Summary
Centralt i området för bakteriell patogenes är möjligheten att fastställa om och hur mikrober överleva efter exponering för eukaryota celler. Den här artikeln beskriver protokoll för användning av fluorescerande färger som avslöjar lönsamheten för enskilda bakterier inom och i samband med värdceller.
Abstract
Centralt i området för bakteriell patogenes är möjligheten att fastställa om och hur mikrober överleva efter exponering för eukaryota celler. Nuvarande protokoll för att hantera dessa frågor är mikroorganismer analyser, gentamicin skydd analyser och elektronmikroskopi. Mikroorganismer och gentamicin skydd analyser bara bedöma lönsamheten av hela bakteriepopulationen och inte kan bestämma enskilda bakterie livskraft. Elektronmikroskopi kan användas för att bestämma viabiliteten av enskilda bakterier och tillhandahålla information beträffande deras lokalisering i värdceller. Men bakterier visar ofta en rad av elektrontäthet, vilket gör bedömningen av lönsamheten svårt. Den här artikeln beskriver protokoll för användning av fluorescerande färger som avslöjar lönsamheten för enskilda bakterier inom och i samband med värdceller. Dessa analyser utvecklades ursprungligen för att utvärdera överlevnaden av Neisseria gonorrhoeae i primära humana neutrofiler, men bör vara enpplicable till varje interaktion bakterie-värdcell. Dessa protokoll kombinerar membrangenomträng fluorescerande färgämnen (SYTO9 och 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), som färgar alla bakterier, med membrantäta fluorescerande färgämnen (propidiumjodid och Sytox gröna), som endast är tillgänglig för icke-livsdugliga bakterier. Före eukaryot cell permeabilization, är en antikropp eller ett fluorescerande reagens för att identifiera extracellulära bakterier. Således dessa analyser diskriminera livskraft bakterier anhängare till och inuti eukaryota celler. Ett protokoll är också anordnad för att använda dess viabilitet färgämnen i kombination med fluorescerande antikroppar mot eukaryota cellmarkörer, för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av individuella bakterier. De bakteriella viabilitet färgämnen diskuteras i denna artikel är en känslig komplement och / eller alternativ till traditionella mikrobiologiska tekniker för att utvärdera lönsamheten för enskilda bakterier och ge information om var bakterier överleva i värdcellener.
Introduction
Det finns en dynamisk interaktion och co-evolution mellan bakterier och värdar där de är bosatta. Bakterier har utvecklats vidhäftningsorganeller, sekretionssystem, och / eller förmågan att producera gifter som gör att deras produktiva infektion av värd fagocytiska och icke-fagocyterande celler. Bakterierna måste även brottas med erkännande och antimikrobiella aktiviteter värdens immunsystem. Värdimmunsystem består av medfödda och adaptiva komponenter inklusive fysiska och kemiska barriärer, immunceller, komplementsystemet, och andra komponenter i humoral immunitet. Medan många bakterier är känsliga för dödande och godkännande från den flerskiktade värd immunsvar, har vissa patogena och opportunistiska bakterier utvecklat mekanismer för att infektera en mängd olika värdceller och undergräva godkännande av värdimmunsvar 1. Neisseria gonorrhoeae är ett exempel på en bakteriell patogen som är starkt anpassad till framhärdar i sin mänskliga värden. N. gonorrhoeae koloniserar lätt de luminala ytorna hos mukosala epitelceller i den urogenitala kanalen, svalget, bindhinnan, och rektum. Colonization utlöser den rikliga rekrytering av neutrofiler vid slemhinnor. Neutrofiler är professionella fagocyter som besitter en rad olika antimikrobiella processer för att döda mikroorganismer, men N. gonorrhoeae har förmåga att överleva i närvaro av neutrofiler 2-5. Att förstå hur bakteriella patogener som N. gonorrhoeae omstörta, undertrycka, och kapa immunsvaret att slutligen överleva i normalt fientliga värdmiljöer är avgörande för utvecklingen av nya terapier för att bekämpa smittsamma sjukdomar.
