哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

Summary

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。

Abstract

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。これらの疑問を解決するために、現在のプロトコルは、コロニー数アッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、および電子顕微鏡が含まれています。コロニー数およびゲンタマイシン保護アッセイは、全体細菌集団の生存能力を評価し、個々の細菌生存率を測定することができない。電子顕微鏡法は、個々の細菌の生存度を決定し、宿主細胞におけるそれらの局在化に関する情報を提供するために使用することができる。しかし、細菌はしばしば生存率の評価を困難に、電子密度の範囲を示す。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。これらのアッセイは、初代ヒト好中球淋菌の生存を評価するために独自に開発されましたが、あるべき任意の細菌宿主細胞の相互作用にpplicable。これらのプロトコルは、アクセス可能であり、膜不透過性蛍光色素（ヨウ化プロピジウムおよびSYTOXグリーン）のすべての細菌を、染色膜透過性蛍光色素（SYTO9及び4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニル[DAPI]）を、コンバイン生育不能細菌。真核細胞の透過処理の前に、抗体または蛍光試薬は、細胞外細菌を同定するために添加される。したがって、これらのアッセイは、真核細胞への内部付着細菌の生存を判別する。プロトコルは、個々の細菌の細胞内局在を決定するために、真核細胞マーカーに対する蛍光抗体と組み合わせて生存色素を使用するために設けられている。この資料に記載された細菌の生存率染料は、個々の細菌の生存率を評価し、細菌が宿主細胞内で生存する場所に関する情報を提供するために、伝統的な微生物学技術に対して敏感で補体および/または代替物であるS。

Introduction

細菌やそれらが存在するホスト間の動的相互作用と共進化があります。細菌が付着小器官、分泌系、および/または宿主食細胞および非貪食細胞のそれらの生産的な感染を可能にする毒素を産生する能力を進化させてきた。細菌は、宿主免疫系の認識と抗菌活性と競合しなければならない。宿主の免疫系は、物理的および化学的障壁、免疫細胞、補体系、及び体液性免疫の他の成分を含む、先天性および適応性の成分から構成されている。多くの細菌は、多層宿主免疫応答による殺傷およびクリアランスを受けやすいが、いくつかの病原性および日和見細菌は、種々の宿主細胞に感染し、宿主免疫応答¹によるクリアランスを破壊するメカニズムを進化させてきた。 淋菌は、細菌病原体の一例であるそれは非常に、そのヒト宿主に固執するようになっている。N。淋菌は、容易に尿生殖路、咽頭、結膜、および直腸の粘膜上皮細胞の管の表面にコロニーを形成。植民地化は、粘膜部位に好中球の豊富な採用をトリガします。好中球は、微生物を殺す抗菌様々なプロセスを持っている専門的な食細胞であるが、N。淋菌は、好中球^2-5の存在下で生存することが可能である。このようなNとしてどのように細菌性病原体の理解淋菌覆す、抑制し、最終的には、通常敵対ホスト環境で生き残るために免疫応答をハイジャックは、感染症と闘うための新たな治療法の開発に不可欠である。

