Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50729
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

Summary

Sentralt til feltet av bakteriell patogenesen er evnen til å definere om og hvordan mikrober overlever etter eksponering for eukaryote celler. Denne artikkelen beskriver protokoller for ved bruk av fluorescerende fargestoffer som viser levedyktigheten til de enkelte bakterier i og er forbundet med vertsceller.

Abstract

Sentralt til feltet av bakteriell patogenesen er evnen til å definere om og hvordan mikrober overlever etter eksponering for eukaryote celler. Nåværende protokoller for å håndtere disse spørsmålene omfatter kimtall analyser, gentamicin beskyttelse analyser, og elektronmikroskopi. Kimtall og gentamicin beskyttelse analyser bare vurdere levedyktigheten av hele bakteriepopulasjon og er ute av stand til å avgjøre enkelt bakteriell levedyktighet. Elektronmikroskopi kan brukes til å bestemme levedyktigheten til de enkelte bakterier og gi informasjon med hensyn til deres lokalisering i vertsceller. Imidlertid bakterier ofte et utvalg av elektron-tettheter, slik at evaluering av levedyktighet vanskelig. Denne artikkelen beskriver protokoller for ved bruk av fluorescerende fargestoffer som viser levedyktigheten til de enkelte bakterier i og er forbundet med vertsceller. Disse analysene ble opprinnelig utviklet for å vurdere overlevelse av Neisseria gonorrhoeae i primære humane nøytrofiler, men bør være enpplicable til enhver bakterie-verten celle interaksjon. Disse protokollene kombinere membran-gjennomtrengelige fluorescerende fargestoffer (SYTO9 og 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), som flekker alle bakterier, og membran-ugjennomtrengelig fluorescerende fargestoffer (propidium jodid og SYTOX grønt), som bare er tilgjengelig for ikke-levedyktige bakterier. Før eukaryot celle permeabilization, er et antistoff eller fluorescerende reagens tilsettes for å identifisere ekstracellulære bakterier. Dermed disse assays diskriminere levedyktigheten til bakteriene vedheftende til og i eukaryote celler. En protokoll er også tilveiebrakt for bruk av levedyktighet fargestoffer i kombinasjon med fluoriserende antistoffer mot eukaryotiske celle markører, for å bestemme den subcellulære lokalisering av de enkelte bakterier. Den bakterielle levedyktighet fargestoffer omtalt i denne artikkelen er en følsom supplement og / eller alternativ til tradisjonelle mikrobiologi teknikker for å evaluere levedyktighet av individuelle bakterier og gi informasjon om hvor bakterier overleve i vertscelles.

Introduction

Det er et dynamisk samspill og co-evolusjon mellom bakterier og vertene der de bor. Bakterier har utviklet seg tilslutning organeller, sekresjons-systemer, og / eller evnen til å produsere toksiner som muliggjør deres produktiv infeksjon av verts fagocytisk og ikke-fagocytiske celler. Bakteriene må også kjempe med anerkjennelse og antimikrobielle aktiviteter av vertens immunsystem. Vertsimmunsystemet består av medfødt og adaptiv komponenter, inkludert fysiske og kjemiske barrierer, immunceller, komplementsystemet, og andre komponenter av humoral immunitet. Mens mange bakterier er utsatt for avliving og klaring av det flerlags vertsimmunrespons, har noen patogene og opportunistisk bakterier utviklet mekanismer for å infisere en rekke vertsceller og undergrave klaring av vertsimmunrespons 1.. Neisseria gonorrhoeae er et eksempel på et bakterielt patogen som er sterkt tilpasset til å vedvare i sin menneskelige vert. N. gonorrhoeae lett koloniserer luminal flater av mukosale epitelceller i urogenitaltraktus, svelg, øyets bindehinne, og rektum. Colonization utløser rikelig rekruttering av nøytrofile ved slimhinnesider. Nøytrofiler er profesjonelle fagocytter som besitter en rekke antimikrobielle prosesser for å drepe mikroorganismer, men N. gonorrhoeae er i stand til å overleve i nærvær av neutrofiler 2-5. Forstå hvordan bakterielle patogener som N. gonorrhoeae grave, undertrykke, og kapre immunrespons til slutt overleve i normalt fiendtlige vertsmiljøer er avgjørende for utviklingen av nye behandlingsformer for å bekjempe smittsomme sykdommer.