Experimentella protokoll som ofta används för att undersöka bakteriell överlevnad i värdceller omfattar mikroorganismer analyser, gentamicin skydd analyser och elektronmikroskopi. I mikroorganismer analyser, är en population av infekterade celler lyseras (till exempel med ett rengöringsmedel för WHich bakterierna är resistenta) att befria bakterierna. Lysaten späddes och ströks ut på agar-baserade medier, och kolonibildande enheter i lysaten uppräknas för varje tidpunkt och / eller försöksbetingelse. Detta tillvägagångssätt rapporterar livskraft hela bakteriepopulationen, men är inte i stånd att skilja mellan intracellulära och extracellulära överlevnad. En variant på mikroorganismer analysen, gentamicin skydd analysen mäter specifikt intracellulär bakterie överlevnad, baserat på oförmågan hos de antibiotika gentamicin att korsa den eukaryota plasmamembranet 6. Emellertid är denna analys beroende på bakterierna är känsliga för avdödning genom gentamicin (eller ett annat antibiotikum som är på liknande sätt eukaryot membran impermeant) och oförmågan av antibiotikumet att få tillträde till interna bakterier. Därför kan en gentamicin skydd analys inte vara effektiv för granskning av alla bakteriearter eller vid prövningen av bakteriell överlevnad i hög gradpinocytic celler, såsom neutrofiler. Ingen av dessa metoder avslöjar subcellulära lokalisering eller annat beteende av enskilda bakterier (t.ex. om bakterierna bildar aggregat eller mikrokolonier som beter sig annorlunda än enskilda bakterieceller). En annan ofta använd metod för att undersöka genomförbarheten av de enskilda interna och externa bakterier är tunn sektion transmissionselektronmikroskop (TEM). Denna metod är fördelaktig genom att den kan ge information om var bakterierna i värdceller (t.ex. phagosome, cytoplasman, autophagosome), som kan undersökas vidare genom immunelektronmikroskopi mikroskopi med guldkopplade antikroppar mot subcellulära markörer. Dock är elektronmikroskopi inte särskilt känslig på att bedöma bakterie livskraft. När inbäddade sektioner färgades med uranylacetat, bly citrat, eller andra elektrontäta reagens och avbildas genom elektronmikroskopi, är elektrontäta bakterier anses livskraftig och elekTRON-Lucent nonviable 7,8. Dock överskattar detta antagande bakteriell bärkraft, eftersom endast de döda bakterier med allvarligt störda membran och saknar cytoplasman visas elektron-Lucent. Dessutom kan vissa bakteriearter visa ett urval av elektrontäthet beroende på stadium av tillväxt, vilket gör det svårt att avgöra lönsamheten.
Som ett alternativ eller komplement till dessa allmänt använda metoder, här ger vi protokoll och logisk grund för användningen av fluorescerande färger som indikerar bakteriell livskraft för att bedöma överlevnaden av bakterier knutna till och internaliserade av värdceller. För att identifiera extracellulära bakterier, infekterade cellerna först exponeras för ett fluorescerande reagens, såsom en lektin eller bakterier-specifika antikroppen. De infekterade cellerna därefter permeabiliseras och utsätts för DNA-specifika färgämnen som är differentiellt tillgängliga för bakterierna med intakt vs nedbrutna membraner, som ett surrogat för bakteriell livsduglighet. I det första protocol, identifierar membranet genomsläppliga färgämnet SYTO9 den totala bakteriepopulationen, medan propidiumjodid är endast tillgänglig för de bakterier som har komprometterade membran och därmed anses icke-livsdugliga. Propidiumjodid och SYTO9 har använts för att utvärdera bakteriell viabilitet i biofilmer, diskriminera patogen från icke-patogena bakterier, och räkna livskraftiga vattenburna bakterier 9-12. I det andra protokollet, 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI) identifierar totala bakterier, medan Sytox Green är endast tillgänglig för icke-livsdugliga befolkningen. Dessa viabilitet färgämnesparen kan kombineras med immunofluorescens för att bestämma varje bakterie läge i förhållande till ett protein av intresse, till exempel för att definiera bakterie subcellulär lokalisering. Användningen av dessa analyser ger viktig inblick i de interaktioner som resulterar i bakteriedödande eller överlevnad under infektion av värdceller. De protokoll som beskrivs i denna artikel användes för att bedöma lönsamheten förN. gonorrhoeae som är fäst vid och inuti primära humana neutrofiler, även i olika populationer av neutrofila fagosomer 5,13,14. Dock kan dessa protokoll användas för att bedöma lönsamheten av grampositiva och gramnegativa bakterier i professionella fagocyter, icke-professionella fagocyter och protozoer 15-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bedöma Bakteriell livskraft med propidiumjodid och SYTO9
- Infektera celler som är vidhäftande till 12 mm diameter cirkulära täckglas av glas i 24-brunnars plattor med bakterier av intresse. INTE fixera cellerna med aldehyder eller organiska lösningsmedel.
- Skölj cellerna en gång försiktigt i 0,1 M 3 - (N-morfolino) propansulfonsyra (MOPS), pH 7,2, innehållande 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl2).
- Inkubera cellerna under 10 minuter i mörker vid rumstemperatur med Alexa Fluor 647-kopplad antikropp eller ett lektin som binder till de bakteriearter av intresse, i MOPS / MgCl2, att detektera yttre bakterier.
OBS: Conduct kontrollerar med levande och döda bakterier, i frånvaro av värdceller, för att visa att den lektin eller antikropp av intresse binder alla bakterier oavsett lönsamhet (Figur 1).
- Skölj cellerna två gånger med MOPS / MgCl2.
- Aspirera media från celler och tillsätt 0,5 ml Live / Dead färglösningen. Live / Dead Staining Solution är 5 jiM SYTO9, 30 pM propidiumjodid, och 0,1% saponin (slutkoncentrationer) i MOPS / MgCl2.
- Inkubera cellerna under 15 min vid rumstemperatur i mörker.
- Skölj celler två gånger i MOPS / MgCl2.
- Invertera täcksidan nedåt på objektglas och försegla med genomskinligt nagellack. Använd inte monteringsmedier.
- Hämta bilder inom 30 minuter, med hjälp av en fluorescensmikroskop med filtersatser är kompatibla med grönt, rött, och långt röda bilden förvärvet.
OBS: Både konventionella fluorescensmikroskopi och konfokal laserskanning mikroskopi kan användas. Efter 30 minuter de fluorescerande färgämnena börjar läcka från bakterierna och de data som samlats in inte längre är korrekta. Bilderna i den här artikeln har förvärvats på en Nikon Eclipse E800 upprätt fluorescensmikroskop med digitalkamera Hamamatsu Orca-ER använda Openlab programvara. Fluorescens av Alexa Fluor 647 detekterades med användning av ett filter med excitationsvåglängd av 590 till 650 nm och en emissionsfilter av 663-735 nm och är falsk-färgad blå. Fluorescens från propidiumjodid detekterades med användning av ett filter med excitationsvåglängd av 540 till 580 nm och en emissionsfilter av 600-660 nm. Fluorescens från SYTO9 detekterades med användning av ett filter med excitationsvåglängd av 465 till 495 nm och en emissionsfilter av 515-555 nm.
- Detta protokoll kommer att resultera i bilder där externa icke-livsdugliga bakterier verkar blå + röd, interna icke-livsdugliga bakterier ser röda bara, yttre livskraftiga bakterier verkar blått + grönt, och inre livskraftiga bakterier verkar grönt bara. Räkna med ögat antalet bakterier som är extern icke-livsdugliga, intern nonviable, extern livskraftig, och interna livskraftig.
- Beräkna procenten av de yttre livsdugliga bakterier genom att dividera antalet externa livsdugliga bakterier med det totala antalet externa bakterier (viabla plus nonvimöjlighet). Beräkna procenten av interna livsdugliga bakterier genom att dividera det antal interna livsdugliga bakterier med det totala antalet interna bakterier (viabla plus icke-livsdugliga) (Figur 4).
- Det finns två viktiga kontroller för att utföra med detta protokoll. Först, validera att alla icke-livsdugliga bakterier är propidiumjodid-positiva och alla levande bakterier är SYTO9-positiva. En mid-logaritmisk kultur av bakterier (i frånvaro av eventuella värdceller) bör vara> 95% SYTO9 positiva. I fig 2 är en mid-logaritmisk kultur av N. gonorrhoeae (vid 10 8 kolonibildande enheter per ml) inkuberas med Live / Dead färglösningen. För det andra, validera att både propidiumjodid och SYTO9 kan skriva permeabilized, infekterade värdceller.
- För att generera en population av döda bakterier, samla 2 x 10 8 bakteriekolonibildande enheter i 1,5 ml mikrofugrör, tillsätt 70% isopropanol och sitta i 10 min. Pelletera bakterierna i en mikrofug ennd tvätta bakterierna två gånger i PBS för att avlägsna kvarvarande isopropanol. Följ sedan protokollet steg från 1,5 till 1,7. Lägg 5 | il bakteriesuspension till ett objektglas och överlagring med ett täckglas. Bildprover som i protokollsteg 1.9. Under dessa förhållanden ska 100% av befolkningen vara propidiumjodid-positiva (Figur 2). I vissa bakteriearter, får propidiumjodid inte helt överväldiga SYTO9 färgning, och icke-livsdugliga bakterier kan visas gult eller orange.
- För fagocytiska celler såsom neutrofiler, exponera cellerna för isopropanol dödade bakterier och se till att 100% av de intracellulära bakterierna är propidiumjodid-positiva (Figur 3). För nonphagocytic celler som kanske inte internaliserar döda bakterier, kan det vara tillräckligt för att behandla infekterade celler med natriumazid eller andra cellgenomträngande antimikrobiella medel före tillsats Live / Dead färglösningen.
2. Uppskatta Bakteriell viabilitet med Sytox Green och DAPI
- Etikett bakterier av intresse med 10 mikrogram / ml DAPI i Morses definierat medium 25 i 20 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Infektera celler som är vidhäftande till 12 mm diameter cirkulära täckglas av glas i 24-brunnars plattor med DAPI-märkta bakterier. INTE fixera cellerna med aldehyder eller organiska lösningsmedel.
- Skölj cellerna en gång med MOPS / MgCl2.
- Inkubera cellerna under 10 min vid rumstemperatur i mörker med Alexa Fluor 647-kopplad antikropp eller ett lektin som binder till de bakteriearter av intresse, i MOPS / MgCl2, att detektera yttre bakterier. Se anmärkning i protokollet steg 1.3 för föreslagna kontroller.
- Aspirera media från celler och till 0,5 ml 0,4 mikroM Sytox Green i MOPS / MgCl2.
- Inkubera cellerna i 5 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Skölj celler två gånger i MOPS / MgCl2.
- Tvätta cellerna en gång i MOPS / MgCl2 för 5 min.
OBSERVERA: Fluorescens från Alexa Fluor 647 detekterades med användning av ett filter med excitationsvåglängd av 590 till 650 nm och en emissionsfilter av 663-735 nm och är falsk-färgad röd. Fluorescens från Sytox Grön detekterades med användning av ett filter med excitationsvåglängd av 465 till 495 nm och en emissionsfilter av 515-555 nm. Fluorescens från DAPI detekterades med hjälp av ett filter med excitationsvåglängd av 355-375 nm och barriärfilter på 400 nm.
- Detta protokoll kommer att resultera i bilder där externa icke-livsdugliga bakterier verkar röd + grön, interna icke-livsdugliga bakterier verkar grön + blå, yttre livskraftiga bakterier verkar röd + blå, och inre livskraftiga bakterier verkar blå endast (Figur 4). Beräkna procenten av externa och interna bakterier såsom beskrivits i protokollet stes. 1.11.
- De kontroller som beskrivs i protokollsteg 1.12 bör utföras med DAPI / Sytox grön färg kombination (bild 2 och 3).
3. Bedöma Bakteriell livskraft Vid sidan subcellulära lokalisering
- Etikett bakterier av intresse med 10 mikrogram / ml DAPI i Morses definierat medium under 20 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Infektera celler som är vidhäftande till 12 mm diameter cirkulära täckglas av glas i 24-brunnars plattor med DAPI-märkta bakterier. INTE fixera cellerna med aldehyder eller organiska lösningsmedel.
- Skölj cellerna en gång med MOPS / MgCl2.
- Inkubera 10 minuter vid rumstemperatur i mörker med Alexa Fluor 647-kopplad antikropp eller ett lektin som binder till de bakteriearter av intresse, i MOPS / MgCl2, att detektera yttre bakterier. Se anmärkning i protokollet steg 1.3 för föreslagna kontroller.
- Aspirera media från celler och skölj celler två times i MOPS / MgCl2.
- Inkubera cellerna med Alexa Fluor 555-kopplad antikropp mot subcellulär markör av intresse för 20 min, i MOPS / MgCl2 innehållande 0,2% saponin.
- Skölj celler två gånger i MOPS / MgCl2.
- Tvätta cellerna en gång i MOPS / MgCl2 för 5 min.
- Aspirera media från celler och lägga till 0,4 mikroM Sytox Green i MOPS / MgCl2.
- Inkubera cellerna i 5 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Skölj celler två gånger i MOPS / MgCl2.
- Tvätta cellerna en gång i MOPS / MgCl2 för 5 min.
- Förvärva bilder av diabilder i 30 min på fluorescensmikroskop. Se protokoll steg 1,9 för beskrivning av mikroskop, digitalkamera, och förvärv programvara.
OBS: Fluorescens från Alexa Fluor 647 detekterades med hjälp av ett filter med excitationsvåglängd av 590 till 650 nm och emissionsfilter av 663-735 nm, och är falskt färgad lila. Fluorescens from Alexa Fluor 555 detekterades med användning av ett filter med excitationsvåglängd av 540 till 580 nm och en emissionsfilter av 600-660 nm. Fluorescens från Sytox Grön detekterades med användning av ett filter med excitationsvåglängd av 465 till 495 nm och en emissionsfilter av 515-555 nm. Fluorescens från DAPI detekterades med hjälp av ett filter med excitationsvåglängd av 355-375 nm och barriärfilter på 400 nm.
- Detta protokoll kommer att resultera i bilder där externa icke-livsdugliga bakterier verkar lila + grön, interna icke-livsdugliga bakterier verkar grön + blå, yttre livskraftiga bakterier verkar lila + blå, inre livskraftiga bakterier verkar blå bara, och subcellulär protein är röd (Figur 4). Kvantifiera perecent av yttre och inre livskraftiga bakterier som beskrivs i protokollet steg 1.11.
- De kontroller som beskrivs i protokollsteg 1.12 bör utföras med DAPI / Sytox grön färg kombination (bild 2 och 3).
- IFörutom att räkna livskraftiga och icke-livsdugliga bakterier, klassificera varje bakterie som antingen positiva eller negativa för colocalization med subcellulära markör av intresse.
- Beräkna procenten av livsdugliga bakterier samlokaliserades med subcellulär markör genom att dividera antalet samlokaliserades livsdugliga bakterier med det totala antalet livsdugliga bakterier. Beräkna procenten av icke-livsdugliga bakterier samlokaliserades med subcellulär markör genom att dividera antalet icke-livsdugliga samlokaliserades bakterier med det totala antalet av icke-livsdugliga bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protokoll som beskrivs användes för att undersöka överlevnaden av N. gonorrhoeae efter exponering för primära humana neutrofiler 5,26. Neutrofiler var infekterade med N. gonorrhoeae och bearbetas med protokoll 1, med hjälp av den gröna fluorescerande livskraft färgämne SYTO9 och den röda fluorescerande propidiumjodid (Figur 4A). Färgämnena tillsattes i närvaro av saponin, som binder kolesterol för att preferentiellt permeabilize värdcellens plasmamembran, inte N. gonorrhoeae membran. Andra detergenter kan behöva provas om membranen i bakterier av intresse innehåller höga halter av kolesterol. Alla N. gonorrhoeae fläcken med SYTO9, men bara bakterier med nedsatt membran färgas med propidiumjodid. Den propidiumjodid övervinner SYTO9 fluorescens, så levande bakterier verkar gröna och döda bakterier ser röda 27. I vissa bakteriearter kan propidiumjodid inte helt övervinna SYTO9 staining, vilket resulterar i döda bakterier som förekommer gul eller orange. Förhållandet av propidiumjodid till SYTO 9 maj behöva optimeras för olika bakteriearter. Före permeabilisering cellerna och lägga SYTO9 och propidiumjodid, var en Alexa Fluor 647 kopplade sojabönslektin läggs till de infekterade cellerna att upptäcka cellulära N. gonorrhoeae, och långt-röd fluorescens signalen var falsk-färgad blå. Således, i detta protokoll yttre livskraftiga bakterier verkar turkos (blå + grön) och extern nonviable verkar magenta (blått + rött). Interna livskraftiga bakterier verkar grönt endast (pil), och interna icke-livsdugliga bakterier ser röda endast (pilspets). Det är viktigt att notera att i infekterade celler, kommer den eukaryota cellens kärna färgas av SYTO9 och propidiumjodid ("N", Figur 4A). De yttre livskraftiga, yttre icke-livsdugliga, inre livskraftiga, och interna icke-livsdugliga bakterier kvantifierades från fluorescens bilder för att ge procent av internaliserade bakterier and procentlivskraftiga bakterier i och utanför värdceller.
Figur 4B är en representativ bild av N. gonorrhoeae-infekterade neutrofiler behandlas med protokoll 2, med hjälp av lönsamhets färgämnen Sytox Grön och DAPI. Detta protokoll undviker användning av propidiumjodid, vilket fluorescerar i både röda och ultravioletta kanaler på fluorescensmikroskop. Alla N. gonorrhoeae fläcken med DAPI (blå), men bara bakterier med nedsatt membran färgas med Sytox Green. Såsom beskrivits ovan, före permeabilisering av cellerna gjordes en Alexa Fluor 647-coupled sojabönslektin sattes till de infekterade cellerna för att detektera extracellulär N. gonorrhoeae, vars fluorescens i det här fallet är falsk-färgat rött. Därför yttre livskraftiga bakterier verkar magenta (röd + blå) och externa icke-livsdugliga bakterier verkar gul (röd + grön / blå). Interna livskraftiga bakterier verkar blå endast (pilar), och interna icke-livsdugliga bakterier verkar grön / blå (pilspetsar). Dei väntan på den relativa intensitet DAPI vs Sytox grön fluorescens, kan icke-livsdugliga bakterier visas turkos. Liknar celler som behandlas med propidiumjodid och SYTO9 är neutrofila kärnan färgas av Sytox Grönt och DAPI i figur 4B (anges med "N"). Exponering av infekterade celler till Sytox Grön och DAPI avslöjar procent interna och livskraft bakterier i värdceller, kvantifieras som beskrivits ovan för propidiumjodid och SYTO9. Resultat från N. gonorrhoeae-infekterade neutrofiler bearbetas med Sytox Grön och DAPI är jämförbara med de som erhålles med propidiumjodid och SYTO9 26.
Som visas i figur 4C, är protokoll 3 en anpassning av protokoll 2, där de bakteriella viabilitet färgämnen kombinerades med immunofluorescens för primär eller azurofila neutrofila granulat protein CD63. Detta experiment genomfördes för att fastställa sammansättningen av phagosome fack iNside neutrofiler som innehåller livskraftiga eller icke-livsdugliga N. gonorrhoeae 26. Detta protokoll kräver ett mikroskop för fyrfärgs fluorescens förmågan att upptäcka livskraftiga bakterier, icke-livsdugliga bakterier, extracellulära bakterier och subcellulär markör. Eftersom viabilitet färgämnen är inte kompatibla med aldehyd fixering (våra opublicerade observationer) utförde vi immunofluorescens utan fixering, med hjälp av en antikropp, direkt kopplas till en fluorofor för att minimera den tid som behövs för att detektera antigen inuti celler. Denna antikropp är kopplad till den röda fluoroforen Alexa Fluor 555. Liksom i protokoll 2, var livsdugliga och icke-livsdugliga bakterier särskiljas med hjälp DAPI och Sytox Green, respektive, och externa bakterier färgades med hjälp av Alexa 647 kopplade sojabönslektin. Externa bakterier fluorescerar långt rött och är falska färgade lila. Externa livskraftiga bakterier verkar lila + blå och externa icke-livsdugliga bakterier verkar lila + grön / blå. Interna livskraftiga bakterier verkar blå (pil) och internella icke-livsdugliga bakterier verkar grönt (pilspets). CD63-positiva korn och phagosomes ser röda ut. Den neutrofila kärnan färgas med DNA-specifika färgämnen ("N"). Vid analys av dessa bilder, var varje enskild bakterie klassas som extern kontra intern, livskraftig kontra icke-livsdugliga, och positiva eller negativa för en ring av CD63 färgning. N. gonorrhoeae ansågs att bosätta sig i ett neutrofila CD63-positiva phagosome om det finns ≥ 50% av en ring av CD63 fluorescens kring bakterierna, och i en CD63-negativ phagosome om det är <50% av en ring av CD63 fluorescens kring bakterierna . Den icke livsduglig intracellulär bakterie som indikeras av pilen i fig 4C har en ring av färgning för CD63 som omger bakterierna. Denna ring indikerar primära granulat anrikas vid denna phagosome. Den livskraftiga intracellulär bakterie, som anges med pilen, saknar färgning för CD63, vilket indikerar primära granulat inte anrikas vid phagosome. Vianvänt denna teknik för att visa ett samband mellan livskraft N. gonorrhoeae och bosättning i en primär granulat-negativ phagosome 26. Eftersom denna analys spårar både livskraft och bakterie lokalisering med hjälp av ett protein av intresse, är det möjligt att bestämma om icke-livsdugliga och livskraftiga bakterier bor i samma eller olika platser. Denna information ger viktiga första inblick i mekanismer som bidrar till bakteriens överlevnad i värdceller.
Figur 1. En blandning av livsdugliga och icke-livsdugliga N. gonorrhoeae var utsatt för Alexa Fluor 647 kopplad sojabönslektin, propidiumjodid och SYTO9 enligt protokoll 1, i avsaknad av värdceller. Alla bakterier är tillgängliga för lektin och fluorescerar blått. Icke-livsdugliga bakterier verkar blå + röd och icke-livsdugliga bakterier verkar blå+ Grönt.
Figur 2. (AB) Mid-logaritmisk fas N. gonorrhoeae utsattes för propidiumjodid och SYTO9 som i protokoll 1, med (A) eller utan (B) isopropanol behandling för att döda bakterierna. icke-livsdugliga bakterier är tillgängliga för propidiumjodid och ser röda ut. Viabla bakterier färgas med SYTO9 och grön. (CD) Mid-logaritmisk fas N. gonorrhoeae utsattes för DAPI och Sytox Grönt som i protokoll 2, med (C) eller utan (D) isopropanol behandling för att döda bakterierna. Icke-livsdugliga bakterier är tillgängliga för DAPI och Sytox Grönt och verkar blått + grönt. Livskraftiga bakterier färgas med endast DAPI och verkar blå bara.
Figur 3. (A) Neutrofiler fick binda och internalisera isopropanol-dödade N. gonorrhoeae, sedan utsätts för propidiumjodid och SYTO9 enligt protokoll 1. Icke-livsdugliga bakterier färgas med propidiumjodid och ser röda ut. Eftersom alla bakterier är icke-livsdugliga, ingen SYTO9 positiv, är gröna bakterier upptäckts. (B) Neutrofiler fick binda och internalisera isopropanol tätat N. gonorrhoeae, sedan utsatt för DAPI och Sytox Grön enligt protokoll 2. Icke-livsdugliga bakterier färgas med DAPI och Sytox Grönt och visas i blått + grönt. Eftersom alla bakterier är icke-livsdugliga, ingen DAPI bara, blå bara bakterierna detekteras. N etiketter neutrofila kärnan. Scale bar = 5 | im. Pilspetsar visar några av de icke-livsdugliga bakterier.
i "src =" / files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg "/>
Figur 4. (A) N. gonorrhoeae-infekterade humana neutrofiler exponerades för Alexa Fluor 647-coupled sojabönslektin (false-färgad blå), därefter permeabiliserade med saponin i närvaro av viabiliteten färgämnen propidiumjodid (röd), för att märka döda bakterier och SYTO9 (grön), att motfärga levande bakterier. Extern icke-livsdugliga bakterier verkar blå + röd, interna icke-livsdugliga bakterier ser röda bara, yttre livskraftiga bakterier verkar blått + grönt, och inre livskraftiga bakterier verkar grönt bara. (B) N. gonorrhoeae märktes med DAPI (blå), presenterade därefter för neutrofiler. Infekterade celler exponerades sedan för Alexa Fluor 647-coupled sojabönslektin (false-färgad röd), därefter permeabiliserade med saponin i närvaro av Sytox Gröna (grön) för att märka döda bakterier. Externa icke-livsdugliga bakterier verkar röd + grön, interna icke-livsdugliga bakterier verkar grön + blå, extern livskraftig bacterier verkar röd + blå, och inre livskraftiga bakterier verkar blå bara. (C) N. gonorrhoeae-infekterade neutrofiler bearbetades såsom i B, med undantag av en Alexa Fluor 555-kopplad antikropp mot neutrofil primär granulatproteinet CD63 (röd) tillsattes vid tiden för permeabilisering. Alexa Fluor 647-sojabönslektin färgning var falsk färgad lila. Externa icke-livsdugliga bakterier verkar lila + grön, interna icke-livsdugliga bakterier verkar bara grönt, yttre livskraftiga bakterier verkar lila + blå, inre livskraftiga bakterier verkar blå bara, och CD63 färgning visas rött. Den infällda bilden visar CD63 fluorescens i det område av bilden som anges med den vita fyrkanten. I AC, N märker den neutrofila kärnan. Scale bar = 5 | im. Pilar indikerar icke-livsdugliga bakterier och pilarna visar livskraftiga bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenteras två protokoll som använder DNA-bindande och lönsamhet färgämnen i samband med ett fluorescerande lektin att identifiera levande och döda bakterier fästa vid och inuti mänskliga celler. Eftersom båda protokollen effektivt diskriminera live från döda bakterier, valet av vilket protokoll som ska användas beror på målet med försöket. Det första protokollet använder propidiumjodid för att upptäcka icke-livsdugliga bakterier och SYTO9 att upptäcka intakta bakterier. Visas i figur 4A är en representativ bild av protokoll 1 tillämpas på humana neutrofiler infekterade med N. gonorrhoeae. Dessa färgämnen kombinerades med ett lektin, soja agglutinin, erkänna cellulära N. gonorrhoeae, men en fluorescenskopplade bakterier specifik antikropp kan användas som ett alternativ. Protokoll 1 avslöjar lätt lönsamheten för enskilda bakterier, eftersom uteslutande av SYTO9 genom propidiumjodid gör icke-livsdugliga bakterier fluorescerar rött och livskraftiga bakterier fluorescerar grönt. However, detta protokoll kan inte kombineras med immunofluorescens för värdproteiner, på grund av fluorescens av propidiumjodid i två av de fyra kanaler som finns tillgängliga för konventionell fluorescensmikroskopi. Därför var protokoll 2 utvecklades, som använder Sytox Grön för att identifiera icke-livsdugliga bakterier och DAPI att upptäcka den totala bakteriepopulationen. Ett exempel på N. gonorrhoeae associerad med och inuti humana neutrofiler och bearbetas med Sytox Grön och DAPI visas i figur 4B och ett exempel i kombination med immunofluorescens visas i figur 4C. Förutom att det finns ytterligare två fluorescens kanaler, är detta protokoll fördelaktigt att användas av personer med röd-grön colorblindness. Emellertid kan icke-livsdugliga bakterier fluorescerar grönt eller blått-grönt, beroende på den relativa intensiteten hos DAPI och Sytox grönfärgning och om nämnda bildförvärvsparametrar. En nackdel med användning av DAPI är att det kan läcka från N. gonorrhoeaeunder loppet av infektionen, även om detta inte kan vara ett problem för andra bakterier såsom Staphylococcus aureus (våra opublicerade observationer). För att motverka detta problem, var infekterade celler märkta med DAPI tillsammans med Sytox Grön efter infektion, men intensiteten av det nukleära DAPI-färgning mann fluorescensen av N. gonorrhoeae (våra opublicerade observationer). Förutom dessa två protokollen kan andra kommersiellt tillgängliga färgämnen kan användas för att avslöja bakteriell livsduglighet. Till exempel skulle karboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) märka den totala bakteriepopulationen och Sytox orange eller blå kan identifiera icke-livsdugliga bakterier. Eftersom den relativa effekten av dessa förfaranden kan variera med bakterien och infekterade celltyper, är det viktigt att forskarna jämför olika viabilitet färgämneskombinationer i deras infektionssystem.
För närvarande undersöker vi manuellt varje bild som erhålls med dessa protokoll att kvantifiera percent interna, procent livskraft intracellulärt och extracellulärt, och samlokalisering med subcellulära markörer. Även automatiserade datorbaserade metoder kan teoretiskt användas för att kvantifiera dessa parametrar, kan de kompliceras av alla icke-enhetlig färgning av bakterierna med lönsamhets färgämnen och den starka fluorescenssignalen i cellkärnan. Dessutom kan definitionen av bakterie colocalization med en subcellulär markör måste optimeras för bakterierna, celltyp och markör av intresse.
En begränsning av dessa protokoll är antagandet att permeabiliteten för propidiumjodid eller Sytox Green är ett riktigt mått på bakteriell död. Molekylvikten för propidiumjodid och Sytox Green är 668,4 Da och 600 Da. Dessa färgämnen anses membran impermeant och bör inte komma åt den bakteriella cytoplasman om bakterierna har oreparerad membranskador. Dock kvarstår möjligheten att bakterierna anger ett tillstånd av stasiseller ens reparera sina membranskador och fortsätter att växa i senare tider. En andra begränsning är att de protokoll som inte tillåter viabiliteten av enskilda bakterier att spåras över tiden. Life Technologies rekommenderar att bedömningar av bakteriell viabilitet med propidiumjodid och SYTO9 utföras inom 30 min efter exponering för de färgämnen, eftersom bakterierna förlorar viabilitet ju längre de är monterade och avbildas genom fluorescensmikroskopi. Infekterade celler märkta med DAPI / Sytox grön färg kombination måste också avbildas snabbt efter montering (våra opublicerade observationer). För det tredje, de protokoll som inte är kompatibel med vanligen använda fixeringstekniker. Metanol eller aceton fixering kommer permeabilize och döda de bakterier som följer med värdceller, och aldehyd-baserade fixativ permeabilize N. gonorrhoeae inne humana neutrofiler till propidiumjodid och Sytox Grön (opublicerade observationer). Således använder dessa protokoll kräver omedelbar tillgång till en fluorescens MICRoscope och förmåga att slutföra de protokoll i en dag. Slutligen har var och en av färgämnena i dessa protokoll binder dubbelsträngat nukleinsyror och binder värd nukleärt DNA såväl som bakterie-DNA (figur 1). Eftersom fluorescens av kärn-DNA är betydligt ljusare än fluorescens av bakteriellt DNA, inte kan bedömas livskraft bakterier som är i närheten av den eukaryota cellkärnan. Konfokal laserscanningsmikroskopi och prelabeling bakterier med DAPI hjälp minska kärnfluorescenssignal. Fluorescens av kärn-DNA kommer att förbli en komplikation av dessa protokoll till icke-DNA-bindande bakteriella viabilitet färgämnen utvecklas.
Trots dessa begränsningar, protokollen i den här artikeln ger ett känsligt sätt att bedöma lönsamheten för enskilda bakterier fästa vid och inuti eukaryota celler. Mikroorganismer eller gentamicin-skyddsanalyser har varit ryggraden i mikrobiell patogenes forskning. Emellertid är de provide en bedömning av bakteriell överlevnad över en potentiellt heterogen befolkning. Däremot är lönsamheten färgämnes protokoll som beskrivs här tillåter integritet enskilda bakterier som skall undersökas. Därför kan forskarna samla in uppgifter om de öden cellulära vs intracellulära bakterier, bakterier i olika phagosomal typer, eller bakterier i ett phagosome vs cytoplasman. Tunna avsnitt transmissionselektronmikroskop har ofta använts för att undersöka lönsamheten för enskilda bakterier. Även bakterier som visas elektronlysande eller inte längre intakt från TEM är klart icke-livsdugliga, är det svårare att bedöma om bakterier som behåller en del elektrontätheten i sin cytoplasma är faktiskt intakt. Dessutom kan det ta många timmar av elektronmikroskop tid att skaffa tillräckligt med mikrofotografier för att analysera, medan många låg effekt fält kan förvärvas från celler som exponeras för fluorescensbaserade viabilitet färgämnen, även på kort tid ges för bildtagning. Även om de preliminäraded protokoll har optimerats med N. gonorrhoeae och primära humana neutrofiler, kan de anpassas för att bedöma viabiliteten hos många arter av gramnegativa och grampositiva bakterier i en mängd olika celltyper, inklusive alla fagocytiska och nonphagocytic eukaryota celler 5,15-24,26. Bakteriella viabilitet färgämnen ger ett kraftfullt experimentellt verktyg för att undersöka mekanismer för bakteriell patogenes i eukaryota celler och förmågan hos eukaryota celler för att kontrollera bakterieinfektion. I framtiden, dessa protokoll kommer sannolikt att bli ännu mer användbar med bättre verktyg för automatisk bildtagning och behandling, tillsammans med utvecklingen av bakterie viabilitet färgämnen som är kompatibla med aldehyd fixering och specifik för prokaryoter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Asya Smirnov och Laura Gonyar för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag NIH R00 TW008042 och R01 AI097312 till AKCMBJ stöddes delvis av NIH T32 AI007046.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S.
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
