाओं permeabilizing से पहले, ऊपर वर्णित है, एक एलेक्सा Fluor 647 युग्मित सोयाबीन लेक्टिन बाह्य एन का पता लगाने के लिए संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ा गया जिसका प्रतिदीप्ति इस मामले में झूठी रंग लाल है gonorrhoeae,. इसलिए, बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया प्रकट रानी (लाल + नीला) और बाहरी nonviable बैक्टीरिया (हरी / नीले, लाल +) पीले दिखाई देते हैं. आंतरिक रूप से व्यवहार्य बैक्टीरिया नीले केवल (तीर) दिखाई देते हैं, और आंतरिक nonviable बैक्टीरिया नीले / हरी (तीर) दिखाई देते हैं. डीSytox हरी प्रतिदीप्ति बनाम DAPI के रिश्तेदार तीव्रता पर लंबित nonviable बैक्टीरिया फ़िरोज़ा दिखाई दे सकते हैं. Propidium आयोडाइड और SYTO9 के साथ कार्रवाई की कोशिकाओं के समान, न्युट्रोफिल नाभिक ("एन" द्वारा इंगित) 4B चित्रा में Sytox ग्रीन और DAPI से सना हुआ है. Sytox ग्रीन और DAPI को संक्रमित कोशिकाओं का एक्सपोजर propidium आयोडाइड और SYTO9 के लिए ऊपर वर्णित के रूप में मात्रा निर्धारित मेजबान कोशिकाओं में प्रतिशत internalization और बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का पता चलता है. एन से परिणाम gonorrhoeae संक्रमित neutrophils Sytox ग्रीन और DAPI propidium आयोडाइड और SYTO9 26 के साथ प्राप्त उन लोगों के लिए तुलना कर रहे हैं का उपयोग संसाधित.