多くの場合、宿主細胞内での細菌の生存を調査するために使用される実験プロトコルは、コロニーカウントアッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、電子顕微鏡法が挙げられる。コロニー数のアッセイでは、感染した細胞の集団は、WHの洗剤で、例えば（溶解されているICH細菌は細菌を遊離させるために）抵抗性である。溶解物を希釈し、寒天ベースの培地上にプレートし、溶解物中のコロニー形成単位を、各時点および/または実験条件について列挙されている。このアプローチは、全体の細菌集団の生存を報告したが、細胞内と細胞外の生存を区別することはできない。コロニーカウントアッセイの変形、ゲンタマイシン保護アッセイは、具体的には真核生物の原形質膜^6を通過する抗生物質ゲンタマイシンできないことに基づいて、細胞内の細菌の生存率を測定する。しかし、このアッセイは、ゲンタマイシン（または同様に、真核生物膜非透過性である別の抗生物質）と内部の細菌へのアクセス権を持っている抗生物質のことができないことによって殺傷に対して感受性である細菌に依存している。したがって、ゲンタマイシン保護アッセイは、すべての細菌種の検査のために有効であるか否よい高度における細菌の生存率を調べると好中球などのピノサイトーシス細胞。 （細菌が凝集体又は異なって、個々の細菌細胞から振る舞う微小コロニーを形成している場合など ）これらのアプローチのいずれも、細胞内局在や個々の細菌の他の動作を明らかにする。個々の外部および内部の細菌の生存率を調べるための別のアプローチは、頻繁に使用される薄切片を透過型電子顕微鏡（TEM）である。それはさらに、亜細胞マーカーに対する金結合抗体を用いて免疫電子顕微鏡によって調査することができる宿主細胞（ 例えばファゴソーム、細胞質、オートファゴソーム）、細菌の位置に関する情報を提供することができるという点で、このアプローチは有利で ​​ある。しかし、電子顕微鏡では、細菌の生存能力を評価することを特に区別されません。埋め込まれた切片は、酢酸ウラニル、クエン酸鉛、または他の電子密度試薬で染色し、電子顕微鏡によって画像化されると、電子密度の高い細菌が生存可能であり、電気考えられているTRONルーセント生育不能^7,8。しかし、この仮定はひどく混乱膜や細胞質を欠いたとだけ死菌ので、電子·ルーセントが表示され、細菌の生存能力を過大評価。さらに、いくつかの細菌種は、それが困難な生存率を決定すること、それらの成長段階に応じて、電子密度の範囲を表示することができる。

代替として、またはこれらの広く使用されている方法に加えて、ここでは、宿主細胞によって内在化に取り付けられた細菌の生存を評価するための細菌の生存率を示す蛍光染料の使用のためのプロトコルおよび理論的根拠を提供する。細胞外の細菌を同定するために、感染細胞を、最初のそのようなレクチンまたは細菌特異的抗体などの蛍光試薬にさらされる。感染した細胞は、その後、透過処理し、細菌の生存のための代理として、劣化した膜対そのままで細菌に差動的にアクセス可能なDNA特異的染料にさらされている。最初のP INヨウ化プロピジウムは、膜を侵害しているため、生育不能と考えられているものの細菌のみがアクセスされている間rotocol、膜透過性色素SYTO9は、全細菌集団を同定する。ヨウ化とSYTO9は、バイオフィルム中の細菌の生存能力を評価する非病原性細菌から病原性差別、そして実行可能な水性菌^9月12日を列挙するために使用されている。 SYTOXグリーン生育不能人口のみがアクセスされているときに2番目のプロトコルでは、4 '、6'-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）は、総菌数を識別します。これらの生存度色素対は、細菌の細胞内局在を定義する、例えば、目的のタンパク質に関連して各細菌の位置を決定するために、免疫蛍光法と組み合わせることができる。これらのアッセイの使用は、宿主細胞の感染時に細菌殺傷または生存につながる相互作用に重要な洞察を提供します。この資料に記載されているプロトコルは、生存率を評価した好中球ファゴソーム^5,13,14の異なる集団に含めた初代ヒト好中球、および内部で接続されている淋菌 。しかしながら、これらのプロトコルは、プロ食細胞、非専門食細胞、および原生動物で^15-24グラム陽性およびグラム陰性細菌の生存率を評価するために適用することができる。

Protocol

1。ヨウ化プロピジウムとSYTO9と細菌の生存率を評価する

1. 目的の細菌で24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。
2. 一旦穏やかで細胞をすすぎ、0.1M 3 - （N-モルホリノ）、1mMのMgCl _2（MOPS /のMgCl _2）を含有するプロパンスルホン酸（MOPS）、pH7.2で、。
3. 外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl ₂に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンを用いて室温で暗所で10分間、細胞をインキュベートする。

NOTE：行動、関心のあるレクチンまたは抗体に関係なく生存率（ 図1）の全ての細菌に特異的に結合することを示すために、宿主細胞の非存在下で、生および死細菌を制御する。