Eksperimentelle protokoller ofte brukes til å undersøke overlevelse av bakterier i vertsceller omfatter kimtall analyser, gentamicin beskyttelse analyser, og elektronmikroskopi. I kimtall analyser, er en befolkning på infiserte celler lysert (for eksempel med et vaskemiddel, r.ich bakteriene er resistente) for å frigjøre bakterier. De lysater blir fortynnet og sådd ut på agar-baserte media, og koloni-dannende enheter i lysatene er oppregnet for hvert tidspunkt og / eller eksperimentelle tilstand. Denne tilnærmingen rapporterer levedyktigheten av hele bakteriepopulasjon, men er ikke i stand til å skille mellom intracellulært og ekstracellulært overlevelse. En variant av den kimtall analyse ble gentamicin beskyttelses assay måler spesielt intracellulær bakteriell overlevelse, på grunnlag av den manglende evnen av de antibiotiske gentamicin å krysse eukaryot plasma membran 6.. Imidlertid er denne analysen er avhengig av bakteriene blir utsatt for å drepe av gentamicin (eller et annet antibiotikum som er tilsvarende eukaryote membran-impermeant) og manglende evne av antibiotika for å få tilgang til indre bakterier. Derfor kan en gentamicin beskyttelse analysen ikke være effektive for undersøkelse av alle bakterielle arter eller når undersøke overlevelse av bakterier høytpinocytic celler som nøytrofile. Ingen av disse tilnærmingene avslører subcellulære lokalisering eller annen oppførsel av enkelte bakterier (f.eks hvis bakterier danner aggregater eller-mikro som oppfører seg annerledes enn enkelte bakterieceller). Et annet ofte brukt metode for å undersøke gjennomførbarheten av de enkelte eksterne og interne bakterier er tynn-snitt transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Denne fremgangsmåten er fordelaktig ved at det kan gi informasjon angående beliggenheten av bakteriene i vertsceller (f.eks phagosome, cytoplasma, autophagosome), som kan bli ytterligere undersøkt ved mikroskopi immunoelectron med gull-koplet antistoffer mot subcellulære markører. Imidlertid er elektronmikroskopi ikke spesielt følsom ved å vurdere bakteriell levedyktighet. Når innebygde seksjoner er farget med uranyl-acetat, bly-citrat eller andre elektron-tette reagenser og avbildes ved elektronmikroskopi, er elektron-tette bakterier betraktes levedyktig og elektron-Lucent nonviable 7,8. Men overvurderer denne antakelsen bakteriell levedyktighet, siden bare de døde bakterier med alvorlig forstyrret membraner og blottet for cytoplasma vises elektron-Lucent. I tillegg kan enkelte bakteriearter viser et utvalg av elektrontetthet avhengig av deres vekstfase, som gjør det vanskelig å bestemme levedyktigheten.

Som et alternativ eller i tillegg til disse brukte metoder, her vi gi protokoller og begrunnelse for bruk av fluorescerende fargestoffer som indikerer bakteriell levedyktighet for å vurdere overlevelse av bakteriene som er koblet til og internalis av vertsceller. For å identifisere ekstracellulære bakterier, blir infiserte celler først eksponert for en fluorescerende reagens, for eksempel en lektin-eller bakterie-spesifikke antistoff. De infiserte cellene blir deretter permeabilized og utsatt for DNA-spesifikke fargestoffer som er differensielt tilgjengelig for bakterier med intakt g. degradert membraner, som et surrogat for bakteriell levedyktighet. I den første protocol, identifiserer membranen gjennomtrengelig fargestoff SYTO9 den totale bakteriepopulasjon, mens propidium iodide er kun tilgjengelig for de bakteriene som har kompromittert membraner og er dermed å betrakte nonviable. Propidium iodide og SYTO9 har blitt brukt til å evaluere bakteriell levedyktighet i biofilm, diskriminere patogene fra nonpathogenic bakterier, og nummerere levedyktige vannbårne bakterier 9-12. I den andre protokollen, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) identifiserer totale bakterier, mens SYTOX Green er kun tilgjengelig for den ikke-levedyktig populasjon. Disse levedyktighet fargestoff parene kan kombineres med immunfluorescens å bestemme hver bakterie plassering i forhold til et protein av interesse, for eksempel for å definere bakteriell subcellulær lokalisering. Bruken av disse analysene gir viktig innsikt inn i de vekselvirkninger som gir bakterie-drepende eller overlevelse under infeksjon av vertsceller. Protokollene er skissert i denne artikkelen ble brukt til å vurdere levedyktighetenN. gonorrhoeae som er knyttet til og i primære humane nøytrofile, herunder i ulike populasjoner av nøytrofile phagosomes 5,13,14. Imidlertid kan disse protokoller anvendes for å vurdere levedyktigheten til gram-positive og gram-negative bakterier i profesjonelle fagocytter, ikke-profesjonelle fagocytter, og protozoer 15-24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Vurdere Bakteriell Levedyktighet med Propidium Jodid og SYTO9

  1. Infisere celler som er tilhenger til 12 mm diameter sirkulære glass dekkglass i 24-brønners plater med bakterier av interesse. IKKE fikser cellene med aldehyder eller organiske løsemidler.
  2. Vask celler en gang forsiktig i 0,1 M 3 - (N-morfolino) propansulfonsyre (MOPS), pH 7,2, inneholdende 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl 2).
  3. Inkuber cellene i 10 minutter i mørke ved romtemperatur med Alexa 647 Fluor-koblet antistoff eller lektin som bindes til de bakterielle arter av interesse, i MOPS / MgCl 2, for å detektere ytre bakterier.

MERK: Conduct styrer med levende og døde bakterier, i fravær av vertsceller, for å vise at lektin eller antistoff av interesse bindes alle bakterier uavhengig av levedyktighet (fig. 1).

  1. Skyll cellene to ganger med MOPS / MgCl 2.
  2. Aspirer media fra celler og tilsett 0,5 ml Levende / død Farging Solution. Levende / døde Staining løsning er 5 uM SYTO9, 30 uM propidium-jodid og 0,1% saponin (sluttkonsentrasjoner) i MOPS / MgCl2.
  3. Inkuber cellene i 15 min ved romtemperatur i mørke.
  4. Skyll cellene to ganger i MOPS / MgCl 2.
  5. Inverter Dekk ansiktet ned på glassplater og forsegle med klar neglelakk. Ikke bruk monterings media.
  6. Hente bilder innen 30 minutter, ved hjelp av en fluorescens mikroskop med filter sett kompatible med grønt, rødt, og langt røde bildet oppkjøpet.