चित्रा 4C में दर्शाया के रूप में, प्रोटोकॉल 3 बैक्टीरियल व्यवहार्यता रंगों प्राथमिक या azurophilic न्युट्रोफिल दाना प्रोटीन CD63 के लिए immunofluorescence के साथ संयुक्त कर रहे थे, जिसमें प्रोटोकॉल 2 का रूपांतरण है. इस प्रयोग फेगोसोम डिब्बों की संरचना को परिभाषित करने के क्रम में आयोजित किया गया था मैंव्यवहार्य या nonviable एन होते हैं कि nside neutrophils gonorrhoeae 26. इस प्रोटोकॉल व्यवहार्य बैक्टीरिया, nonviable बैक्टीरिया, कोशिकी बैक्टीरिया, और subcellular मार्कर का पता लगाने के लिए चार रंग प्रतिदीप्ति क्षमता के लिए एक माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है. व्यवहार्यता रंगों एल्डिहाइड निर्धारण (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) के साथ संगत नहीं हैं, हम कोशिकाओं के अंदर प्रतिजन का पता लगाने के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए सीधे एक fluorophore करने के लिए मिलकर एक एंटीबॉडी का उपयोग, निर्धारण के बिना immunofluorescence प्रदर्शन किया. इस एंटीबॉडी लाल fluorophore एलेक्सा Fluor 555 के लिए युग्मित है. प्रोटोकॉल 2 के रूप में, व्यवहार्य और nonviable बैक्टीरिया क्रमशः, DAPI और Sytox ग्रीन का उपयोग प्रतिष्ठित थे, और बाहरी जीवाणुओं एलेक्सा 647 युग्मित सोयाबीन लेक्टिन का उपयोग दाग रहे थे. बाहरी बैक्टीरिया दूर की लाल प्रतिदीप्ति और झूठी रंग बैंगनी हैं. बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया नीले + बैंगनी और बाहरी nonviable बैक्टीरिया नीले / ग्रीन + बैंगनी दिखाई देते दिखाई देते हैं. आंतरिक रूप से व्यवहार्य बैक्टीरिया नीले (तीर) और अंतर प्रकटएनएएल nonviable बैक्टीरिया ग्रीन (Arrowhead) दिखाई देते हैं. CD63 पॉजिटिव granules और phagosomes लाल दिखाई देते हैं. न्युट्रोफिल नाभिक डीएनए विशिष्ट रंगों ("एन") के साथ दाग है. इन छवियों का विश्लेषण करते हैं, तो प्रत्येक व्यक्ति जीवाणु बाहरी बनाम आंतरिक, nonviable बनाम व्यवहार्य, और सकारात्मक या CD63 धुंधला की एक अंगूठी के लिए नकारात्मक. एन के रूप में वर्गीकृत किया गया gonorrhoeae बैक्टीरिया आसपास के CD63 प्रतिदीप्ति की एक अंगूठी के ≥ 50% है, अगर वहाँ एक न्युट्रोफिल CD63 पॉजिटिव फेगोसोम में निवास करने पर विचार किया गया था, और एक CD63 नकारात्मक फेगोसोम में बैक्टीरिया आसपास के CD63 प्रतिदीप्ति की एक अंगूठी की <50% अगर वहाँ . चित्रा 4C में arrowhead ने संकेत nonviable intracellular जीवाणु बैक्टीरिया आसपास के CD63 के लिए धुंधला की एक अंगूठी है. इस अंगूठी प्राथमिक कणिकाओं इस फेगोसोम में समृद्ध कर रहे हैं इंगित करता है. तीर द्वारा संकेत व्यवहार्य intracellular जीवाणु, प्राथमिक कणिकाओं अपने फेगोसोम में समृद्ध नहीं कर रहे हैं, यह दर्शाता है CD63 के लिए धुंधला का अभाव है. हमएन की व्यवहार्यता के बीच एक संबंध दिखाने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल gonorrhoeae और एक प्राथमिक दाना नकारात्मक फेगोसोम 26 में निवास. इस परख ब्याज की एक प्रोटीन का उपयोग कर व्यवहार्यता और बैक्टीरियल स्थानीयकरण दोनों पटरियों, क्योंकि यह nonviable और व्यवहार्य बैक्टीरिया ही है या अलग अलग स्थानों में रहते हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए संभव है. यह जानकारी मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया जीवित रहने के लिए योगदान है कि तंत्र में महत्वपूर्ण प्रारंभिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. व्यवहार्य और nonviable एन का मिश्रण gonorrhoeae मेजबान कोशिकाओं के अभाव में, प्रोटोकॉल 1 के अनुसार एलेक्सा Fluor 647 युग्मित सोयाबीन लेक्टिन, propidium आयोडाइड, और SYTO9 के संपर्क में था. सभी बैक्टीरिया लेक्टिन लिए पहुंच रहे हैं और नीली प्रतिदीप्ति. Nonviable बैक्टीरिया नीले + लाल और nonviable बैक्टीरिया नीले प्रकट प्रकट+ ग्रीन.

चित्रा 2
चित्रा 2. (एबी) मध्य लघुगणक चरण एन gonorrhoeae (ए) के साथ या बैक्टीरिया को मारने के लिए (बी) isopropanol उपचार के बिना, प्रोटोकॉल 1 के रूप में propidium आयोडाइड और SYTO9 के संपर्क में था. nonviable बैक्टीरिया propidium आयोडाइड के लिए पहुंच रहे हैं और लाल दिखाई देते हैं. व्यवहार्य बैक्टीरिया SYTO9 के साथ दाग और हरे रंग की दिखाई देती हैं. (सीडी) मध्य लघुगणक चरण एन gonorrhoeae (सी) के साथ या बैक्टीरिया को मारने के लिए (डी) isopropanol उपचार के बिना, प्रोटोकॉल 2 के रूप में DAPI और Sytox ग्रीन के संपर्क में था. Nonviable बैक्टीरिया DAPI और Sytox ग्रीन करने के लिए पहुंच रहे हैं और ग्रीन + नीला दिखाई देते हैं. व्यवहार्य बैक्टीरिया केवल DAPI के साथ दाग और नीले रंग ही दिखाई देती हैं.