4. MOPS / MgCl _2を用いて細胞を2回すすいでください。
5. 吸引物M細胞からEDIAと0.5ミリリットル生/死染色溶液を加える。生/死染色溶液は、MOPS / _塩化マグネシウムが5μmのSYTO9、30μMのヨウ化プロピジウム、0.1％サポニン（最終濃度）である_。
6. 暗所で室温で15分間、細胞をインキュベートする。
7. MOPS / _塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください_。
8. 反転したカバーは、スライドガラス上に裏向きと明確なマニキュアで密封する。封入剤は使用しないでください。
9. 緑、赤、遠赤の画像取得と互換性のフィルターセットで蛍光顕微鏡を用いて、30分以内に画像を取得する。

注：従来の蛍光顕微鏡法および共焦点レーザー走査顕微鏡法の両方を使用することができる。 30分後、蛍光色素は、細菌から漏れ始めておらず、取得したデータはもはや正確である。この記事に示されている画像は、のOpenLABソフトウェアを使用して、浜松オルカ-ERデジタルカメラニコンエクリプスE800直立蛍光顕微鏡で得た。 650 nmおよび663の発光フィルター - - アレクサフルーア647の蛍光は、590の励起波長を有するフィルターを用いて検出した735 nmであり、偽色の青である。 580と600nmの発光フィルター - - 660 nmのヨウ化プロピジウムの蛍光を、540の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555 nmのSYTO9からの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。

10. このプロトコルは、外部生育不能細菌が赤+青表示され、内部の生育不能細菌は、外部生菌が緑+青表示され、内部の生菌のみを緑色にのみ赤く表示された画像になります。目で、外部の生育不能生育不能内部、実行可能な外部、および内部生存している細菌の数を数える。
11. 外部の細菌の総数（外部によって生菌数で割ることによって、外部生菌の割合を計算する実行可能なプラスnonviでき）。内部の細菌の総数（実行可能なプラス生育不能）（ 図4）により、内部生菌数を割ることによって、内部生菌の割合を計算します。
12. このプロトコルで実行するには、2つの本質的なコントロールがあります。まず、すべての生育不能細菌はヨウ化陽性であり、すべての生菌がSYTO9陽性であることを検証します。 （任意の宿主細胞の非存在下）の細菌の中間対数文化が> 95％のSYTO9陽性である必要があります。 N.の中間対数培養物は、 図2にも示されている淋菌 （ミリリットル当たりの単位を形成する10 ⁸コロニーでの）生/死染色溶液と共にインキュベートした。第二に、ヨウ化プロピジウムとSYTO9両方が透過処理、感染した宿主細胞に入ることができることを検証します。
    1. 死んだ細菌の集団を生成するために、1.5mlマイクロ遠心チューブ内のユニットを形成し、2×10 ⁸個の細菌コロニーを採取し、70％のイソプロパノールを添加し、10分間放置。マイクロフュージA中の細菌をペレットND残留イソプロパノールを除去するためにPBSで2回細菌を洗い流す。 1.7 - その後、プロトコルは1.5ステップに従ってください。ガラススライドに細菌懸濁液の5μLを加え、カバーガラスでオーバーレイ。プロトコルステップ1.9のように、画像サンプル。これらの条件下では、人口の100％がヨウ化陽性（ 図2）である必要があります。いくつかの細菌種では、ヨウ化プロピジウムは完全SYTO9染色を圧倒できず、生育不能細菌は黄色やオレンジ色表示されることがあります。
    2. 好中球のような食細胞の場合は、イソプロパノール-死菌に細胞を公開し、細胞内細菌の100％がヨウ化陽性（ 図3）であることを確認してください。死菌を内在化しないことができる非食細胞のためには、アジ化ナトリウム又は生/死染色溶液を添加する前に、他の細胞浸透性抗菌剤を用いて感染細胞を治療するのに十分であり得る。

2。 SYTOXグリーと評価する細菌生存率NおよびDAPI

1. ラベル暗所で室温で20分間、モースの限定培地²⁵中10μg/ mlのDAPIで目的の細菌。
2. DAPIで標識した細菌と24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。
3. MOPS / MgCl _2をで細胞を1回すすいでください_。
4. 外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl ₂に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンで暗所で室温で10分間、細胞をインキュベートする。提案しコントロールするためのプロトコルのステップ1.3の注を参照してください。
5. 細胞から培地を吸引し、MOPS / _塩化マグネシウムで0.5ミリリットル0.4μMSYTOXグリーンを追加します。
6. 暗所で室温で5分間、細胞をインキュベートする。
7. MOPS / _塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。
8. 5分間のMOPS / _塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。