MERK: Både konvensjonelle fluorescens-mikroskopi og konfokal laser-skanning mikroskopi kan anvendes. Etter 30 min fluorescerende fargestoffer begynner å lekke fra bakteriene, og de data ervervet ikke lenger er nøyaktig. Bildene i denne artikkelen ble kjøpt på et Nikon Eclipse E800 oppreist fluorescens mikroskop med Hamamatsu Orca-ER digitalt kamera med Openlab programvare. Fluorescens av Alexa Fluor 647 ble detektert ved bruk av et filter med eksitasjonsbølgelengde på 590 - 650 nm og en emisjonsfilter på 663 til 735 nm, og er usann-farget blå. Fluorescens av propidium-jodid ble detektert ved bruk av et filter med eksitasjonsbølgelengde på 540 til 580 nm og en emisjonsfilter på 600 til 660 nm. Fluorescens fra SYTO9 ble detektert ved bruk av et filter med eksitasjonsbølgelengde på 465 til 495 nm og en emisjonsfilter på 515 til 555 nm.

  1. Denne protokollen vil resultere i bilder der eksterne ikke-levedyktige bakterier vises blå + rød, interne ikke-levedyktige bakterier blir røde bare, eksterne levedyktige bakterier vises blå + grønn, og interne levedyktige bakterier vises grønt bare. Telle ved øyet antall bakterier som er eksterne nonviable, intern nonviable, ekstern levedyktig, og interne levedyktig.
  2. Beregn prosent av eksterne levedyktige bakterier ved å dividere antall eksterne levedyktige bakterier med det totale antall eksterne bakterier (levedyktig pluss nonvistand). Beregn prosent av interne levedyktige bakterier ved å dividere antall interne levedyktige bakterier med det totale antall interne bakterier (levedyktig pluss ikke-levedyktig) (figur 4).
  3. Det er to viktige kontroller for å utføre med denne protokollen. Først validere at alle ikke-levedyktige bakterier er propidium jod-positive og alle levende bakterier er SYTO9-positive. Et midt-logaritmisk kultur av bakterier (i fravær av noen vertsceller) bør være> 95% SYTO9-positive. Vist i figur 2 er en midt-logaritmisk kultur av N. gonorrhoeae (på 10 8 kolonidannende enheter per ml) inkuberes med Levende / død Farging Solution. For det andre, validere at både propidium iodide og SYTO9 kan skrive inn permeabilized, infiserte vertsceller.
    1. For å generere en populasjon av døde bakterier, samle 2 x 10 8 bakteriekolonidannende enheter i et 1,5 ml mikro-sentrifugerør, tilsett 70% isopropanol, og gå opp til 10 min. Pellet bakterier i en mikro ennd vaske bakteriene to ganger i PBS for å fjerne resterende isopropanol. Deretter følger protokoll trinn 01.05 til 01.07. Tilsett 5 mL av bakteriesuspensjonen til et glass lysbilde og overlappe med et dekkglass. Bildeeksempler som i protokollen steg 1,9. Under disse betingelser, bør 100% av befolkningen er propidium-jodid-positive (figur 2). I enkelte bakteriearter, kan propidium iodide ikke helt overvelde SYTO9 flekker, og ikke-levedyktige bakterier kan vises gult eller oransje.
    2. For fagocyttiske celler som nøytrofile, eksponere cellene til isopropanol-drepte bakterier, og å sikre at 100% av de intracellulære bakterier er propidium-jodid-positive (figur 3). For nonphagocytic celler som ikke kan internal døde bakterier, kan det være tilstrekkelig å behandle infiserte celler med natrium-azid eller en annen celle-permeant antimikrobielle midler før tilsetning Levende / døde Staining løsning.

2. Vurdere Bakteriell Levedyktighet med SYTOX Green og DAPI

  1. Etikett bakterier av interesse med 10 pg / ml DAPI i Morse Definert Medium 25 i 20 min ved romtemperatur i mørke.
  2. Infisere celler som er tilhenger til 12 mm diameter sirkulære glass dekkglass i 24-brønners plater med DAPI-merket bakterier. IKKE fikser cellene med aldehyder eller organiske løsemidler.
  3. Skyll celler gang med MOPS / MgCl 2.
  4. Inkuber cellene i 10 minutter ved romtemperatur i mørke med Alexa 647 Fluor-koblet antistoff eller lektin som bindes til de bakterielle arter av interesse, i MOPS / MgCl 2, for å detektere ytre bakterier. Se merknad i protokollen steg 1,3 for foreslåtte kontroller.
  5. Sug media fra celler og tilsett 0,5 ml 0,4 mikrometer SYTOX Green i MOPS / MgCl 2.
  6. Inkuber cellene i 5 min ved romtemperatur i mørke.
  7. Skyll cellene to ganger i MOPS / MgCl 2.
  8. Vask cellene en gang i MOPS / MgCl 2 til 5 min.