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चित्रा 3. (ए) न्यूट्रोफिल isopropanol मारे एन बाँध और internalize करने के लिए अनुमति दी गई gonorrhoeae, तो प्रोटोकॉल 1 के अनुसार propidium आयोडाइड और SYTO9 से अवगत कराया. Nonviable बैक्टीरिया propidium आयोडाइड के साथ दाग और लाल दिखाई देती हैं. सभी बैक्टीरिया nonviable हैं, हरे, बैक्टीरिया सकारात्मक नहीं SYTO9 पता चला रहे हैं. (बी) न्यूट्रोफिल isopropanol मारे एन बाँध और internalize करने के लिए अनुमति दी गई gonorrhoeae, तो प्रोटोकॉल के अनुसार 2 DAPI और Sytox ग्रीन से अवगत कराया. Nonviable बैक्टीरिया DAPI और Sytox ग्रीन के साथ दाग और नीली + हरी दिखाई देती हैं. सभी बैक्टीरिया nonviable हैं, कोई DAPI ही, नीले केवल बैक्टीरिया का पता चला रहे हैं. एन न्युट्रोफिल नाभिक लेबल. स्केल बार = 5 माइक्रोन. तीर nonviable बैक्टीरिया के कुछ संकेत मिलता है.

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चित्रा 4. (ए) एन gonorrhoeae संक्रमित मानव neutrophils एलेक्सा Fluor 647 युग्मित सोयाबीन लेक्टिन (नीला झूठी रंग) के संपर्क में थे, तब व्यवहार्यता की उपस्थिति में सैपोनिन साथ permeabilized मृत बैक्टीरिया लेबल करने के लिए, propidium आयोडाइड (लाल) रंग, और SYTO9 (हरा), जीवित बैक्टीरिया counterstain लिए. बाहरी nonviable बैक्टीरिया लाल + नीले, आंतरिक nonviable बैक्टीरिया बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया ग्रीन + नीला दिखाई देते हैं, केवल लाल दिखाई देते हैं, और आंतरिक रूप से व्यवहार्य बैक्टीरिया ही हरे रंग दिखाई देते दिखाई देते हैं. (बी) एन gonorrhoeae DAPI (नीला) के साथ चिह्नित किया गया, तो neutrophils के समक्ष प्रस्तुत किया. संक्रमित कोशिकाओं तब तो मृत बैक्टीरिया लेबल करने Sytox ग्रीन (हरा) की उपस्थिति में सैपोनिन साथ permeabilized एलेक्सा Fluor 647 युग्मित सोयाबीन लेक्टिन (झूठी रंग लाल), के संपर्क में थे. बाहरी nonviable बैक्टीरिया ग्रीन + लाल दिखाई देते हैं, आंतरिक nonviable बैक्टीरिया ग्रीन + नीले, बाहरी व्यवहार्य बीएसी प्रकटTeria नीले + लाल दिखाई देते हैं, और आंतरिक रूप से व्यवहार्य बैक्टीरिया केवल नीला दिखाई देते हैं. (सी) एन gonorrhoeae संक्रमित neutrophils CD63 (लाल) permeabilization के समय में जोड़ा गया है न्युट्रोफिल प्राथमिक दाना प्रोटीन के खिलाफ एक एलेक्सा Fluor 555 युग्मित एंटीबॉडी को छोड़कर, बी के रूप में प्रोसेस किया गया. एलेक्सा Fluor 647-सोयाबीन लेक्टिन धुंधला झूठी रंग बैंगनी था. बाहरी nonviable बैक्टीरिया ग्रीन + बैंगनी, आंतरिक nonviable बैक्टीरिया बाहरी व्यवहार्य बैक्टीरिया नीले + बैंगनी दिखाई देते हैं, केवल हरी दिखाई देते दिखाई देते हैं, आंतरिक व्यवहार्य बैक्टीरिया केवल नीला दिखाई देते हैं, और CD63 धुंधला लाल दिखाई देता है. इनसेट सफेद वर्ग के साथ संकेत दिया छवि के क्षेत्र के CD63 प्रतिदीप्ति पता चलता है. एसी में, एन न्युट्रोफिल नाभिक लेबल. स्केल बार = 5 माइक्रोन. तीर nonviable बैक्टीरिया और तीर व्यवहार्य बैक्टीरिया का संकेत संकेत मिलता है.