注：アレクサフルーア647からの蛍光は590の励起波長のフィルターを用いて検出した - 650 nmおよび663の発光フィルター - 735 nmであり、偽色の赤です。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555nmのSYTOXグリーンからの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 375と400nmのバリアフィルター - DAPIからの蛍光は、355の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。

10. このプロトコルは、外部生育不能細菌が緑+赤表示され、内部の生育不能細菌は青+緑に表示され、外部の生菌は青+赤で表示され、内部の生菌のみ（ 図4）青く見える画像になります。プロトコルセントで説明したように外部と内部の細菌の割合を定量化P 1.11。
11. プロトコールステップ1.12に記載されたコントロールは、DAPI / SYTOX Green色素の組み合わせ（ 図2および図3）を用いて実施されるべきである。

3。細胞内局在と並んで細菌の生存率を評価する

1. ラベル暗所で室温で20分間、モースの定義された培地中で10μg/ mlのDAPIで目的の細菌。
2. DAPIで標識した細菌と24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。
3. MOPS / MgCl _2をで細胞を1回すすいでください_。
4. 外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl ₂に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンで暗所で室温で10分間インキュベートする。提案しコントロールするためのプロトコルのステップ1.3の注を参照してください。
5. 細胞から培地を吸引し、細胞を2 TIをすすぐMOPS / _塩化マグネシウム中で_MES。
6. MOPS / MgCl _2を0.2％サポニンを含有する、20分間の関心の細胞内マーカーに対するアレクサフルーア555結合抗体で細胞を培養する。
7. MOPS / _塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。
8. 5分間のMOPS / _塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。
9. 細胞から培地を吸引し、MOPS / _塩化マグネシウムで0.4μMSYTOXグリーンを追加します。
10. 暗所で室温で細胞を5分間インキュベート。
11. MOPS / _塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。
12. 5分間のMOPS / _塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。
13. 蛍光顕微鏡での30分以内に、スライドの画像を取得する。顕微鏡、デジタルカメラ、および取得ソフトウェアの説明については、プロトコルのステップ1.9を参照してください。

注：アレクサフルーア647からの蛍光は590の励起波長のフィルターを用いて検出した - 650 nmおよび663の発光フィルター - 735 nmであり、偽色の紫色である。蛍光fは580と600nmの発光フィルター - - 660 nmのロムアレクサフルーア555が540の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555nmのSYTOXグリーンからの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 375と400nmのバリアフィルター - DAPIからの蛍光は、355の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。

14. このプロトコルは、外部生育不能細菌が緑+紫に見える画像になり、内部の生育不能細菌は青+緑に表示され、外部の生菌は青+紫に見える、内部生菌は青表示され、細胞内のタンパク質（ 図4）、赤が表示されます。プロトコールに記載されているように外部と内部の生菌perecentを定量化することは1.11を繰り返します。
15. プロトコールステップ1.12に記載されたコントロールは、DAPI / SYTOX Green色素の組み合わせ（ 図2および図3）を用いて実施されるべきである。
16. で生存可能で、生育不能細菌をカウントすることに加え、目的の細胞内マーカーと共局在するため、正または負のいずれかとし、各細菌を分類する。
17. 生菌数の合計で共局在生菌数で割ることによって細胞内のマーカーと共局在生菌の割合を計算する。生育不能細菌の総数で生育不能共局在した細菌の数を割ることによって細胞内のマーカーと共局在生育不能細菌の割合を計算します。

Representative Results

概説したプロトコルは、N.の生存を調べた初代ヒト好中球^5,26にさらされた後淋菌 。好中球は、感染させたN.淋菌および緑色蛍光生存色素SYTO9及び赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（ 図4A）を使用して、プロトコル1で処理した。染料は、優先的に、宿主細胞原形質膜を透過性にするために、コレステロールを隔離サポニンの存在下ではなく、N.添加した淋菌の膜。関心対象の細菌の膜は、コレステロールを多量に含有する場合に他の界面活性剤を試験する必要があるかもしれない。すべてのN. SYTO9と淋菌の染みが、妥協膜を有する唯一の細菌はヨウ化プロピジウムで染色する。ヨウ化プロピジウムはSYTO9蛍光を克服し、その生菌は緑と死菌は²⁷赤く表示され表示されます。いくつかの細菌種では、ヨウ化プロピジウムは完全SYTO9 staininを克服しない場合がありますGは、死菌で得られた黄色やオレンジ登場。 SYTO 9のヨウ化プロピジウムの比が異なる細菌種のために最適化される必要があり得る。細胞を透過処理する前とSYTO9及びヨウ化プロピジウムを添加し、アレクサフルーア647結合大豆レクチンは、細胞外N.を検出するために、感染した細胞に添加した淋菌、遠赤の蛍光シグナルは、偽色の青だった。このように、このプロトコルで外部生菌ターコイズ（青+緑）を表示され、外部の生育不能マゼンタ（青+赤）が表示されます。内部生菌は緑のみ（矢印）が表示され、内部生育不能細菌は赤のみ（矢印）が表示されます。これは、感染細胞内で、真核細胞核がSYTO9及びヨウ化プロピジウム（ "N"、 図4A）によって染色されることに留意することが重要である。外部の実行可能な、外部の生育不能、内部の実行可能な、内部生育不能細菌が内部化細菌Aの割合を得るために蛍光画像から定量化した宿主細胞の内側と外側NDパーセント生菌。

図4Bは、Nの代表画像です生存性色素SYTOXグリーンおよびDAPIを使用して、プロトコル2で処理淋菌感染好中。このプロトコルは、蛍光顕微鏡の両方赤紫外チャネルで蛍光を発するヨウ化プロピジウムの使用を回避する。すべてのN.淋菌 DAPI（青）で染色するが、妥協膜を有する唯一の細菌はSYTOXグリーンで染色。細胞を透過処理する前に、上述したように、アレクサフルーア647結合大豆レクチンは、細胞外N.を検出するために、感染した細胞に添加したその蛍光この場合、偽色の赤である淋菌 、。したがって、外部生菌が現れマゼンタ（赤+青）と外部の生育不能細菌は（緑/青+赤）黄色に見える。内部生菌は青のみ（矢印）が表示され、内部生育不能細菌は（矢頭）青/緑に表示されます。デSYTOXグリーン蛍光対DAPIの相対的な強さに、保留中、生育不能細菌はターコイズを表示されることがあります。ヨウ化プロピジウムとSYTO9で処理した細胞と同様に、好中球の核が（ "N"で示す）、図4（b）のSYTOXグリーン及びDAPIで染色される。 SYTOXグリーンおよびDAPIに感染した細胞の曝露は、ヨウ化プロピジウムおよびSYTO9について上述したように定量化し、宿主細胞内での細菌のパーセントの内在化および生存率を明らかにする。 Nからの結果SYTOXグリーンおよびDAPIを用いて処理淋菌感染した好中球は、ヨウ化プロピジウムおよびSYTO9 ²⁶で得られたものに匹敵する。