MERK: Fluorescens fra Alexa Fluor 647 ble oppdaget ved hjelp av et filter med eksitasjon bølgelengde på 590 - 650 nm og en emisjonsfilter på 663-735 nm, og er falsk-farget rød. Fluorescens fra SYTOX Green ble detektert ved bruk av et filter med eksitasjonsbølgelengde på 465 til 495 nm og en emisjonsfilter på 515 til 555 nm. Fluorescens fra DAPI ble detektert ved bruk av et filter med eksitasjon bølgelengde på 355-375 nm og barrierefilter på 400 nm.

  1. Denne protokollen vil resultere i bilder der eksterne ikke-levedyktige bakterier vises røde + grønne, interne ikke-levedyktige bakterier blir grønne + blå, vises røde + blå eksterne levedyktige bakterier, og interne levedyktige bakterier vises kun blå (figur 4). Kvantifisere prosent av eksterne og interne bakterier som beskrevet i protokollen step 1,11.
  2. Kontrollene er beskrevet i protokollen trinn 1.12 bør utføres med DAPI / SYTOX grønne fargestoff kombinasjoner (figurene 2 og 3).

Tre. Vurdere Bakteriell Levedyktighet tillegg subcellulære lokalisering

  1. Etikett bakterier av interesse med 10 pg / ml DAPI i Morse Definert Medium i 20 min ved romtemperatur i mørke.
  2. Infisere celler som er tilhenger til 12 mm diameter sirkulære glass dekkglass i 24-brønners plater med DAPI-merket bakterier. IKKE fikser cellene med aldehyder eller organiske løsemidler.
  3. Skyll celler gang med MOPS / MgCl 2.
  4. Inkuber 10 minutter ved romtemperatur i mørke med Alexa 647 Fluor-koblet antistoff eller lektin som bindes til de bakterielle arter av interesse, i MOPS / MgCl 2, for å detektere ytre bakterier. Se merknad i protokollen steg 1,3 for foreslåtte kontroller.
  5. Sug media fra celler og skyll celler to times i MOPS / MgCl 2.
  6. Inkuber cellene med Alexa 555 Fluor-koblet antistoff mot subcellulære markør av interesse i 20 min, i MOPS / MgCl 2 inneholdende 0,2% saponin.
  7. Skyll cellene to ganger i MOPS / MgCl 2.
  8. Vask cellene en gang i MOPS / MgCl 2 til 5 min.
  9. Sug media fra cellene og legge 0,4 mikrometer SYTOX Green i MOPS / MgCl 2.
  10. Inkuber cellene 5 min ved romtemperatur i mørke.
  11. Skyll cellene to ganger i MOPS / MgCl 2.
  12. Vask cellene en gang i MOPS / MgCl 2 til 5 min.
  13. Acquire bilder av lysbilder i 30 min på fluorescens mikroskop. Se protokoll steg 1,9 for beskrivelse av mikroskop, digital kamera, og oppkjøpet programvare.

MERK: Fluorescens fra Alexa Fluor 647 ble oppdaget ved hjelp av et filter med eksitasjon bølgelengde på 590 - 650 nm og utslipp filter på 663-735 nm, og er falsk-farget lilla. Fluorescens from Alexa Fluor 555 ble detektert ved bruk av et filter med eksitasjonsbølgelengde på 540 til 580 nm og en emisjonsfilter av 600-660 nm. Fluorescens fra SYTOX Green ble detektert ved bruk av et filter med eksitasjonsbølgelengde på 465 til 495 nm og en emisjonsfilter på 515 til 555 nm. Fluorescens fra DAPI ble detektert ved bruk av et filter med eksitasjon bølgelengde på 355-375 nm og barrierefilter på 400 nm.