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Discussion

डीएनए मानव कोशिकाओं को और अंदर संलग्न रहते हैं और मृत बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए एक फ्लोरोसेंट लेक्टिन के साथ संयोजन के रूप में बाध्यकारी और व्यवहार्यता रंगों का उपयोग करने वाले दो प्रोटोकॉल पर बातचीत. दोनों प्रोटोकॉल प्रभावी रूप से मृत बैक्टीरिया से लाइव भेदभाव के बाद से उपयोग करने के लिए जो प्रोटोकॉल का विकल्प प्रयोग का उद्देश्य पर निर्भर करता है. पहले प्रोटोकॉल nonviable बैक्टीरिया और बरकरार बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए SYTO9 पता लगाने के लिए propidium आयोडाइड का उपयोग करता है. चित्रा -4 ए में दिखाया एन से संक्रमित मानव neutrophils के लिए लागू किया प्रोटोकॉल 1 के एक प्रतिनिधि छवि है gonorrhoeae. इन रंगों बाह्य एन पहचान करने के लिए, एक लेक्टिन, सोयाबीन agglutinin साथ संयुक्त थे gonorrhoeae, लेकिन एक fluorescently युग्मित बैक्टीरिया विशिष्ट एंटीबॉडी एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. Propidium आयोडाइड से SYTO9 का बहिष्कार nonviable बैक्टीरिया लाल और व्यवहार्य बैक्टीरिया हरी प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्ति बनाता है के बाद से प्रोटोकॉल 1 तत्काल, व्यक्तिगत बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का पता चलता है. Howeveआर, इस प्रोटोकॉल की वजह से पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए उपलब्ध चार चैनलों में से दो में propidium आयोडाइड का प्रतिदीप्ति के लिए, मेजबान प्रोटीन के लिए immunofluorescence के साथ संयुक्त नहीं किया जा सकता. इसलिए, प्रोटोकॉल 2 कुल बैक्टीरियल आबादी का पता लगाने के लिए nonviable बैक्टीरिया और DAPI की पहचान करने के लिए Sytox ग्रीन का उपयोग करता है, जो विकसित किया गया था. एन की एक उदाहरण gonorrhoeae साथ और मानव neutrophils अंदर जुड़े और Sytox ग्रीन और DAPI का उपयोग संसाधित 4B चित्रा में दिखाया गया है और immunofluorescence के साथ संयोजन में एक उदाहरण चित्रा 4C में दिखाया गया है. दो अतिरिक्त प्रतिदीप्ति चैनलों की उपलब्धता के अलावा, इस प्रोटोकॉल लाल हरे colorblindness साथ व्यक्तियों द्वारा उपयोग के लिए फायदेमंद है. हालांकि, nonviable बैक्टीरिया DAPI और Sytox ग्रीन धुंधला के रिश्तेदार तीव्रता पर और छवि अधिग्रहण मापदंडों पर निर्भर करता है, हरे या नीले, हरे प्रतिदीप्ति कर सकते हैं. DAPI का उपयोग करने के लिए एक दोष यह एन से रिसाव हो सकता है gonorrhoeaeसंक्रमण के दौरान, हालांकि इस तरह के Staphylococcus aureus (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) के रूप में अन्य जीवाणुओं के लिए एक मुद्दा नहीं हो सकता. इस मुद्दे पर प्रतिक्रिया करने के लिए, संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमण के बाद Sytox ग्रीन के साथ DAPI के साथ लेबल, लेकिन परमाणु DAPI धुंधला की तीव्रता एन के प्रतिदीप्ति जबर्दस्ती गया gonorrhoeae (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों). इन दो प्रोटोकॉल के अलावा, अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगों बैक्टीरियल व्यवहार्यता प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) कुल बैक्टीरियल आबादी लेबल सकता है, और Sytox ऑरेंज या ब्लू nonviable बैक्टीरिया की पहचान कर सकता है. इन प्रक्रियाओं के रिश्तेदार प्रभावकारिता जीवाणु और संक्रमित कोशिका प्रकार से भिन्न हो सकते हैं, यह शोधकर्ताओं ने अपने संक्रमण प्रणालियों में विभिन्न व्यवहार्यता डाई संयोजन तुलना महत्वपूर्ण है.