図4Cに示すように、プロトコル3は、細菌の生存性色素は、プライマリまたはアズール好中球顆粒蛋白CD63のための免疫蛍光と組み合わせされた、プロトコル2を最適化したものです。この実験は、iがファゴソーム区画の組成物を定義するために行った。実行可能な、または非生存Nが入っていnside好中球淋菌 ^26。このプロトコルは、生菌、生育不能細菌、細胞外細菌、および細胞内のマーカーを検出するために、4色の蛍光機能のための顕微鏡を必要とします。生存色素はアルデヒド固定（我々の未発表の観察）との互換性がないので、細胞内抗原を検出するのに必要な時間を最小限にするためにフルオロフォアに直接に結合された抗体を用いて、固定することなく、免疫蛍光を行った。この抗体は、赤色蛍光団アレクサフルーア555に結合されている。プロトコル2の場合と同様に、生存および非生存細菌はそれぞれ、DAPIおよびSYTOXグリーンを使用して区別された、外部の細菌がアレクサ647結合大豆レクチンを用いて染色した。外部の細菌は、遠赤色蛍光を発すると偽色の紫色である。外部生菌がブルー+紫と外部生育不能細菌は青/緑+紫表示され表示されます。内部生菌は青（矢印）とインター現れるNAL生育不能細菌は緑色（矢じり）を表示されます。 CD63陽性の顆粒とファゴソームが赤く表示されます。好中球の核はDNA特異的色素（ "N"）で染色する。これらの画像を分析する際に、個々の細菌は、内部生育不能対実行可能な、およびCD63染色のリングのための正または負の対外部と分類された。N.淋菌は、細菌を取り巻くCD63蛍光のリングの≥50％が存在する場合、好中球のCD63陽性ファゴソームに存在すると考えられ、したCD63陰性ファゴソーム中の細菌を取り巻くCD63蛍光のリングの<50％が存在する場合に。 図4（c）に矢印で示された非生存細胞内細菌は、細菌を取り巻くCD63の染色のリングを持っています。このリングは、一次顆粒は、このファゴソームで濃縮されていることを示します。矢印で示した実行可能な細胞内細菌は、一次顆粒はそのファゴソームで濃縮されていないことを示す、CD63の染色を欠いている。我々N.の生存率との相関関係を示すためにこの技術を使用し淋菌および一次顆粒陰性ファゴソーム²⁶内の滞留。このアッセイは、目的のタンパク質を用いて生存率および細菌の両方の局在を追跡するため、生育不能と生菌は、同一または異なる場所に存在するかどうかを決定することができる。この情報は、宿主細胞内で細菌の生存に貢献するメカニズムに重要な最初の洞察を提供します。

図1。生存可能で、生育不能Nのミックス淋菌は 、宿主細胞の非存在下で、プロトコール1に記載のAlexaフルーア647結合大豆レクチン、ヨウ化プロピジウム、及びSYTO9に曝露した。全ての細菌がレクチンにアクセス可能であり、青色蛍光を発する。生育不能細菌は青+赤と生育不能細菌は青く見える現れる+グリーン。

図2。 （A-B）中期対数期N.淋菌は、細菌を死滅させる（A）又はなし（B）のイソプロパノール治療と、プロトコル1と同様にヨウ化プロピジウム及びSYTO9に暴露した。非生存細菌は、ヨウ化プロピジウムにアクセスでき、赤く見える。生菌はSYTO9で染色し、緑色に表示されている。 （CD）中期対数期N.淋菌は、（C）、または細菌を死滅させる（D）のイソプロパノール処理をせずに、プロトコル2のようにDAPI及びSYTOXグリーンに暴露した。生育不能細菌は、DAPIとSYTOXグリーンにアクセス可能と緑+青表示されます。生菌のみをDAPIで染色し、青色のみ表示されている。

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図3。 （A）は好中球はイソプロパノール-殺さNを結合して、内面化させた淋菌は 、プロトコル1に従ってヨウ化プロピジウムとSYTO9にさらさ。生育不能細菌は、ヨウ化プロピジウムで染色し、赤く表示されている。すべての細菌が生育不能であるため、何SYTO9正、緑の細菌が検出されない。 （B）は好中球はイソプロパノール-殺さNを結合して、内面化させた淋菌は 、プロトコル2に従ってDAPIとSYTOXグリーンにさらさ。生育不能細菌は、DAPIとSYTOXグリーンで染色し、緑+青表示されている。すべての細菌が生育不能であるため、唯一の何DAPIは、青のみ細菌は検出されなかった。 Nは、好中球の核にラベルを付けます。スケールバー=5μmである。矢印は生育不能細菌のいくつかを示している。