  1. Denne protokollen vil resultere i bilder der eksterne ikke-levedyktige bakterier vises lilla + grønn, interne ikke-levedyktige bakterier blir grønne + blå, eksterne levedyktige bakterier synes lilla + blå, interne levedyktige bakterier vises kun blå, og subcellulære protein ser rød (figur 4). Kvantifisere perecent av eksterne og interne levedyktige bakterier som beskrevet i protokollen trinn 1.11.
  2. Kontrollene er beskrevet i protokollen trinn 1.12 bør utføres med DAPI / SYTOX grønne fargestoff kombinasjoner (figurene 2 og 3).
  3. Itillegg til å telle levedyktige og ikke-levedyktige bakterier, klassifisere hver bakterier som enten positiv eller negativ for colocalization med subcellulære markør av interesse.
  4. Beregn prosent av levedyktige bakterier colocalized med subcellulære markør ved å dividere antall colocalized levedyktige bakterier med det totale antall levedyktige bakterier. Beregn prosentandelen av ikke-levedyktige bakterier colocalized med subcellulære markør ved å dividere antall ikke-levedyktige bakterier colocalized med det totale antall av ikke-levedyktige bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De protokoller som er beskrevet ble brukt til å undersøke overlevelse av N. gonorrhoeae etter eksponering for primær menneskelig nøytrofile 5,26. Nøytrofile ble infisert med N. gonorrhoeae og behandles med protokollen 1, ved hjelp av den grønne fluorescerende fargestoff SYTO9 levedyktighet og den rød-fluorescerende propidium jodid (figur 4A). De fargestoffer som ble tilsatt i nærvær av saponin, som sequesters kolesterol til preferensielt permeabilize vertscelleplasmamembranen, ikke N. gonorrhoeae membraner. Andre vaskemidler kan trenge å bli testet om membraner av bakterier av interesse inneholder store mengder kolesterol. Alle N. gonorrhoeae flekken med SYTO9, men bare bakterier med nedsatt membraner flekken med propidium iodide. Den propidium iodide seirer SYTO9 fluorescens, så levende bakterier vises grønne og døde bakterier vises rød 27. I enkelte bakteriearter, kan propidium jodid ikke er helt overvunnet SYTO9 staining, noe som resulterer i døde bakterier som vises gult eller oransje. Forholdet av propidium-jodid i SYTO 9.5 må optimaliseres for forskjellige bakteriearter. Før permeabilizing cellene og legge SYTO9 og propidium iodide, ble en Alexa Fluor 647-coupled soya lektin lagt til de infiserte celler til å oppdage ekstracellulære N. gonorrhoeae, og langt-rød fluorescens signal var falsk-farget blå. Derfor, i denne protokollen eksterne levedyktige bakterier vises turkis (blå + grønn) og ekstern nonviable vises magenta (blå + rød). Interne levedyktige bakterier blir grønne bare (pil), og interne ikke-levedyktige bakterier blir røde bare (pilspiss). Det er viktig å merke seg at i infiserte celler, vil den eukaryote cellekjerne bli farget av SYTO9 og propidium jodid ("N", figur 4A). De eksterne levedyktige, eksterne ikke-levedyktige, interne levedyktige, og interne ikke-levedyktige bakterier ble kvantifisert fra fluorescens bilder for å gi prosent av internalisert bakterier ennd prosent levedyktige bakterier i og utenfor vertsceller.

Figur 4B er et representativt bilde av N. gonorrhoeae-smittet nøytrofile behandlet med protokoll 2, ved hjelp av levedyktighet fargestoffer SYTOX Grønne og DAPI. Denne protokollen unngår bruk av propidium-jodid, som fluorescerer i både rødt og ultrafiolette kanaler på fluorescens mikroskop. Alle N. gonorrhoeae flekken med DAPI (blå), men bare bakterier med nedsatt membraner flekken med SYTOX Grønn. Som beskrevet ovenfor, før permeabilizing cellene, ble en Alexa 647 Fluor-koblet soyabønne-lecitin tilsatt til de infiserte celler for å påvise ekstracellulære N. gonorrhoeae, som fluorescens i dette tilfellet er falsk-farget rød. Derfor eksterne levedyktige bakterier vises magenta (rød + blå) og eksterne ikke-levedyktige bakterier vises gul (rød + grønn / blå). Interne levedyktige bakterier vises kun blå (piler), og interne ikke-levedyktige bakterier vises grønne / blå (pilspisser). Deavhengig av den relative intensiteten av DAPI g. SYTOX grønn fluorescens, kan det ikke-levedyktige bakterier synes turkis. I likhet med celler behandlet med propidium iodide og SYTO9, er nøytrofile kjernen farget av SYTOX Grønn og DAPI i Figur 4B (angitt med "N"). Eksponering av infiserte celler til SYTOX Green and DAPI viser den prosentvise internalisering og levedyktigheten til bakteriene i vertsceller, kvantifisert som beskrevet ovenfor for propidium jodid og SYTO9. Resultater fra N. gonorrhoeae-infiserte nøytrofile behandlet ved hjelp SYTOX Grønn og DAPI er sammenlignbare med de som oppnås med propidium iodide og SYTO9 26.

Som vist på figur 4C, er protokoll 3 en tilpasning av protokoll 2, hvori de bakterielle levedyktighet fargestoffer ble kombinert med immunfluorescens for den primære eller azurofile neutrofil granule protein CD63. Dette eksperimentet ble gjennomført for å definere sammensetningen av phagosome avdelinger inside nøytrofile som inneholder levedyktig eller ikke-levedyktig N. gonorrhoeae 26. Denne protokollen krever et mikroskop for fire-farge fluorescens evne til å oppdage levedyktige bakterier, ikke-levedyktige bakterier, ekstracellulære bakterier, og subcellulære markør. Siden levedyktigheten fargestoffer er ikke kompatible med aldehyd fiksering (våre upubliserte observasjoner), utførte vi immunfluorescens uten fiksering, ved hjelp av et antistoff som direkte er koplet til en fluorofor til å minimalisere tiden som er nødvendig for å påvise antigenet inne i cellene. Dette antistoffet er koplet til den røde fluoroforen Alexa Fluor 555. Som i protokoll 2, var levedyktige og ikke-levedyktige bakterier skilles ved hjelp av DAPI og SYTOX Green, henholdsvis, og eksterne bakterier ble farget med Alexa 647 koplet soya lectin. Eksterne bakterier fluoresce langt-rødt og er falsk-farget lilla. Eksterne levedyktige bakterier synes lilla + blå og eksterne ikke-levedyktige bakterier synes lilla + grønn / blå. Interne levedyktige bakterier vises blå (pil) og intersjonelle ikke-levedyktige bakterier blir grønne (pilspiss). CD63-positive granulater og phagosomes vises rødt. Nøytrofile kjernen er farget med DNA spesifikke fargestoffer ("N"). Ved å analysere disse bildene, ble hver enkelt bakterie klassifisert som ekstern g. indre, levedyktig vs ikke-levedyktig, og positiv eller negativ for en ring av CD63 farging. N. gonorrhoeae ble ansett for å ligge i en nøytrofil-CD63-positive phagosome hvis det er ≥ 50% av en ring av CD63 fluorescens omgir bakteriene, og på en CD63-negative phagosome hvis det er <50% av en ring av CD63 fluorescens omgir bakterier . Den ikke-levedyktig intracellulær bakterie som angitt ved pilspiss i Figur 4C er en ring av farging for CD63 omgir bakterier. Denne ringen indikerer primære granulater er beriket på denne phagosome. Den levedyktig intracellulære bakterien, som indikeres av pilen, mangler farging for CD63, som indikerer primære granulat er ikke beriket på sitt phagosome. Vibrukte denne teknikken for å vise en sammenheng mellom levedyktigheten til N. gonorrhoeae og bosted i en primær granule-negative phagosome 26. Fordi denne analysen spor både bakteriell levedyktighet og lokalisering ved hjelp av et protein av interesse, er det mulig å fastslå om ikke-levedyktige, og levedyktige bakterier ligge i samme eller ulike plasseringer. Denne informasjonen gir viktig innledende innsikt i mekanismer som bidrar til at bakterier overlever i vertsceller.

