Summary
Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti.
Abstract
Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Attuali protocolli per affrontare tali questioni comprendono saggi di conteggio delle colonie, saggi di protezione gentamicina e microscopia elettronica. Conteggio delle colonie e di protezione gentamicina saggi valutano solo la vitalità di tutta la popolazione batterica e sono in grado di determinare la vitalità batterica individuale. La microscopia elettronica può essere utilizzata per determinare la fattibilità di singoli batteri e fornire informazioni sulla loro localizzazione in cellule ospiti. Tuttavia, i batteri spesso mostrano una gamma di densità di elettroni, rendendo la valutazione della vitalità difficile. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti. Questi test sono stati sviluppati inizialmente per valutare la sopravvivenza di Neisseria gonorrhoeae in neutrofili umani primari, ma dovrebbe essere unApplicabile a qualsiasi interazione cellula batterio-ospite. Questi protocolli si combinano coloranti fluorescenti membrana permeabile (SYTO9 e 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), che macchia tutti i batteri, con coloranti membrana impermeabile fluorescente (propidio ioduro e Sytox verdi), che sono accessibili solo a batteri non vitali. Prima di permeabilizzazione cellula eucariotica, viene aggiunto un anticorpo o reagente fluorescente per identificare i batteri extracellulari. Così questi saggi discriminano la vitalità dei batteri aderente e all'interno delle cellule eucariotiche. Un protocollo è prevista anche per utilizzare i coloranti redditività in combinazione con anticorpi fluorescenti a marcatori di cellule eucariotiche, al fine di determinare la localizzazione subcellulare di singoli batteri. I coloranti vitalità batterica discussi in questo articolo sono un complemento sensibili e / o alternative alle tecniche di microbiologia tradizionali per valutare la fattibilità dei singoli batteri e fornire informazioni riguardanti dove i batteri sopravvivono nella cellula ospites.
Introduction
C'è una interazione dinamica e co-evoluzione tra i batteri ei padroni di casa in cui risiedono. I batteri si sono evoluti organelli aderenza, sistemi di secrezione e / o la capacità di produrre tossine che consentono loro infezione produttiva di phagocytic host e le cellule non fagocitarie. I batteri devono anche vedersela con il riconoscimento e l'attività antimicrobica del sistema immunitario dell'ospite. Il sistema immunitario ospite comprende componenti innate e adattative comprese barriere fisiche e chimiche, cellule immunitarie, il sistema del complemento, e altri componenti di immunità umorale. Mentre molti batteri sono suscettibili di abbattimento e passaggio della risposta immunitaria ospitante multistrato, alcuni batteri patogeni e opportunisti sono evoluti meccanismi per infettare una varietà di cellule ospiti e sovvertire passaggio della risposta immunitaria ospitante 1. Neisseria gonorrhoeae è un esempio di un batterio patogeno che è altamente adattato a persistere nel suo ospite umano. N. gonorrhoeae colonizza facilmente le superfici luminali delle cellule epiteliali della mucosa del tratto urogenitale, faringe, congiuntiva, e del retto. Colonizzazione innesca l'abbondante assunzione di neutrofili nei siti mucosali. I neutrofili sono fagociti professionali che possiedono una varietà di processi antimicrobici per uccidere i microrganismi, tuttavia, N. gonorrhoeae è in grado di sopravvivere in presenza di neutrofili 2-5. Capire come batteri patogeni come N. gonorrhoeae sovvertire, sopprimere, e dirottare la risposta immunitaria a sopravvivere in ultima analisi, in ambienti host normalmente ostili è cruciale per lo sviluppo di nuove terapie per la lotta contro le malattie infettive.