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図4。 （A）N.淋菌感染したヒト好中球のAlexaフルーア647結合大豆レクチン（青偽色）に暴露した後、実行可能性の存在下で、サポニンで透過性は死菌にラベルを付けるには、ヨウ化プロピジウム（赤）染料、SYTO9（緑）、生きた細菌を対比染色する。外部生育不能細菌は赤+青表示され、内部の生育不能細菌は赤のみ表示され、外部の生菌は緑+青表示され、内部の生菌は緑色にのみ表示されます。 （B）N.淋菌は、その後、好中球に提示する、DAPI（青色）で標識した。感染した細胞を、次いで死菌を標識するSYTOXグリーン（緑）の存在下で、サポニンで透過性のAlexaフルーア647結合大豆レクチン（偽色の赤）に曝露した。外部生育不能細菌が緑+赤表示され、内部の生育不能細菌は青+緑に表示され、外部の実行可能なBACテリアは青+赤で表示され、内部生菌はブルーのみ表示されます。 （C）N.淋菌感染好中球は、CD63（赤）が透過処理時に添加した好中球の一次顆粒タンパク質に対するアレクサフルーア555結合抗体を除いて、Bと同様に処理した。アレクサフルーア647-大豆レクチン染色は、偽色の紫色だった。外部生育不能細菌は緑+紫、内部生育不能細菌は外部生菌は青+紫に見えるだけ緑色に表示され、内部の生菌は青表示され、CD63染色が赤く表示されます。挿入図は、白い四角で示される画像の面積のCD63の蛍光を示す。 交流では、Nは、好中球の核にラベルを付けます。スケールバー=5μmである。矢印は生育不能細菌や矢印は生菌を示す示している。

Discussion

DNAがヒト細胞にし、内部に取り付け生死菌を特定するための蛍光レクチンと一緒に結合し、実行可能性染料使用する2つのプロトコルがここに提示した。両方のプロトコルが有効に死菌からライブを区別するので、使用するプロトコルの選択は、実験の目的に依存します。第一のプロトコルはそのまま細菌を検出するために、生育不能細菌やSYTO9を検出するために、ヨウ化プロピジウムを使用しています。 図4Aに示されるプロトコル1の代表画像がNに感染したヒト好中球に適用される淋菌 。これらの色素は、細胞外Nを認識するために、レクチン、ダイズ凝集素と一緒にした淋菌が、結合された蛍光菌特異的抗体は、代替として使用することができる。ヨウ化プロピジウムによるSYTO9の除外は生育不能細菌が赤と生菌は緑の蛍光を発する蛍光を発しますので、プロトコル1は、容易に、個々の細菌の生存を明らかにしている。 HoweveR、このプロトコルは、従来の蛍光顕微鏡で使用可能な4チャンネルの2中のヨウ化プロピジウムの蛍光に、宿主タンパク質のための免疫蛍光と組み合わせることはできません。したがって、プロトコル2は、全細菌集団を検出するために、非生存細菌およびDAPIを識別するためにSYTOXグリーンが使用され、開発された。 Nの例淋菌では、およびヒト好中球の内側に関連し、SYTOXグリーンおよびDAPIを用いて処理し、図4Bに示されており、免疫蛍光と組み合わせた例が、 図4Cに示されている。二つの追加の蛍光チャネルの利用の他に、このプロトコルは、赤 - 緑色盲を有する個人による使用のために有利である。しかし、非生存細菌はDAPIおよびSYTOXグリーン染色の相対強度と画像取得パラメータに依存して、緑色または青緑色の蛍光を発することができる。 DAPIの使用に対する1つの欠点は、N.から漏れ得ることである淋菌感染の過程で、これは黄色ブドウ球菌 （私たちの未発表の観察）のような他の細菌のための問題ではないかもしれない。この問題に対抗するために、感染細胞を感染後SYTOXグリーンと共にDAPIで標識したが、核のDAPI染色の強度は、N.の蛍光を圧倒した淋菌 （私たちの未発表の観察）。これら二つのプロトコルに加えて、他の市販の染料は、細菌の生存性を明らかにするために使用することができる。例えば、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）は、全細菌集団にラベルでき、SYTOXオレンジやブルーが生育不能細菌を識別することができる。これらの手順の相対的な有効性は、細菌感染した細胞型によって変化するので、研究者は、感染系において異なる生存率染料の組み合わせを比較することが重要である。

現在、我々は手動で、PERを定量化するために、これらのプロトコルを用いて得られた各画像をチェックセントの内在化、細胞内および細胞外％の生存率、および細胞内のマーカーと共局在。自動化されたコンピュータベースの方法は、理論的にはこれらのパラメータを定量化するために使用することができるが、それらは、生存色素と細胞核の強い蛍光シグナルを有する細菌の任意の不均一な染色によって複雑化されてもよい。また、細胞内マーカーと共局在化細菌の定義は、細菌、細胞型、および目的のマーカーのために最適化される必要があり得る。

これらのプロトコルのいずれかの制限は、ヨウ化プロピジウムまたはSYTOXグリーンへの浸透性が細菌の死の真の尺度であるという仮定である。ヨウ化プロピジウムおよびSYTOXグリーンの分子量は、それぞれ、668.4 Daから600 Daである。これらの色素は膜非透過性であると考えられ、細菌が未修復膜の損傷がない限り、細菌の細胞質にアクセスするべきではありません。しかし、可能性は細菌が停滞状態に入ることに変わりはないあるいはそれらの膜の損傷を修復し、後の時間で成長を続けています。第2の制限は、プロトコルは、個々の細菌の生存率は経時的に追跡することができないことである。ライフテクノロジーズは、細菌は、彼らがマウントし、蛍光顕微鏡で画像化され、より長い生存力を失うことになるので、ヨウ化プロピジウムとSYTO9と細菌の生存能力の評価は、染料にさらされた後30分以内に測定することを推奨しています。 DAPI / SYTOXグリーン染料の組み合わせで標識された感染した細胞も、（私たちの未発表の観察）を実装した後、急速に画像化されている必要があります。第三に、プロトコルは、一般的に使用される固定技術と互換性がありません。メタノール、アセトン固定は透過性および宿主細胞に関連する細菌を殺す、とアルデヒド系固定液はNを透過しますヨウ化プロピジウムとSYTOXグリーン（未発表の観察）へのヒト好中球内部の淋菌 。このため、これらのプロトコルを使用することで、蛍光MICRへの即時アクセスを必要とするOSCOPEと1日でのプロトコルを完了させる能力。最後に、これらのプロトコルで使用される染料の各々は、二本鎖核酸に結合し、宿主核DNAならびに細菌DNA（ 図1）に結合する。核DNAの蛍光は、細菌DNAの蛍光よりも著しく明るいので、真核生物の核に近接している細菌の生存を評価することができない。 DAPIの助けを借りて、共焦点レーザー走査顕微鏡と前標識細菌は、核蛍光シグナルを減らす。非DNA結合細菌の生存染料が開発されるまで、核DNAの蛍光は、これらのプロトコルの複雑化のままになります。

これらの制限にもかかわらず、この資料に記載されているプロトコルは、真核細胞に、内部に付着した個々の細菌の生存率を評価するための高感度な方法を提供します。コロニー数またはゲンタマイシン保護アッセイは、微生物病因研究のバックボーンとなっている。しかしながら、それらはプロブ潜在的に不均一な集団間での細菌の生存性の評価をIDE。対照的に、ここで説明する生存色素プロトコルは、個々の細菌の完全性を検査することを可能にする。そのため、研究者らは、細胞外対細胞内細菌、異なるファゴソームの種類の細菌、または細胞質対ファゴソーム中の細菌の運命に関するデータを収集することができます。薄切片を透過型電子顕微鏡法は、多くの場合、個々の細菌の生存を調べるために使用されてきた。 TEMによるもはや電子求ルーセントまたは無傷表示されない細菌が明らかに生育不能であるが、それは彼らの細胞質中にいくつかの電子密度を保持細菌が実際に無傷であるかどうかを評価することはより困難である。多くの低倍率視野であっても、画像取得のために得られ、短時間で、蛍光ベースの生存度色素に曝露された細胞から取得することができるがさらに、それは、分析するのに十分な顕微鏡写真を取得するために電子顕微鏡時間の多くの時間を取ることができる。しばらくproviDEDプロトコルはNで最適化した淋菌および一次ヒト好中球は、それらが全て、食作用および非食真核細胞^5,15-24,26を含む様々な細胞型におけるグラム陰性およびグラム陽性細菌の多くの種の生存率を評価するために適合させることができる。細菌の生存度色素は、真核細胞における細菌性病因の機構および細菌感染を制御するために、真核細胞の能力を調べるための強力な実験的なツールを提供する。将来的には、これらのプロトコルは、アルデヒド固定および原核生物に固有と互換性のある細菌の生存性色素の開発に伴って、さらに便利自動画像取得および処理するための優れたツールとなりそうです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377