Figur 1
Figur 1. En blanding av levedyktige og ikke-levedyktig N. gonorrhoeae ble utsatt for Alexa 647 Fluor-koplet soyabønne-lecitin, propidium-jodid, og SYTO9 ifølge fremgangsmåte 1, i fravær av vertsceller. Alle bakterier er tilgjengelige for lektin og fluoresce blått. Nonviable bakterier vises blå + rød og ikke-levedyktige bakterier vises blå+ Grønn.

Fig. 2
Figur 2. (AB) Mid-logaritmisk fase N. gonorrhoeae ble utsatt for propidium iodide og SYTO9 som i protokoll 1, med (A) eller uten (B) isopropanol behandling for å drepe bakterier. nonviable bakterier er tilgjengelig for propidium iodide og ser røde ut. Levedyktige bakterier er farget med SYTO9 og synes grønt. (CD) Mid-logaritmisk fase N. gonorrhoeae ble utsatt for DAPI og SYTOX grønt som i protokoll 2, med (C) eller uten (d) isopropanol behandling for å drepe bakteriene. Nonviable bakterier er tilgjengelig for DAPI og SYTOX Grønn og synes blå + grønn. Levedyktige bakterier er farget med DAPI bare og ser bare blå.

alt = "Figur 3" fo: content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50729/50729fig3.jpg" />
Figur 3. (A) Nøytrofile fikk lov til å binde og internal isopropanol-drept N. gonorrhoeae, deretter eksponert for propidium jodid og SYTO9 i henhold til protokollen en. Nonviable bakterier er farget med propidium iodide og ser røde ut. Som alle bakterier er nonviable, ingen SYTO9 positiv, er grønne bakterier oppdaget. (B) Nøytrofile fikk lov til å binde og internal isopropanol-drept N. gonorrhoeae, deretter eksponert for DAPI og SYTOX Grønn ifølge protokoll 2.. Nonviable bakterier er farget med DAPI og SYTOX Grønn og synes blå + grønn. Som alle bakterier er nonviable, ingen DAPI bare, blå bare bakterier oppdages. N etiketter nøytrofile kjernen. Scale bar = 5 mikrometer. Pilspisser angir noen av de ikke-levedyktige bakterier.