वर्तमान में, हम स्वयं इन प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त प्रत्येक छवि प्रति यों की जांचप्रतिशत internalization, intracellularly और extracellularly प्रतिशत व्यवहार्यता, और subcellular मार्कर के साथ colocalization. स्वचालित कंप्यूटर आधारित विधियों सैद्धांतिक रूप से इन मानकों यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वे व्यवहार्यता रंगों और सेल नाभिक की मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत के साथ बैक्टीरिया के किसी भी गैर वर्दी धुंधला द्वारा जटिल हो सकता है. इसके अलावा, एक subcellular मार्कर के साथ बैक्टीरियल colocalization की परिभाषा जीवाणु, सेल प्रकार, और ब्याज के मार्कर के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है.

इन प्रोटोकॉल की एक सीमा propidium आयोडाइड या Sytox ग्रीन को पारगम्यता बैक्टीरियल मौत का एक सही उपाय है कि इस धारणा है. propidium आयोडाइड और Sytox ग्रीन की आणविक वजन क्रमश: 668.4 दा और 600 दा है. इन रंगों झिल्ली impermeant माना जाता है और बैक्टीरिया मरम्मत रहित झिल्ली क्षति है जब तक कि बैक्टीरियल कोशिका द्रव्य का उपयोग नहीं करना चाहिए. हालांकि, संभावना बैक्टीरिया ठहराव के एक राज्य में प्रवेश कि रहता हैया यहां तक ​​कि उनके झिल्ली क्षति की मरम्मत और बाद के समय में वृद्धि जारी है. एक दूसरी सीमा प्रोटोकॉल व्यक्तिगत बैक्टीरिया की व्यवहार्यता समय पर नज़र रखी जा करने की अनुमति नहीं है. जीवन टेक्नोलॉजीज बैक्टीरिया वे घुड़सवार और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged हैं अब व्यवहार्यता खो देंगे क्योंकि propidium आयोडाइड और SYTO9 साथ बैक्टीरियल व्यवहार्यता का आकलन, रंगों से संपर्क के बाद 30 मिनट के भीतर किया जा सिफारिश की है कि. DAPI / Sytox ग्रीन डाई संयोजन के साथ लेबल संक्रमित कोशिकाओं को भी (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) बढ़ते के बाद तेजी से imaged किया जाना चाहिए. तीसरा, प्रोटोकॉल आमतौर पर इस्तेमाल निर्धारण तकनीकों के साथ संगत नहीं हैं. मेथनॉल या एसीटोन निर्धारण permeabilize और मेजबान कोशिकाओं के साथ जुड़े जीवाणुओं को मारने, और एल्डिहाइड आधारित fixatives एन permeabilize जाएगा gonorrhoeae propidium आयोडाइड और Sytox ग्रीन (अप्रकाशित टिप्पणियों) के लिए मानव neutrophils के अंदर. इस प्रकार इन प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति माइकर लिए तत्काल का उपयोग की आवश्यकता हैoscope और एक दिन में प्रोटोकॉल को पूरा करने की क्षमता. अंत में, इन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल रंगों का प्रत्येक डबल न्यूक्लिक एसिड और बाँध मेजबान परमाणु डीएनए के साथ ही जीवाणु के डीएनए (चित्रा 1) असहाय बाँध. परमाणु डीएनए की प्रतिदीप्ति जीवाणु के डीएनए की प्रतिदीप्ति की तुलना में काफी उज्जवल है, क्योंकि यूकेरियोटिक नाभिक से निकटता में हैं कि बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का आकलन नहीं किया जा सकता. DAPI मदद से लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग और prelabeling बैक्टीरिया परमाणु प्रतिदीप्ति संकेत कम. गैर डीएनए बाध्यकारी बैक्टीरियल व्यवहार्यता रंगों विकसित कर रहे हैं जब तक परमाणु डीएनए की प्रतिदीप्ति इन प्रोटोकॉल की एक उलझन रहेगा.

इन सीमाओं के बावजूद, इस लेख में प्रोटोकॉल के लिए और कोशिकाओं के अंदर संलग्न व्यक्ति बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक संवेदनशील तरीका प्रदान करते हैं. कालोनी गिनती या gentamicin संरक्षण assays माइक्रोबियल रोगजनन अनुसंधान की रीढ़ रही है. हालांकि, वे provएक संभावित विषम जनसंख्या भर में बैक्टीरियल अस्तित्व के एक आकलन आईडीई. इसके विपरीत, यहाँ वर्णित व्यवहार्यता डाई प्रोटोकॉल व्यक्तिगत बैक्टीरिया की अखंडता की जांच करने की अनुमति दे. इसलिए, शोधकर्ताओं कोशिकी बनाम intracellular बैक्टीरिया, अलग phagosomal प्रकार में बैक्टीरिया, या कोशिका द्रव्य बनाम एक phagosome में बैक्टीरिया के भाग्य के बारे में डेटा इकट्ठा कर सकते हैं. पतली धारा ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अक्सर व्यक्तिगत बैक्टीरिया की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. मंदिर से अब कोई इलेक्ट्रॉन प्रकाशमान या बरकरार दिखाई देते हैं कि बैक्टीरिया स्पष्ट रूप से nonviable रहे हैं, यह उनके cytoplasm में कुछ इलेक्ट्रॉन घनत्व को बनाए रखने के बैक्टीरिया है कि वास्तव में बरकरार हैं आकलन है कि और अधिक कठिन है. बहुत कम बिजली क्षेत्रों प्रतिदीप्ति आधारित व्यवहार्यता रंगों के संपर्क में कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है, जबकि इसके साथ ही, यह भी छवि अधिग्रहण के लिए afforded कम समय में, विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त micrographs प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप समय से कई घंटे लग सकते हैं. जबकि प्रावधानोंded प्रोटोकॉल एन के साथ अनुकूलित किया गया gonorrhoeae और प्राथमिक मानव neutrophils, वे सब phagocytic और nonphagocytic कोशिकाओं 5,15-24,26 सहित सेल प्रकार की एक किस्म में ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की कई प्रजातियों की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. बैक्टीरियल व्यवहार्यता रंजक कोशिकाओं में बैक्टीरियल रोगजनन के तंत्र और बैक्टीरिया के संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता की जांच के लिए एक शक्तिशाली प्रायोगिक उपकरण प्रदान करते हैं. भविष्य में, इन प्रोटोकॉल और भी अधिक उपयोगी प्रोकीर्योट्स के लिए एल्डिहाइड निर्धारण के साथ संगत और विशिष्ट हैं कि बैक्टीरियल व्यवहार्यता रंगों के विकास के साथ साथ स्वचालित छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण, के लिए बेहतर उपकरणों के साथ बनने की संभावना है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए अस्य स्मिर्नोव और लौरा Gonyar धन्यवाद. इस काम AKCMBJ को अनुदान एनआईएच R00 TW008042 और R01 AI097312 एनआईएच T32 AI007046 द्वारा समर्थित किया गया था द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection Becton Dickinson 367251  
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml Becton Dickinson 366480  
Sterile water for irrigation Baxter 07-09-64-070  
Dextran 500 Sigma 31392  
Sodium Chloride Fisher Scientific S641  
Dextrose Ricca Chemical Company RDCD0200  
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ Thermo Scientific SH3002802  
Ficoll solution GE Healthcare 17-1440-03  
Acetic Acid Fisher Scientific BP2401  
12 mm circular glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
24-well plates Corning Incorporated 3524  
Pooled Human Serum Sigma S7023  
RPMI Mediatech 15-040-CV  
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007103  
Human interleukin-8 R&D Systems 208-IL/CF  
MOPS Sigma M3183  
MgCl2 Fisher Scientific BP214  
Propidium Iodide Life Technologies L7007 or L7012  
SYTO9 Life Technologies L7007 or L7012  
Saponin Fluka Analytical 47036  
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin Life Technologies L-32463  
DAPI Sigma D8417  
SYTOX Green Life Technologies S7020  
Mouse anti-CD63 Developmental Studies Hybridoma Bank H5C6  
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit Life Technologies A20187  
Hemacytometer Bright Line Hausser Scientific 1492  
Forceps EMS 78320  
Sorvall Legend RT + Centrifuge Thermo Scientific 75004377  

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References

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Johnson, M. B., Criss, A. K.… More

Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (79), e50729, doi:10.3791/50729 (2013).

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