Protocolli sperimentali usati spesso per studiare la sopravvivenza dei batteri nelle cellule ospiti comprendono saggi di conteggio delle colonie, saggi di protezione gentamicina e microscopia elettronica. In saggi conteggio delle colonie, una popolazione di cellule infette viene lisato (per esempio, con un detergente a which i batteri sono resistenti) per liberare i batteri. I lisati sono diluiti e piastrate su supporti a base di agar, e unità formanti colonie nei lisati vengono enumerate per ciascun punto di tempo e / o condizione sperimentale. Questo approccio riporta la redditività di tutta la popolazione batterica, ma non è in grado di distinguere tra intracellulare ed extracellulare sopravvivenza. Una variazione del dosaggio conteggio delle colonie, il test di protezione gentamicina, misuri specificamente sopravvivenza batterica intracellulare, basato sulla incapacità dei gentamicina antibiotico per attraversare la membrana plasmatica eucariotica 6. Tuttavia, questo test dipende dai batteri essendo suscettibile di uccisione da gentamicina (o altro antibiotico che è simile eucariotico membrana impermeant) e l'incapacità di antibiotico per avere accesso ai batteri interne. Pertanto, un test di protezione gentamicina può non essere efficace per l'esame di tutte le specie batteriche o nell'esame sopravvivenza batterica altamentecellule pinocytic come neutrofili. Nessuno di questi approcci rivela la localizzazione subcellulare o altri comportamenti di batteri individuali (ad esempio, se i batteri formano aggregati o microcolonie che si comportano diversamente da cellule batteriche individuali). Un altro approccio frequentemente utilizzato per esaminare la fattibilità dei singoli batteri esterni e interni è sottile-sezione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questo approccio è vantaggioso in quanto può fornire informazioni sulla posizione dei batteri in cellule ospiti (es phagosome, citoplasma, dell'autofagosoma), che può essere ulteriormente esaminato al microscopio immunoelettronica con anticorpi oro accoppiata contro marcatori subcellulari. Tuttavia, microscopia elettronica non è particolarmente sensibile a valutare vitalità batterica. Quando le sezioni incorporati vengono colorate con acetato di uranile, citrato di piombo, o altri reagenti elettrone-densi e ripreso al microscopio elettronico, i batteri elettrone-densi sono considerati vitali ed elettronichetron-Lucent non vitali 7,8. Tuttavia, questa ipotesi sopravvaluta vitalità batterica, dal momento che solo i batteri morti con membrane gravemente perturbati e privo di citoplasma appare elettrone-Lucent. Inoltre, alcune specie batteriche possono visualizzare una gamma di densità di elettroni a seconda della loro fase di crescita, rendendo difficile determinare la vitalità.
In alternativa o in aggiunta a questi metodi ampiamente utilizzati, qui forniamo protocolli e razionale per l'uso di coloranti fluorescenti che indicano vitalità batterica per valutare la sopravvivenza dei batteri attaccati ae internalizzati dalle cellule ospiti. Per identificare i batteri extracellulari, cellule infettate vengono prima esposti a un reagente fluorescente, come una lectina o anticorpo specifici batteri. Le cellule infettate vengono permeabilizzate ed esposti a coloranti specifici di DNA che sono differenzialmente accessibili ai batteri con membrane intatte vs degradati, come surrogato vitalità batterica. Nel primo protocol, la membrana permeabile colorante SYTO9 identifica la popolazione batterica totale, mentre ioduro di propidio è accessibile solo a quei batteri che hanno compromesso le membrane e sono quindi considerate non vitali. Ioduro di propidio e SYTO9 sono stati utilizzati per valutare la vitalità batterica in biofilm, discriminare patogeni dai batteri non patogeni, ed enumerare a base d'acqua batteri vitali 9-12. Nel secondo protocollo, 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) identifica i batteri totali, mentre Sytox verde è accessibile solo alla popolazione non vitali. Queste coppie vitalità coloranti possono essere combinati con immunofluorescenza per determinare la posizione di ciascun batterio in relazione ad una proteina di interesse, ad esempio per definire localizzazione subcellulare batterica. L'uso di questi test fornisce informazioni chiave nelle interazioni che provocano battericida o sopravvivenza durante l'infezione delle cellule ospiti. I protocolli descritti in questo articolo sono stati usati per valutare la fattibilità diN. gonorrhoeae che è attaccato e dentro neutrofili umani primari, tra cui in diverse popolazioni di phagosomes neutrofili 5,13,14. Tuttavia, questi protocolli possono essere applicati per valutare la vitalità dei batteri gram-positivi e gram-negativi in fagociti professionali, fagociti non professionali, e protozoi 15-24.
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Protocol
1. Valutare batterica Viabilità con ioduro di propidio e SYTO9
- Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri di interesse. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici.
- Lavare le cellule una volta delicatamente in 0.1 M 3 - (N-morfolino) Acido propanosulfonico (MOPS), pH 7.2, contenente 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl 2).
- Incubare le cellule per 10 minuti al buio a temperatura ambiente con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl 2, per rilevare batteri esterni.
NOTA: effettuare controlli con batteri vivi e morti, in assenza di cellule ospiti, per dimostrare che la lectina o anticorpi di interesse lega tutti i batteri, indipendentemente della redditività (Figura 1).
- Lavare le cellule due volte con MOPS / MgCl 2.
- Aspirare mEDIA da cellule e aggiungere 0,5 ml Live / Morto colorazione soluzione. Live / Morto colorazione soluzione è di 5 micron SYTO9, 30 micron ioduro di propidio, e lo 0,1% di saponina (concentrazioni finali) in MOPS / MgCl 2.
- Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl 2.
- Coprioggetto Inverti faccia in giù su vetrini e sigillare con smalto trasparente. Non utilizzare supporti di montaggio.
- Acquisire immagini in 30 minuti, utilizzando un microscopio a fluorescenza con set di filtri compatibili con l'acquisizione di immagini verde, rosso e rosso lontano.
NOTA: Sia microscopia a fluorescenza convenzionale e microscopio confocale a scansione laser può essere usato. Dopo 30 minuti i coloranti fluorescenti cominciano a trapelare dai batteri ed i dati acquisiti non sono più accurate. Le immagini mostrate in questo articolo sono stati acquisiti su un microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse E800 verticale con fotocamera digitale Hamamatsu Orca-ER utilizzando il software Openlab. Fluorescenza di Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d'onda di 590-650 nm ed un filtro per le emissioni di 663-735 nm, ed è falso-colore blu. Fluorescenza da ioduro di propidio è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 540-580 nm ed un filtro di emissione di 600-660 nm. Fluorescenza da SYTO9 stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm.
- Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono blu + rosso, i batteri non vitali interni appaiono solo rosso, batteri vitali esterne appaiono blu + verde, e batteri vitali interni appaiono solo verde. Contare occhio il numero di batteri che sono esterni non vitale, non vitale interno, esterno praticabile, e interno redditizio.
- Calcolare la percentuale di batteri vitali esterni dividendo il numero di batteri vitali esterni per il numero totale di batteri esterni (vitali più nonvigrado). Calcolare la percentuale di batteri vitali interne dividendo il numero di batteri vitali interne per il numero totale di batteri interne (vitali più non vitale) (Figura 4).
- Ci sono due controlli essenziali per eseguire con questo protocollo. In primo luogo, verificano che tutti i batteri non vitali sono ioduro di propidio-positivi e tutti i batteri vivi sono SYTO9-positivi. Una cultura mid-logaritmica di batteri (in assenza di cellule ospiti) deve essere> 95% SYTO9-positivo. In figura 2 è una cultura medio-logaritmica di N. gonorrhoeae (a 10 8 colonia unità per ml di formatura) incubate con Live / Morto colorazione Solution. In secondo luogo, verificano che sia ioduro di propidio e SYTO9 possono entrare permeabilizzate, cellule ospiti infettate.
- Per generare una popolazione di batteri morti, raccogliere 2 x 10 8 unità formanti colonia batterica in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 70% di isopropanolo e riposare per 10 min. Pellet i batteri in una microcentrifuga unnd lavare i batteri due volte in PBS per rimuovere isopropanolo residuo. Poi seguire il protocollo passaggi 1,5-1,7. Aggiungere 5 ml di sospensione batterica di un vetrino e sovrapporre con un coprioggetto. Campioni della fotografia come in protocollo step 1.9. In queste condizioni, il 100% della popolazione dovrebbe essere propidio ioduro positivo (Figura 2). In alcune specie batteriche, ioduro di propidio non può sopraffare completamente SYTO9 colorazione e batteri non vitali può apparire di colore giallo o arancione.
- Per fagociti come neutrofili, esporre le cellule di batteri isopropanolo-uccisi e assicurarsi che il 100% dei batteri intracellulari sono propidio ioduro-positive (figura 3). Per le celle nonphagocytic che non può internalizzare batteri morti, può essere sufficiente per trattare cellule infettate con sodio azide o di altri agenti antimicrobici cellule permeante prima di aggiungere Live / Morto colorazione Solution.
2. Valutare batterica Viabilità con Sytox Green e DAPI
- Batteri Label di interessi con 10 mcg / ml DAPI a Morse Definito medio di 25 per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri DAPI-etichettati. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici.
- Lavare le cellule una volta con MOPS / MgCl 2.
- Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente al buio con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl 2, per rilevare batteri esterni. Vedi nota nel protocollo step 1.3 per i controlli suggeriti.
- Aspirare i media dalle cellule e aggiungere 0,5 ml di 0,4 micron Sytox verde in MOPS / MgCl 2.
- Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl 2.
- Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl 2 per 5 min.
NOTA: Fluorescenza da Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d'onda di 590-650 nm ed un filtro per le emissioni di 663-735 nm, ed è falso-colore rosso. Fluorescenza da Sytox Green è stato rilevato utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm. Fluorescenza da DAPI è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 355-375 nm e filtro barriera 400 nm.
- Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono rosso + verde, i batteri non vitali interni appaiono verde + blu, batteri vitali esterne appaiono di colore rosso + blu e batteri vitali interni appaiono blu solo (Figura 4). Quantificare la percentuale di batteri esterni e interni come descritto nel protocollo step 1.11.
- I controlli descritti nel protocollo punto 1.12 devono essere eseguite con il colorante combinazione DAPI / Sytox verde (figure 2 e 3).
3. Valutare batterica Viabilità Accanto localizzazione subcellulare
- Batteri Label di interessi con 10 mcg / ml DAPI in Piano Definito di Morse per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri DAPI-etichettati. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici.
- Lavare le cellule una volta con MOPS / MgCl 2.
- Incubare 10 minuti a temperatura ambiente al buio con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl 2, per rilevare batteri esterni. Vedi nota nel protocollo step 1.3 per i controlli suggeriti.
- Aspirare i media dalle cellule e lavare le cellule due times in MOPS / MgCl 2.
- Incubare le cellule con Alexa Fluor 555 anticorpi accoppiati contro marcatore subcellulare di interesse per 20 minuti, in MOPS / MgCl 2 contenente 0,2% saponina.
- Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl 2.
- Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl 2 per 5 min.
- Aspirare i media dalle cellule e aggiungere 0,4 micron Sytox verde in MOPS / MgCl 2.
- Incubare le cellule 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl 2.
- Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl 2 per 5 min.
- Acquisire le immagini di diapositive in 30 min a microscopio a fluorescenza. Vedere protocollo step 1.9 per la descrizione di microscopio, macchina fotografica digitale e software di acquisizione.
NOTA: Fluorescenza da Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d'onda di 590-650 nm e filtro di emissione di 663-735 nm, ed è falso-colore viola. Fluorescenza from Alexa Fluor 555 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 540-580 nm ed un filtro di emissione di 600-660 nm. Fluorescenza da Sytox Green è stato rilevato utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm. Fluorescenza da DAPI è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 355-375 nm e filtro barriera 400 nm.
- Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono viola + verde, i batteri non vitali interni appaiono verde + blu, batteri vitali esterne appaiono viola + blu, batteri vitali interni appaiono blu solo, e proteine subcellulare appare rosso (Figura 4). Quantificare il perecent di batteri vitali interni ed esterni come descritto nel protocollo passaggi 1.11.
- I controlli descritti nel protocollo punto 1.12 devono essere eseguite con il colorante combinazione DAPI / Sytox verde (figure 2 e 3).
- InOltre a contare batteri vitali e non vitali, classificare ogni batteri come positivo o negativo per colocalizzazione con il marker subcellulare di interesse.
- Calcolare la percentuale di batteri vitali colocalized con il marcatore subcellulare dividendo il numero di batteri vitali colocalized per il numero totale di batteri vitali. Calcolare la percentuale di batteri non vitali colocalized con il marcatore subcellulare dividendo il numero di batteri colocalized non vitali per il numero totale di batteri non vitali.
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Representative Results
I protocolli descritti sono stati usati per esaminare la sopravvivenza di N. gonorrhoeae dopo l'esposizione al primario dell'uomo neutrofili 5,26. I neutrofili sono stati infettati con N. gonorrhoeae e trattati con protocollo 1, utilizzando la vitalità SYTO9 colorante verde fluorescente e lo ioduro di propidio-rosso fluorescente (Figura 4A). I coloranti sono stati aggiunti in presenza di saponina, che sequestra colesterolo per permeabilize preferenzialmente membrane plasmatiche cellula ospite, non N. membrane gonorrhoeae. Altri detergenti possono avere bisogno di essere testati se le membrane dei batteri di interesse contengono elevate quantità di colesterolo. Tutto N. macchia gonorrhoeae con SYTO9, ma solo i batteri con membrane compromessi colorano con ioduro di propidio. Lo ioduro di propidio supera la fluorescenza SYTO9, così batteri vivi appaiono batteri verdi e morti appaiono di colore rosso 27. In alcune specie batteriche, ioduro di propidio non può superare completamente SYTO9 staining, con conseguente batteri morti che appaiono giallo o arancione. Il rapporto di propidio ioduro di SYTO 9 maggio bisogno di essere ottimizzato per diverse specie batteriche. Prima permeabile alle cellule e aggiungendo SYTO9 e ioduro di propidio, un Alexa Fluor soia 647 accoppiato lectina è stato aggiunto alle cellule infette per rilevare N. extracellulare gonorrhoeae, e il segnale di fluorescenza far-red era falso-colore blu. Così, in questo protocollo batteri vitali esterni appaiono turchese (blu + verde) e non vitale esterno appaiono magenta (blu + rosso). Batteri vitali interni appaiono verdi solo (freccia), e batteri non vitali interni appaiono solo rosso (punta di freccia). È importante notare che nelle cellule infette, il nucleo della cellula eucariotica essere colorata da SYTO9 e ioduro di propidio ("N", Figura 4A). Le vitali, non vitali, batteri interne esterne esterne vitali e non vitali interni sono stati quantificati da immagini di fluorescenza a cedere la percentuale di batteri internalizzati unnd i cento batteri vitali dentro e fuori le cellule ospiti.
Figura 4B è una immagine rappresentativa di N. neutrofili trattati con protocollo 2 gonorrhoeae-infetti, utilizzando i coloranti viabilità Sytox verde e DAPI. Questo protocollo evita l'uso di ioduro di propidio, che reagisce in entrambi i canali rosso e ultravioletti sulla microscopio a fluorescenza. Tutto N. macchia gonorrhoeae con DAPI (blu), ma solo i batteri con membrane compromessi macchia con Sytox Verde. Come descritto sopra, prima permeabilizzante le cellule, un Alexa Fluor soia 647 accoppiato lectina è stato aggiunto alle cellule infette per rilevare N. extracellulare gonorrhoeae, la cui fluorescenza in questo caso è falso-colore rosso. Pertanto, batteri vitali esterni appaiono magenta (rosso + blu) e batteri non vitali esterni appaiono giallo (rosso + verde / blu). Batteri vitali interni appaiono blu solo (frecce), e batteri non vitali interni appaiono verdi / blu (punte di freccia). Deseconda della intensità relativa di DAPI vs fluorescenza Sytox verde, i batteri non vitali possono apparire turchese. Simile a cellule lavorati con ioduro di propidio e SYTO9, il nucleo dei neutrofili è macchiato da Sytox verde e DAPI in Figura 4B (indicato da "N"). L'esposizione delle cellule infettate a Sytox verde e DAPI rivela la percentuale di internalizzazione e la vitalità dei batteri nelle cellule ospiti, quantificati come descritto sopra per ioduro di propidio e SYTO9. Risultati da N. neutrofili gonorrhoeae-infetti trattati con Sytox verde e DAPI sono paragonabili a quelli ottenuti con ioduro di propidio e SYTO9 26.
Come illustrato nella Figura 4C, protocollo 3 è un adattamento di protocollo 2, in cui i coloranti vitalità batterica sono stati combinati con immunofluorescenza per la proteina neutrofili granello primario o azurophilic CD63. Questo esperimento è stato condotto allo scopo di definire la composizione dei compartimenti phagosome ineutrofili abitacolo che contengono N. vitali o non vitali gonorrhoeae 26. Questo protocollo richiede un microscopio per fluorescenza capacità quadricromia per rilevare batteri vitali, batteri non vitali, batteri extracellulari e marcatore subcellulare. Poiché i coloranti della vitalità non sono compatibili con aldeide fissaggio (nostre osservazioni non pubblicate), abbiamo effettuato immunofluorescenza senza fissazione, utilizzando un anticorpo accoppiato direttamente ad un fluoroforo per ridurre al minimo il tempo necessario per rivelare l'antigene all'interno delle cellule. Questo anticorpo è accoppiato al fluoroforo rosso Alexa Fluor 555. Come nel protocollo 2, batteri vitali e non vitali sono stati distinti con DAPI e Sytox Verde, rispettivamente, e batteri esterni sono stati colorati con Alexa 647-coupled lectina di soia. Batteri esterni fluorescenza rosso lontano e sono false color viola. Batteri vitali esterni appaiono viola + blu ed esterni batteri non vitali appaiono viola + verde / blu. Batteri vitali interni appaiono blu (freccia) e interbatteri non vitali nali appaiono verdi (punta di freccia). Granuli e phagosomes CD63-positive appaiono rossi. Il nucleo dei neutrofili è macchiato con i coloranti specifici del DNA ("N"). Quando si analizzano queste immagini, ogni singolo batterio è stato classificato come esterno vs interno, vitale vs non vitale e positivo o negativo per un anello di CD63 colorazione. N. gonorrhoeae era considerata risiedere in un neutrofilo CD63-positive phagosome se vi è ≥ 50% di un anello di CD63 fluorescenza circonda i batteri, e in un phagosome CD63-negativo se vi è <50% di un anello di CD63 fluorescenza circonda i batteri . Il batterio intracellulare non vitale indicato dalla freccia in Figura 4C ha un anello di colorazione per CD63 circonda i batteri. Questo anello indica granuli primari sono arricchiti in questo phagosome. Il batterio intracellulare praticabile, indicata dalla freccia, manca di colorazione per CD63, indicando granuli primari non sono arricchiti nella phagosome. Noiusato questa tecnica per mostrare una correlazione tra la vitalità di N. gonorrhoeae e la residenza in un granulo-negativo phagosome primaria 26. Poiché questo test ascolti sia vitalità e localizzazione batterica utilizzando una proteina di interesse, è possibile determinare se i batteri non vitali e vitali risiedono nelle stesse o diverse posizioni. Queste informazioni forniscono importanti prima idea meccanismi che contribuiscono alla sopravvivenza dei batteri nelle cellule ospiti.
Figura 1. Un mix di N. vitale e non vitale gonorrhoeae è stato esposto alla Alexa Fluor lectina di soia 647 accoppiati, ioduro di propidio, e SYTO9 secondo il protocollo 1, in assenza di cellule ospiti. Tutti i batteri sono accessibili alla lectina e fluorescenza blu. Batteri non vitali appaiono i batteri blu + rosso e non vitali appaiono blu+ Verde.
Figura 2. (AB) Mid-logaritmica fase N. gonorrhoeae è stato esposto a ioduro di propidio e SYTO9 come nel protocollo 1, con (A) o senza (B) Trattamento isopropanolo per uccidere i batteri. batteri non vitali sono accessibili a ioduro di propidio e appaiono di colore rosso. Batteri vitali sono colorate con SYTO9 e appaiono verdi. (CD) Mid-logaritmica fase N. gonorrhoeae è stato esposto a DAPI e Sytox verde come nel protocollo 2, con (C) o senza (D) Trattamento isopropanolo per uccidere i batteri. Batteri non vitali sono accessibili a DAPI e Sytox verde e appaiono blu + verde. Batteri vitali sono macchiati solo con DAPI e appaiono blu solo.
Figura 3. (A) I neutrofili sono stati autorizzati a legare e interiorizzare isopropanolo-ucciso N. gonorrhoeae, quindi esposto a ioduro di propidio e SYTO9 secondo il protocollo 1. I batteri non vitali sono colorate con ioduro di propidio e appaiono di colore rosso. Come tutti i batteri sono non vitale, non SYTO9 positivo, batteri verdi vengono rilevati. (B) I neutrofili sono stati autorizzati a legare e interiorizzare isopropanolo-ucciso N. gonorrhoeae, quindi esposto ad DAPI e Sytox verde secondo il protocollo 2. I batteri non vitali sono colorate con DAPI e Sytox verde e appaiono blu + verde. Come tutti i batteri sono non vitale, non solo DAPI, vengono rilevati solo i batteri blu. N etichetta il nucleo dei neutrofili. Barra della scala = 5 micron. Punte di freccia indicano alcuni dei batteri non vitali.
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Figura 4. (A) N. neutrofili umani gonorrhoeae-infette sono stati esposti a Alexa Fluor 647-accoppiato lectina di soia (true color blu), poi permeabilizzate con saponina in presenza della redditività tinge propidio ioduro (rosso), etichettare batteri morti, e SYTO9 (verde), di colorazione di contrasto batteri vivi. batteri non vitali esterni appaiono blu + rosso, i batteri non vitali interni appaiono di colore rosso solo, batteri vitali esterne appaiono blu + verde, e batteri vitali interni appaiono solo verde. (B) N. gonorrhoeae è stato marcato con DAPI (blu), poi presentato al neutrofili. Le cellule infettate sono stati poi esposti a Alexa Fluor lectina di soia 647 accoppiati (true color rosso), poi permeabilizzate con saponina in presenza di Sytox Green (verde) per etichettare batteri morti. Batteri non vitali esterni appaiono di colore rosso + verde, i batteri non vitali interni appaiono verde + blu, bac praticabile esternoteria appaiono di colore rosso + blu e batteri vitali interni appaiono solo blu. (C) N. neutrofili gonorrhoeae-infette sono stati elaborati come in B, tranne un anticorpo 555 accoppiato Alexa Fluor contro la proteina neutrofili granello primario CD63 (rosso) è stata aggiunta al momento della permeabilizzazione. La Alexa Fluor 647-lectina di soia colorazione era falso-colore viola. Batteri non vitali esterni appaiono viola + verde, i batteri non vitali interni appaiono verdi solo, batteri vitali esterne appaiono viola + blu, batteri vitali interni appaiono blu solo, e CD63 colorazione appare rosso. L'inserto mostra la fluorescenza CD63 dell'area dell'immagine indicata con il quadrato bianco. In AC, N etichetta il nucleo dei neutrofili. Barra della scala = 5 micron. Punte di freccia indicano batteri non vitali e le frecce indicano batteri vitali.
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Discussion
Qui presentati sono due protocolli che utilizzano legame al DNA e coloranti vitalità in combinazione con una lectina fluorescente per identificare batteri vivi e morti allegate e dentro le cellule umane. Poiché entrambi i protocolli effettivamente discriminare in diretta da batteri morti, la scelta di quale protocollo da utilizzare dipende l'obiettivo dell'esperimento. Il primo protocollo utilizza ioduro di propidio per rilevare i batteri non vitali e SYTO9 per rilevare i batteri intatti. Mostrato nella Figura 4A è una immagine rappresentativa del protocollo 1 apposte neutrofili umane infettate con N. gonorrhoeae. Questi coloranti sono stati combinati con un agglutinina lectina, soia, di riconoscere N. extracellulare gonorrhoeae, ma un anticorpo specifico batteri fluorescente accoppiato potrebbero essere utilizzati come alternativa. Protocollo 1 rivela rapidamente la redditività dei singoli batteri, in quanto l'esclusione di SYTO9 da ioduro di propidio rende i batteri non vitali reagiscono batteri rossi e vitali fluorescenza verde. However, questo protocollo non può essere combinato con immunofluorescenza per proteine ospite, dovuto alla fluorescenza di propidio ioduro in due dei quattro canali disponibili per microscopia a fluorescenza convenzionale. Pertanto, il protocollo 2 è stato sviluppato, che utilizza Sytox verde per identificare i batteri non vitali e DAPI per rilevare la popolazione batterica totale. Un esempio di N. gonorrhoeae associato e all'interno neutrofili umani e trattati mediante Sytox verde e DAPI è illustrato nella Figura 4B e un esempio in combinazione con immunofluorescenza è mostrato in Figura 4C. Oltre alla disponibilità di due canali di fluorescenza aggiuntivi, questo protocollo è vantaggioso per l'uso da parte di persone con daltonismo rosso-verde. Tuttavia, i batteri non vitali possono fluorescenza verde o blu-verde, a seconda della intensità relativa di DAPI e Sytox colorazione verde e sui parametri di acquisizione dell'immagine. Uno svantaggio dell'uso di DAPI è che può fuoriuscire dalla N. gonorrhoeaedurante il corso dell'infezione, anche se questo può non essere un problema per altri batteri come Staphylococcus aureus (nostre osservazioni non pubblicate). Per contrastare questo problema, cellule infettate sono state marcate con DAPI insieme Sytox verde dopo l'infezione, ma l'intensità della colorazione DAPI nucleare sopraffatto la fluorescenza di N. gonorrhoeae (le nostre osservazioni non pubblicate). In aggiunta a questi due protocolli, altri coloranti disponibili in commercio possono essere usati per rivelare vitalità batterica. Ad esempio, estere succinimidyl carbossifluoresceina (CFSE) potrebbe etichettare la popolazione batterica totale e Sytox arancio o blu potrebbe identificare i batteri non vitali. Poiché l'efficacia relativa di queste procedure può variare con il tipo di batterio e cellula infetta, è importante che i ricercatori confrontare diverse combinazioni vitalità colorante nei loro sistemi di infezione.
Attualmente, esaminiamo manualmente ogni immagine ottenuta con questi protocolli di quantificare perinteriorizzazione cento per cento vitalità intracellulare ed extracellulare, e colocalizzazione con marcatori subcellulare. Mentre i metodi basati su computer automatizzate possono teoricamente essere utilizzati per quantificare questi parametri, possono essere complicate da qualsiasi colorazione non uniforme dei batteri con coloranti redditività e la forte segnale di fluorescenza del nucleo cellulare. Inoltre, la definizione di colocalizzazione batterica con un marcatore subcellulare può avere bisogno di essere ottimizzato per i batteri, tipo cellulare e marcatore di interesse.
Un limite di questi protocolli è il presupposto che la permeabilità di propidio ioduro o Sytox verde è una vera misura di morte batterica. Il peso molecolare di ioduro di propidio e Sytox verde è 668,4 Da e 600 Da, rispettivamente. Questi coloranti sono considerati membrana impermeant e non devono accedere al citoplasma batterico meno che i batteri hanno danni alla membrana non riparati. Tuttavia, rimane la possibilità che i batteri entrano in uno stato di stasio anche riparare i danni della membrana e continuare a crescere in tempi successivi. Una seconda limitazione è che i protocolli non consentono la vitalità dei singoli batteri da tracciare nel tempo. Life Technologies raccomanda che le valutazioni di vitalità batterica con ioduro di propidio e SYTO9 essere eseguite entro 30 minuti dopo l'esposizione ai coloranti, poiché i batteri perderanno redditività più sono montate e ripreso al microscopio a fluorescenza. Cellule infettate etichettati con la combinazione DAPI / Sytox colorante verde devono essere ripreso rapidamente dopo il montaggio (le nostre osservazioni non pubblicate). In terzo luogo, i protocolli non sono compatibili con tecniche di fissaggio comunemente usati. Metanolo o acetone fissazione sarà permeabilize e uccidere i batteri associati con le cellule ospiti, e fissativi a base di aldeide-permeabilize N. gonorrhoeae all'interno neutrofili umani di ioduro di propidio e Sytox Green (osservazioni non pubblicate). Quindi, usando questi protocolli richiede l'accesso immediato a una MICR fluorescenzaoscope e la capacità di completare i protocolli in un giorno. Infine, ciascuno dei coloranti utilizzati in questi protocolli legano acidi nucleici a doppio filamento e ospitante bind DNA nucleare e il DNA batterico (Figura 1). A causa fluorescenza del DNA nucleare è significativamente maggiori fluorescenza del DNA batterico, la vitalità dei batteri che sono in prossimità del nucleo eucariotico non può essere valutata. Microscopio confocale a scansione laser e batteri prelabeling con DAPI contribuire a ridurre il segnale di fluorescenza nucleare. Fluorescenza del DNA nucleare rimarrà una complicazione di questi protocolli sono sviluppati fino-non-DNA-binding coloranti vitalità batterica.
Nonostante questi limiti, i protocolli in questo articolo forniscono un modo sensibile per valutare la fattibilità dei singoli batteri attaccati da e all'interno delle cellule eucariotiche. Conteggio delle colonie o gentamicina protezione saggi sono stati la spina dorsale della ricerca patogenesi microbica. Tuttavia, essi provide una valutazione della sopravvivenza dei batteri in una popolazione potenzialmente eterogenea. Al contrario, i protocolli vitalità tintura qui descritte consentono l'integrità dei singoli batteri da esaminare. Pertanto, i ricercatori possono raccogliere dati riguardanti le sorti della extracellulare contro batteri intracellulari, batteri in diversi tipi phagosomal, o batteri in un phagosome contro il citoplasma. Sezione sottile microscopia elettronica a trasmissione è stato spesso utilizzato per esaminare la fattibilità dei singoli batteri. Mentre i batteri che appaiono elettrone-Lucent o non più intatta TEM sono chiaramente non vitale, è più difficile valutare se i batteri che mantengono una certa densità di elettroni nel loro citoplasma sono effettivamente intatti. Inoltre, può richiedere molte ore di elettroni tempo microscopio per acquisire sufficienti microscopio per analizzare, mentre molti campi a bassa potenza possono essere acquisite dalle cellule esposte a coloranti vitalità basato sulla fluorescenza, anche in breve tempo offerto per l'acquisizione delle immagini. Mentre le disposiprotocolli ded sono stati ottimizzati con N. gonorrhoeae e neutrofili umani primari, possono essere adattati per valutare la vitalità di molte specie di batteri gram-negativi e gram-positivi in una varietà di tipi cellulari, comprese tutte fagocitica e cellule eucariotiche nonphagocytic 5,15-24,26. Coloranti vitalità batterica forniscono un potente strumento sperimentale per esaminare meccanismi di patogenesi batterica in cellule eucariotiche e la capacità delle cellule eucariotiche per controllare l'infezione batterica. In futuro, questi protocolli sono destinate a diventare sempre più utile con strumenti migliori per l'acquisizione e l'elaborazione automatica delle immagini, insieme allo sviluppo di coloranti vitalità batterica che sono compatibili con la fissazione aldeide e specifico per procarioti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Asya Smirnov e Laura Gonyar per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R00 e R01 TW008042 AI097312 a AKCMBJ è stato supportato in parte dal NIH T32 AI007046.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
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