i "src =" / files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg "/>
Figur 4. (A) N. gonorrhoeae-infiserte humane neutrofiler ble utsatt for Alexa 647 Fluor-koplede soyabønne-lecitin (false-farget blått), og permeabilized med saponin i nærvær av levedyktigheten fargestoffer propidium jodid (rød), å merke døde bakterier og SYTO9 (grønt), å counterstain levende bakterier. vises Eksterne ikke-levedyktige bakterier blå + rød, synes interne ikke-levedyktige bakterier rød bare, eksterne levedyktige bakterier vises blå + grønn, og interne levedyktige bakterier vises grønt bare. (B) N. gonorrhoeae var merket med DAPI (blå), deretter presentert for nøytrofile. Infiserte celler ble så eksponert for Alexa 647 Fluor-koplede soyabønne-lecitin (false-farget rød) og deretter permeabilized med saponin i nærvær av SYTOX Grønn (grønn) til å merke døde bakterier. Eksterne ikke-levedyktige bakterier vises rødt + grønt, synes interne ikke-levedyktige bakterier grønn + blå, ekstern levedyktig bacrier vises rød + blå, og interne levedyktige bakterier vises kun blå. (C) N. gonorrhoeae-infiserte nøytrofile celler ble prosessert som i B, med unntak av en Alexa 555 Fluor-koblet antistoff mot den nøytrofile primære granule protein CD63 (rødt) ble tilsatt ved tidspunktet for permeabilization. Alexa Fluor 647-soya lektin flekker var falsk-farget lilla. Eksterne ikke-levedyktige bakterier synes lilla + grønn, interne ikke-levedyktige bakterier blir grønne bare, eksterne levedyktige bakterier synes lilla + blå, interne levedyktige bakterier vises kun blå, og CD63 flekker vises rødt. Det innfelte viser CD63 fluorescensen av det området av bildet antydet med den hvite kvadrat. I AC, etiketter N nøytrofile kjernen. Scale bar = 5 mikrometer. Pilspisser indikerer ikke-levedyktige bakterier og piler indikerer levedyktige bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Presenteres her er to protokoller som bruker DNA-binding og levedyktighet fargestoffer i forbindelse med et fluorescerende lectin å identifisere levende og døde bakterier festet til og i humane celler. Siden begge protokollene effektivt diskriminere levende fra døde bakterier, valg av hvilken protokoll som skal brukes avhenger av formålet med forsøket. Den første protokollen bruker propidium iodide å oppdage ikke-levedyktige bakterier og SYTO9 å oppdage intakte bakterier. Vist i figur 4A er et representativt bilde av en protokoll anvendt for humane nøytrofiler infisert med N. gonorrhoeae. Disse fargestoffer ble kombinert med et lektin, soyabønne-agglutinin, til å gjenkjenne det ekstracellulære N. gonorrhoeae, men et fluorescensmerket koplet bakterie-spesifikke antistoff kan brukes som et alternativ. Protokoll 1 avslører lett levedyktigheten til enkeltbakterier, siden utelukkelse av SYTO9 av propidium iodide gjør ikke-levedyktige bakterier fluoresce røde og levedyktige bakterier fluoresce grønt. However, kan denne protokollen ikke kombineres med immunfluorescens for vertsproteiner, på grunn av fluorescens av propidium-jodid i to av de fire kanaler som er tilgjengelige for konvensjonell fluorescens mikroskopi. Derfor ble protokoll 2 utviklet, som bruker SYTOX grønn for å identifisere ikke-levedyktige bakterier og DAPI å detektere den totale bakteriepopulasjon. Et eksempel på N. gonorrhoeae forbundet med og inne i humane neutrofiler og behandlet ved hjelp av SYTOX Green and DAPI er vist i figur 4B, og et eksempel i kombinasjon med immunfluorescens er vist i figur 4C. Foruten tilgjengeligheten av to ekstra fluorescens kanaler, er denne protokollen fordelaktig for bruk av personer med rød-grønn fargeblindhet. Imidlertid kan ikke-levedyktige bakterier fluoresce grønn eller blå-grønne, avhengig av den relative intensiteten av DAPI og SYTOX grønn farging og på bildeinnhentingsparametere. En ulempe ved bruk av DAPI er at det kan lekke fra N. gonorrhoeaei løpet av infeksjon, selv om dette ikke kan være et problem for andre bakterier som Staphylococcus aureus (våre upubliserte observasjoner). For å motvirke dette problemet, ble infiserte celler merket med DAPI sammen med SYTOX grønt etter infeksjon, men intensiteten av atom DAPI farging overmannet fluorescensen av N. gonorrhoeae (våre upubliserte observasjoner). I tillegg til disse to protokoller, kan andre kommersielt tilgjengelige fargestoffer som kan brukes for å vise bakteriell levedyktighet. For eksempel kan karboksyfluorescens succinimidyl ester (CFSE) stemple den totale bakteriepopulasjon, og SYTOX Orange eller Blå kunne identifisere ikke-levedyktige bakterier. Siden den relative effekten av disse prosedyrene, kan variere med bakterien og infiserte celletype, er det viktig at forskere sammenligne ulike levedyktighet fargestoff kombinasjoner i sine infeksjonssystemer.

Foreløpig vi manuelt undersøke hvert bilde oppnådd med disse protokollene å kvantifisere perprosent intern, prosent levedyktighet intracellulært og ekstracellulært, og colocalization med subcellulære markører. Mens automatisert datamaskinbaserte fremgangsmåter kan i teorien brukes til å kvantifisere disse parameterne, kan de bli komplisert ved en hvilken som helst ikke-uniform farging av bakterier med levedyktighet fargestoffer og den sterke fluorescens-signalet av cellekjernen. Dessuten kan definisjonen av bakteriell colocalization med en subcellulære markør må optimaliseres for bakterier, celletype, og da av interesse.

En begrensning av disse protokollene er antagelsen om at permeabilitet til propidium iodide eller SYTOX Green er en sann mål på bakteriell død. Molekylvekten av propidium-jodid-og SYTOX Green er 668,4 Da og 600. Da, respektivt. Disse fargestoffer regnes membran-impermeant og bør ikke få tilgang til bakteriell cytoplasma med mindre bakterier har ureparert membranskade. Imidlertid gjenstår muligheten for at bakterier inn i en tilstand av stasiseller til og med reparere deres membran skader og fortsette å vokse på senere tidspunkt. En annen begrensning er at de protokoller ikke tillater levedyktigheten til de enkelte bakterier som skal spores over tid. Life Technologies anbefaler at vurderinger av bakteriell levedyktighet med propidium-jodid og SYTO9 utføres innen 30 minutter etter eksponering for fargestoffer, ettersom bakteriene vil tape levedyktighet jo lenger de er montert og avbildes ved fluorescens mikroskopi. Infiserte celler merket med DAPI / SYTOX grønt fargestoff kombinasjonen må også bli fotografert raskt etter montering (våre upubliserte observasjoner). Tredje, protokollene er ikke kompatible med vanlig brukte fikseringsteknikker. Metanol eller aceton fiksering vil permeabilize og drepe bakterier assosiert med vertsceller, og aldehyd-baserte fiksativ permeabilize N. gonorrhoeae inne menneskelige nøytrofile til propidium iodide og SYTOX Grønn (upubliserte observasjoner). Dermed bruker disse protokollene krever umiddelbar tilgang til en fluorescens microscope og evnen til å fullføre protokollene i en dag. Endelig er hver av de fargestoffer som brukes i disse protokollene binder dobbelt-trådet nuklein-syrer og bind vert nukleær DNA, så vel som det bakterielle DNA (figur 1). Fordi fluorescens av kjerne-DNA er betydelig lysere enn fluorescens av bakteriell DNA, kan levedyktigheten til bakteriene som er i nærheten til den eukaryote cellekjernen ikke vurderes. Konfokal laser scanning mikroskopi og prelabeling bakterier med DAPI bidrar til å redusere atom fluorescens signal. Fluorescens av kjerne-DNA vil fortsatt være en komplikasjon av disse protokollene til ikke-DNA-bindende bakterielle levedyktighet fargestoffer utvikles.

Til tross for disse begrensninger, protokollene i denne artikkelen gir en følsom måte å vurdere levedyktigheten til de enkelte bakterier festet til og inne i eukaryote celler. Kimtall eller gentamicin-beskyttelse analyser har vært ryggraden i mikrobiell patogenesen forskning. Men de provide en vurdering av bakteriell overlevelse over en potensielt heterogen befolkning. I kontrast til levedyktighet fargestoff protokollen beskrevet her tillater integriteten til de enkelte bakterier som skal undersøkes. Derfor kan forskerne samle data om skjebnen til ekstracellulære vs intracellulære bakterier, bakterier i forskjellige phagosomal typer eller bakterier i en phagosome vs cytoplasma. Tynn-delen transmisjonselektronmikroskopi har ofte blitt brukt for å undersøke gjennomførbarheten av de enkelte bakterier. Mens bakterier som vises elektron-Lucent eller ikke lenger intakt etter TEM er klart nonviable, er det vanskeligere å vurdere om bakterier som beholder noen elektrontettheten i deres cytoplasma er faktisk intakt. I tillegg kan det ta mange timer med elektronmikroskop tid å tilegne seg nok mikrografer å analysere, mens mange laveffekts felt kan være kjøpt fra celler eksponert for fluorescens-basert levedyktighet fargestoffer, også på kort tid gitt for bildeopptak. Mens provided protokollene ble optimalisert med N. gonorrhoeae og primære humane nøytrofile celler, kan de være innrettet til å vurdere levedyktigheten til mange arter av gram-negative og gram-positive bakterier i en rekke celletyper, inkludert alle fagocytisk og nonphagocytic eukaryote celler 5,15-24,26. Bakterielle levedyktighet fargestoffer gir en kraftfull eksperimentell verktøy for å undersøke mekanismer for bakteriell patogenesen i eukaryote celler og evnen til eukaryote celler for å kontrollere bakteriell infeksjon. I fremtiden, disse protokollene vil trolig bli enda mer nyttig med bedre verktøy for automatisert bilde innsamling og prosessering, sammen med utviklingen av bakterielle levedyktighet fargestoffer som er kompatible med aldehyd fiksering og spesifikk for prokaryote celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Asya Smirnov og Laura Gonyar for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd NIH R00 TW008042 og R01 AI097312 til AKCMBJ ble støttet delvis av NIH T32 AI007046.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection Becton Dickinson 367251  
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml Becton Dickinson 366480  
Sterile water for irrigation Baxter 07-09-64-070  
Dextran 500 Sigma 31392  
Sodium Chloride Fisher Scientific S641  
Dextrose Ricca Chemical Company RDCD0200  
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ Thermo Scientific SH3002802  
Ficoll solution GE Healthcare 17-1440-03  
Acetic Acid Fisher Scientific BP2401  
12 mm circular glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
24-well plates Corning Incorporated 3524  
Pooled Human Serum Sigma S7023  
RPMI Mediatech 15-040-CV  
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007103  
Human interleukin-8 R&D Systems 208-IL/CF  
MOPS Sigma M3183  
MgCl2 Fisher Scientific BP214  
Propidium Iodide Life Technologies L7007 or L7012  
SYTO9 Life Technologies L7007 or L7012  
Saponin Fluka Analytical 47036  
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin Life Technologies L-32463  
DAPI Sigma D8417  
SYTOX Green Life Technologies S7020  
Mouse anti-CD63 Developmental Studies Hybridoma Bank H5C6  
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit Life Technologies A20187  
Hemacytometer Bright Line Hausser Scientific 1492  
Forceps EMS 78320  
Sorvall Legend RT + Centrifuge Thermo Scientific 75004377  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Tags

Mikrobiologi immunologi infeksjon kreft biologi genetikk cellebiologi molekylær biologi medisin Biomedical Engineering mikroskopi Confocal Mikroskopi fluorescens bakterier bakterieinfeksjoner og mykoser bakterier infeksjon levedyktighet fluorescens mikroskopi celle bildebehandling
Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, M. B., Criss, A. K.… More

Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (79), e50729, doi:10.3791/50729 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter