Summary
Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.
Abstract
Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Aktuelle Protokolle, um diese Fragen zu beantworten sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl und Gentamicin-Schutztests beurteilen nur die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation und sind nicht in der Lage, einzelne Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen. Elektronenmikroskopie verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen und einzelne Informationen hinsichtlich ihrer Lokalisation in Wirtszellen. Allerdings Bakterien zeigen oft eine Reihe von Elektronendichten, was eine Bewertung der Rentabilität schwierig. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren. Diese Tests wurden ursprünglich entwickelt, um das Überleben von Neisseria gonorrhoeae in primären humanen neutrophilen Granulozyten zu bewerten, sondern sollte einpplicable einem Bakterium-Wirt-Interaktion. Diese Protokolle kombinieren membranpermeablen Fluoreszenzfarbstoffen (SYTO9 und 4 ',6-Diamino-2-phenylindol [DAPI]), die alle Bakterien färben, mit Membran-undurchlässig Fluoreszenzfarbstoffen (Propidiumiodid und SYTOX Grüne), die nur zugänglich sind nicht lebensfähige Bakterien. Vor der eukaryotischen Zelle Permeabilisierung wird ein Antikörper oder fluoreszierenden Reagens zugegeben, um extrazelluläre Bakterien zu identifizieren. So sind diese Tests unterscheiden die Lebensfähigkeit der Bakterien an und innen eukaryotischen Zellen haften. Ein Protokoll wird auch für die Verwendung der Lebensfähigkeit Farbstoffe in Kombination mit fluoreszierenden Antikörpern gegen eukaryotische Zellmarker, um die subzelluläre Lokalisierung von einzelnen Bakterien zu bestimmen. Die in diesem Artikel behandelt bakterielle Lebensfähigkeit Farbstoffe sind eine sensible Ergänzung und / oder Alternative zu traditionellen Mikrobiologie Techniken, um die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien zu bewerten und Informationen, wo Bakterien in Wirtszelle überlebens.
Introduction
Es ist eine dynamische Interaktion und Ko-Evolution zwischen Bakterien und den Gastgebern in dem sie wohnen. Bakterien haben die Einhaltung Organellen, die Sekretion Systeme und / oder die Fähigkeit, Giftstoffe, die ihre produktiven Infektion von Wirts phagocytic und nicht-Fresszellen aktivieren produzieren entwickelt. Die Bakterien müssen auch Erkennung und antimikrobiellen Aktivitäten von dem Immunsystem des Wirts zu kämpfen. Das Immunsystem des Wirts wird der angeborenen und erworbenen Komponenten einschließlich der physikalischen und chemischen Barrieren, Immunzellen, die das Komplementsystem und andere Komponenten, der humoralen Immunität besteht. Während viele Bakterien sind empfindlich gegen Tötung und der Freigabe durch Reaktion der mehrschichtigen Immun haben einige pathogene und opportunistische Bakterien Mechanismen, die eine Vielzahl von Wirtszellen zu infizieren und zu untergraben Freigabe durch die Wirtsimmunantwort 1 entwickelt. Neisseria gonorrhoeae ist ein Beispiel für ein bakterielles Pathogen dass ist sehr geeignet ist, in seiner menschlichen Wirt. N bestehen. gonorrhoeae kolonisiert leicht luminalen Oberflächen der Schleimhaut-Epithelzellen des Urogenitaltrakts, des Rachens, der Bindehaut und Rektum. Colonization löst die reichlich Rekrutierung von Neutrophilen bei Schleimhautstellen. Neutrophile Granulozyten sind professionelle Phagozyten, die eine Vielzahl von antimikrobiellen Prozesse zur Abtötung von Mikroorganismen besitzen, aber N. gonorrhoeae ist in der Lage zu überleben, in der Gegenwart von Neutrophilen 2-5. Verstehen, wie bakterielle Erreger wie N. gonorrhoeae zu untergraben, zu unterdrücken, und die Entführung der Immunantwort, um letztlich in der Regel feindlichen Host-Umgebungen zu überleben, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten.
Versuchsprotokollen häufig verwendet, um bakterielle Überleben in Wirtszellen zu untersuchen sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl in Assays wird eine Population von infizierten Zellen lysiert (z. B. mit einem Detergens whICH die Bakterien resistent sind), um die Bakterien zu befreien. Die Lysate werden verdünnt und auf Agar-basierten Medien ausplattiert und koloniebildende Einheiten in den Lysaten werden für jeden Zeitpunkt und / oder experimentellen Bedingungen aufgeführt. Dieser Ansatz berichtet die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation, ist aber nicht in der Lage, die Unterscheidung zwischen intra-und extrazelluläre Überleben. Eine Variation der Koloniezahl-Assay, der Gentamicin-Schutz-Assay misst speziell intrazelluläre Überleben der Bakterien, basierend auf der Unfähigkeit der Antibiotika Gentamicin, die eukaryotische Zellmembran 6 kreuzen. Allerdings ist dieser Test von den Bakterien empfänglich für die Tötung von Gentamicin (oder einem anderen Antibiotikum, das ähnlich eukaryotischen Membran impermeant ist) und die Unfähigkeit des Antibiotikums, um den Zugriff auf interne Bakterien. Daher kann ein Gentamicin-Schutz-Assay nicht effektiv zur Prüfung aller Bakterienarten oder bei der Prüfung überlebenden Bakterien in hochpinocytic Zellen wie Neutrophilen. Keiner dieser Ansätze zeigt die subzelluläre Lokalisation oder andere Verhalten einzelner Bakterien (z. B. wenn die Bakterien bilden Aggregate oder Mikrokolonien, die unterschiedlich von einzelnen Bakterienzellen verhalten). Eine andere häufig verwendete Ansatz, um die Lebensfähigkeit der einzelnen internen und externen Bakterien zu untersuchen ist dünn Schnitt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Diese Vorgehensweise ist, dass sie Informationen über die Lage der Bakterien in Wirtszellen (zB Phagosom, Zytoplasma, Autophagosom), die durch Immunelektronenmikroskopie mit Gold-gekoppelten Antikörper gegen subzellulärer Marker untersucht werden kann vorteilhaft. Allerdings ist die Elektronenmikroskopie nicht besonders bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien empfindlich. Wenn eingebetteten Abschnitte mit Uranylacetat, Bleicitrat oder andere elektronendichte Reagenzien gefärbt und mittels Elektronenmikroskopie abgebildet sind elektronendichte Bakterien lebensfähig und als elektrotron-Lucent nicht lebensfähigen 7,8. Überschätzt jedoch diese Annahme Lebensfähigkeit der Bakterien, da nur jene toten Bakterien mit schwer gestört Membranen und frei von Zytoplasma elektronenleuchtenden angezeigt. Darüber hinaus können einige Bakterienarten eine Reihe von Elektronendichten in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsphase anzuzeigen, was es schwierig macht, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen.
Als Alternative oder zusätzlich zu diesen verbreiteten Methoden hier stellen wir Protokolle und Gründe für die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die Lebensfähigkeit der Bakterien zeigen, um das Überleben von Bakterien, die an und von Wirtszellen internalisiert zu beurteilen. Extrazelluläre Bakterien zu identifizieren, werden infizierte Zellen zuerst mit einem fluoreszierenden Reagenz, wie ein Lectin oder Bakterien-spezifischen Antikörper ausgesetzt. Die infizierten Zellen werden dann permeabilisiert und DNA-spezifische Farbstoffe, die differentiell zugänglich Bakterien mit intakten Membranen gegen abgebaut, als Ersatz für die Lebensfähigkeit von Bakterien ausgesetzt sind. In der ersten protocol, identifiziert die durchlässige Membran Farbstoff SYTO9 die Gesamtbakterienpopulation, während Propidiumiodid ist nur für jene Bakterien, die Membranen beeinträchtigt haben, und werden daher als nicht lebensfähig. Propidiumiodid und SYTO9 verwendet worden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien in Biofilmen zu bewerten, zu unterscheiden von nicht-pathogenen pathogenen Bakterien und aufzählen tragfähige Wasser übertragene Bakterien 9-12. In der zweiten Protokoll, 4 ', 6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert Gesamt Bakterien, während SYTOX Grün ist nur für den nicht lebensfähigen Bevölkerung. Die Lebensfähigkeit Farbstoffpaare können mit Immunfluoreszenz an Position jedes Bakterium im Vergleich zu einem Protein von Interesse beispielsweise um Bakterien subzelluläre Lokalisierung definieren bestimmen, kombiniert werden. Die Verwendung dieser Assays bietet wichtige Einblicke in die Interaktionen, die in Bakterienabtötung oder Überleben während der Infektion der Wirtszellen führen. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit der BeurteilungN. gonorrhoeae, die innerhalb und primären humanen neutrophilen Granulozyten, auch in verschiedenen Populationen von neutrophilen Phagosomen 5,13,14 angebracht ist. Allerdings können diese Protokolle angewendet werden, um die Lebensfähigkeit von gram-positiven und gram-negative Bakterien in professionellen Phagozyten, nicht-professionellen Phagozyten und Protozoen 15-24 beurteilen.
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Protocol
1. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit Propidiumiodid und SYTO9
- Infect adhärenten Zellen, die bis 12 mm Durchmesser kreisförmigen Deckgläsern in 24-Well-Platten mit Bakterien von Interesse sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln.
- Spülen Zellen einmal vorsichtig in 0,1 M 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS), pH 7,2, enthaltend 1 mM MgCl 2 (MOPS / MgCl 2).
- Zellen, Inkubation für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren.
HINWEIS: Verhaltens steuert mit lebenden und toten Bakterien, in der Abwesenheit von Wirtszellen, um zu zeigen, dass das Lektin oder Antikörper von Interesse bindet alle Bakterien unabhängig von der Rentabilität (Abbildung 1).
- Spülen Zellen zweimal mit MOPS / MgCl 2.
- Saugen medien aus Zellen und 0,5 ml Live / Dead-Färbung Lösung. Live / Dead-Färbung Solution ist 5 uM SYTO9, 30 uM Propidiumiodid und 0,1% Saponin (Endkonzentrationen) in MOPS / MgCl 2.
- Zellen, Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2.
- Invert Deckseite nach unten auf Glasobjektträger und Dichtung mit klarem Nagellack. Verwenden Sie keine Montage Medien.
- Erwerben Sie Bilder innerhalb von 30 min, mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätze mit grünen, roten und dunkelroten Bildaufnahme kompatibel.
HINWEIS: In der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie verwendet werden. Nach 30 min die Fluoreszenzfarbstoffe beginnen, von den Bakterien austreten und die erfassten Daten nicht mehr genau. Bilder in diesem Artikel gezeigt wurden auf einem Nikon Eclipse-E800 aufrecht Fluoreszenzmikroskop mit Hamamatsu Orca-ER Digitalkamera mit Openlab Software erworben. 650 nm und einem Emissionsfilter von 663 - - Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlängen von 590 735 nm detektiert, und Falschfarben blau. 580 nm und einem Emissionsfilter von 600 - - 660 nm Fluoreszenz von Propidiumjodid wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 540 festgestellt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTO9 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt.
- Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien blau + rot erscheinen führen, nicht lebensfähigen Bakterien interne erscheinen nur rot, erscheinen externen lebensfähigen Bakterien blau + grün, und die interne lebensfähigen Bakterien erscheinen nur grün. Graf von Augen die Zahl der Bakterien, die nicht lebensfähig externe, interne nicht lebensfähig, lebensfähige externe und interne lebensfähig sind.
- Die prozentuale externer lebensfähigen Bakterien, indem die Anzahl von externen lebensfähigen Bakterien durch die Gesamtzahl der externen Bakterien (lebensfähigen und nonviLage). Berechnet den Prozentsatz der lebensfähigen Bakterien von internen Teilen der Anzahl der internen lebensfähigen Bakterien durch die Gesamtzahl der inneren Bakterien (lebensfähigen und nicht lebensfähigen) (Abb. 4).
- Es gibt zwei wesentliche Steuerelemente mit diesem Protokoll durchzuführen. Zuerst überprüfen, dass alle nicht lebensfähigen Bakterien sind Propidiumiodid-positiven und alle lebenden Bakterien sind SYTO9-positiv. Ein mittleren logarithmischen Bakterienkultur (in Abwesenheit von irgendeinem Wirtszellen) zu> 95% SYTO9-positiv sein. In Abbildung 2 ist ein mittel logarithmischen Kultur von N. gonorrhoeae (bei 10 8 koloniebildenden Einheiten pro ml) mit Live / Dead Färbelösung inkubiert. Zweitens bestätigen, dass sowohl Propidiumiodid und SYTO9 können permeabilisiert, infizierten Wirtszellen zu gelangen.
- Um eine Bevölkerung von toten Bakterien zu erzeugen, sammeln 2 x 10 8 Bakterien-Kolonien bildenden Einheiten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 70% Isopropanol und sitzen für 10 min. Pellet die Bakterien in einem Mikrofuge einnd waschen die Bakterien zweimal in PBS, um restliche Isopropanol entfernen. Dann folgen die Schritte Protokoll 1,5-1,7. Werden 5 ul Bakteriensuspension auf einen Objektträger und Overlay mit einem Deckglas. Bild Proben wie in Schritt-Protokoll 1.9. Unter diesen Bedingungen sollte 100% der Bevölkerung Propidiumiodid-positiven (Abbildung 2). In einigen Bakterienarten können Propidiumiodid nicht vollständig überwältigen SYTO9 Färbung, und nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen gelb oder orange.
- Für phagozytischen Zellen wie Neutrophile, setzen die Zellen zu Isopropanol abgetötete Bakterien und sicherzustellen, dass 100% der intrazellulären Bakterien Propidiumiodid-positiven (Abbildung 3). Für nonphagocytic Zellen, die toten Bakterien nicht verinnerlichen kann, kann es ausreichen, infizierten Zellen mit Natriumazid oder anderen zell permeant antimikrobielle Mittel vor dem Hinzufügen von Live / Dead-Färbung Lösung zu behandeln.
2. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit SYTOX Green und DAPI
- Etikett Bakterien von Interesse mit 10 &mgr; g / ml DAPI in Morse definiertem Medium 25 für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Zellen infizieren, die haft bis 12 mm runde Glasdeckgläschen in 24-Well-Platten mit DAPI-markierten Bakterien sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln.
- Zellen spülen einmal mit MOPS / MgCl 2.
- Zellen für 10 min Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. Siehe Hinweis im Protokoll 1.3 für Schritt vorgeschlagen Kontrollen.
- Saugen Medien aus Zellen und 0,5 ml 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl 2.
- Zellen, Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2.
- Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min.
HINWEIS: Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 590 detektiert - 650 nm und einem Emissionsfilter von 663 bis 735 nm, und falsch-rot gefärbt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTOX Grün wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. 375 nm-Sperrfilter von 400 nm - DAPI-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 355 festgestellt.
- Grün + blau Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + grün führen, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien interne, externe lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + blau, und die interne lebensfähigen Bakterien blau erscheinen nur (Abbildung 4). Quantifizierung der Prozent der externen und internen Bakterien als in der Protokoll-ste beschrieben1.11 p.
- Die in Protokollschritt 1.12 Kontrollen sollten mit der DAPI / SYTOX Green-Farbstoff-Kombination (Abbildungen 2 und 3) durchgeführt werden.
3. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien Neben subzelluläre Lokalisierung
- Etikett Bakterien von Interesse mit 10 &mgr; g / ml DAPI in Morse definiertem Medium für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Zellen infizieren, die haft bis 12 mm runde Glasdeckgläschen in 24-Well-Platten mit DAPI-markierten Bakterien sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln.
- Zellen spülen einmal mit MOPS / MgCl 2.
- Inkubieren 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. Siehe Hinweis im Protokoll 1.3 für Schritt vorgeschlagen Kontrollen.
- Saugen Medien aus Zellen und Zellen spülen zwei times in MOPS / MgCl 2.
- Inkubieren Zellen mit Alexa Fluor 555-gekoppelten Antikörper gegen subzellulären Marker von Interesse für 20 min in MOPS / MgCl 2, enthaltend 0,2% Saponin.
- Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2.
- Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min.
- Saugen Medien aus Zellen und fügen 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl 2.
- Inkubiere Zellen 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2.
- Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min.
- Erwerben Sie Bilder von Folien innerhalb von 30 min auf Fluoreszenzmikroskop. Siehe Protokoll 1.9 für Schritt Beschreibung Mikroskop, Digitalkamera und Erfassungssoftware.
HINWEIS: Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde mit einem Filter mit Anregungswellenlänge von 590 festgestellt - 650 nm und Emissionsfilter von 663 bis 735 nm und ist falsch-violett gefärbt. Fluoreszenz-f580 nm und einem Emissionsfilter von 600 - - 660 nm ROM Alexa Fluor 555 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 540 festgestellt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTOX Grün wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. 375 nm-Sperrfilter von 400 nm - DAPI-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 355 festgestellt.
- Grün + blau Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien lila + grün erscheinen führen, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien internen, lila + blau erscheinen externen lebensfähigen Bakterien scheinen interne lebensfähigen Bakterien nur blau und subzellulärer Protein scheint rot (Abbildung 4). Quantifizierung der perecent von externen und internen lebensfähigen Bakterien wie in Protokoll beschriebenen Schritte 1.11.
- Die in Protokollschritt 1.12 Kontrollen sollten mit der DAPI / SYTOX Green-Farbstoff-Kombination (Abbildungen 2 und 3) durchgeführt werden.
- InNeben den lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zählung Bakterien, klassifizieren jeweils Bakterien als positiv oder negativ für die Co-Lokalisation mit subzellulärer Marker von Interesse.
- Berechnet den Prozentsatz der lebensfähigen Bakterien, die mit subzellulären Marker durch Dividieren der Anzahl der lebensfähigen Bakterien kolokalisiert durch die Gesamtzahl der lebensfähigen Bakterien kolokalisiert. Berechnet den Prozentsatz der nicht lebensfähigen Bakterien, die mit subzellulären Marker indem die Anzahl lebensfähiger Bakterien kolokalisiert durch die Gesamtzahl lebensfähiger Bakterien kolokalisiert.
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Representative Results
Die skizzierten Protokolle wurden verwendet, um das Überleben von N. prüfen gonorrhoeae nach Einwirkung von primären humanen Neutrophilen 5,26. Neutrophile wurden mit N. infiziert gonorrhoeae und verarbeitet mit Protokoll 1, mit dem grün-fluoreszierenden Farbstoff SYTO9 Lebensfähigkeit und die rote fluoreszierende Propidiumiodid (Abbildung 4A). Die Farbstoffe wurden in Gegenwart von Saponin, die Cholesterin sequestriert, um vorzugsweise permeabilisiert Wirtszellplasmamembranen, nicht aufgenommen N. gonorrhoeae Membranen. Andere Detergenzien können, müssen getestet werden, wenn die Membranen der Bakterien von Interesse enthalten hohe Mengen an Cholesterin. Alle N. gonorrhoeae Fleck mit SYTO9, sondern nur Bakterien mit geschwächtem Membranen Fleck mit Propidiumiodid. Die Propidiumiodid windet die SYTO9 Fluoreszenz, so erscheinen lebenden Bakterien grün und tote Bakterien rot erscheinen 27. In einigen Bakterienarten, Propidiumiodid nicht vollständig SYTO9 stainin überwindeng, was zu toten Bakterien erscheinen, gelb oder orange. Das Verhältnis von Propidiumiodid auf SYTO 9. Mai müssen für verschiedene Bakterienarten optimiert werden. Vor der Zugabe von Zellen durchdringbar und SYTO9 und Propidiumiodid wurde ein Alexa Fluor 647-gekoppelten Sojabohnenlectin zu den infizierten Zellen gegeben, um extrazelluläre N. erkennen gonorrhoeae und die weit rote Fluoreszenz-Signal war falsch-farbig blau. Somit wird in diesem Protokoll externen lebensfähigen Bakterien erscheinen türkis (blau + grün) und nicht lebensfähig erscheinen externen Magenta (blau + rot). Interne lebensfähigen Bakterien erscheinen nur grün (Pfeil), und nicht lebensfähigen Bakterien internen rot erscheinen nur (Pfeilspitze). Es ist wichtig zu beachten, dass in infizierten Zellen, wird die eukaryotischen Zellkern durch SYTO9 und Propidiumiodid ("N", 4A) gefärbt werden. Die externen lebensfähig, nicht lebensfähige externe, interne lebensfähigen und nicht lebensfähigen internen Bakterien wurden von Fluoreszenzbildern quantifiziert, um den Prozentsatz der internalisierten Bakterien einer Ausbeutend die lebensfähigen Bakterien Prozent innerhalb und außerhalb von Wirtszellen.
Fig. 4B ist ein repräsentatives Bild von N. gonorrhoeae-infizierten Neutrophilen mit Protokoll 2 verarbeitet, über die Lebensfähigkeit Farbstoffe SYTOX Grüne und DAPI. Dieses Protokoll vermeidet die Verwendung von Propidiumiodid, die in beiden roten und ultravioletten Kanäle auf dem Fluoreszenzmikroskop fluoresziert. Alle N. gonorrhoeae Fleck mit DAPI (blau), sondern nur Bakterien mit geschwächtem Membranen Fleck mit SYTOX Green. Wie oben beschrieben, vor Permeabilisierung der Zellen wurde ein Alexa Fluor 647-gekoppelten Sojabohnenlectin zu den infizierten Zellen gegeben, um extrazelluläre N. erkennen gonorrhoeae, deren Fluoreszenz in diesem Fall falsch-rot gefärbt. Daher erscheinen externen lebensfähigen Bakterien Magenta (rot + blau) und nicht lebensfähigen Bakterien externen erscheinen gelb (rot + grün / blau). Interne lebensfähigen Bakterien blau erscheinen nur (Pfeile), nicht lebensfähige Bakterien und interne erscheinen grün / blau (Pfeilspitzen). DeAbhängig von der relativen Intensität der DAPI vs SYTOX Grüne Fluoreszenz, kann nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen Türkis. Ähnliche Zellen mit Propidiumiodid und SYTO9 verarbeitet wird, wird der Kern durch neutrophile SYTOX Grün und DAPI in 4B (mit "N" bezeichnet) gefärbt. Die Exposition von infizierten Zellen SYTOX Grüne und DAPI zeigt die Internalisierung Prozent und die Lebensfähigkeit der Bakterien in Wirtszellen, quantifiziert, wie oben für Propidiumiodid und SYTO9 beschrieben. Ergebnisse aus N. gonorrhoeae infiziert Neutrophilen verarbeitet mit SYTOX Grün und DAPI vergleichbar sind mit Propidiumiodid und SYTO9 26 erhalten.
Wie in 4C dargestellt ist, ist eine Anpassung Protokoll 3 des Protokolls 2, bei dem die bakterielle Lebensfähigkeit wurden mit Immunfluoreszenzfarbstoffe für die primären oder azurophile Neutrophilen-Körnchenprotein CD63 kombiniert. Dieser Versuch wurde, um die Zusammensetzung der Phagosomen Kammern definieren geführt inside Neutrophilen, die lebensfähig oder nicht lebensfähig N. enthalten gonorrhoeae 26. Dieses Protokoll erfordert ein Mikroskop zur Vier-Farben-Fluoreszenz-Fähigkeit, um lebensfähige Bakterien, nicht lebensfähige Bakterien, extrazellulären Bakterien und subzellulärer Marker zu erkennen. Da die Lebensfähigkeit Farbstoffe sind nicht mit Aldehyd-Fixierung (unsere unveröffentlichte Beobachtungen) kompatibel ist, führten wir Immunofluoreszenz ohne Fixierung unter Verwendung eines Antikörpers direkt an ein Fluorophor gekoppelt ist, um die benötigte Zeit, um das Antigen in Zellen detektieren zu minimieren. Dieser Antikörper wird mit dem roten Fluorophor Alexa Fluor 555 gekoppelt. Wie in Protokoll 2 wurden lebensfähigen und nicht lebensfähigen Bakterien mittels DAPI und SYTOX Grün zu unterscheiden sind, und externe Bakterien wurden mit Alexa 647-gekoppelten Sojabohnenlectin gefärbt. Externe Bakterien fluoreszieren rot und weit sind falsch-violett gefärbt. Externe lebensfähigen Bakterien erscheinen blau + lila und nicht lebensfähigen Bakterien externen lila + grün / blau erscheinen. Interne lebensfähigen Bakterien blau (Pfeil) und inter erscheinennal nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen grün (Pfeilspitze). CD63-positiven Granula und Phagosomen erscheinen rot. Die Neutrophilen-Kern ist mit den DNA spezifische Farbstoffe ("N") gefärbt. Bei der Analyse dieser Bilder wurde jedes einzelne Bakterium als externe und interne, lebensfähigen vs nicht lebensfähig, und positiv oder negativ für einen Ring von CD63-Färbung. N. klassifiziert gonorrhoeae wurde als in einer neutrophilen CD63-positiven phagosome befinden, wenn es ≥ 50% aus einem Ring von CD63-Fluoreszenz Umgebung der Bakterien, und eine CD63-negative phagosome wenn <50% aus einem Ring von CD63-Fluoreszenz Umgebung der Bakterien . Die nicht lebensfähigen intrazelluläres Bakterium durch die Pfeilspitze in 4C angegeben hat einen Ring der Färbung für CD63 rund um die Bakterien. Dieser Ring zeigt an Primärgranulat an diesem phagosome bereichert. Die lebensfähige intrazelluläres Bakterium, durch den Pfeil angedeutet, fehlt Färbung für CD63, was Primärgranulat nicht an seinem phagosome angereichert. Wirverwendet diese Technik, um eine Korrelation zwischen der Überlebensfähigkeit von N. zeigen gonorrhoeae und den Aufenthalt in einem primären Granulat-negative phagosome 26. Da dieser Assay verfolgt sowohl bakterielle Lebensfähigkeit und Lokalisierung unter Verwendung eines Proteins von Interesse, ist es möglich, festzustellen, ob nicht-lebensfähige und lebensfähige Bakterien in demselben oder verschiedenen Orten. Diese Informationen liefert wichtige erste Einblicke in Mechanismen, die zu bakteriellen Überleben in Wirtszellen beitragen.
Fig. 1 ist. Eine Mischung aus lebensfähigen und nicht lebensfähigen N. gonorrhoeae wurde nach Protokoll 1 zu dem Alexa Fluor 647-gekoppelten Sojabohnenlectin Propidiumiodid und SYTO9 ausgesetzt, in der Abwesenheit von Wirtszellen. Alle Bakterien sind zugänglich für die Lektin und fluoreszieren blau. Nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen blau + rot und nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen blau+ Grün.
2. (AB) Mid-logarithmischen Phase N. gonorrhoeae wurde wie in Protokoll 1 bis Propidiumiodid und SYTO9 ausgesetzt sind, mit (A) oder ohne (B) Isopropanol Behandlung, um die Bakterien zu töten. nicht lebensfähigen Bakterien zugänglich sind Propidiumiodid und erscheinen rot. Lebensfähige Bakterien mit SYTO9 gefärbt und erscheinen grün. (CD) Mid-logarithmischen Phase N. gonorrhoeae wurde wie in Protokoll Nr. 2 zum DAPI und SYTOX Grün ausgesetzt sind, mit (C) oder ohne (D) Isopropanol Behandlung, um die Bakterien zu töten. Nicht lebensfähigen Bakterien zugänglich sind DAPI und SYTOX Grün und erscheinen blau + grün. Lebensfähige Bakterien werden nur mit DAPI gefärbt und erscheinen nur blau.
3. (A) Neutrophile wurden erlaubt zu binden und zu verinnerlichen Isopropanol getötet N. gonorrhoeae, dann auf Propidiumiodid und SYTO9 nach Protokoll 1 freigelegt. Nicht lebensfähigen Bakterien mit Propidiumiodid gefärbt und erscheinen rot. Wie alle Bakterien sind nicht lebensfähig, keine SYTO9 positive, grün Bakterien nachgewiesen werden. (B) Neutrophile wurden erlaubt zu binden und zu verinnerlichen Isopropanol getötet N. gonorrhoeae, dann DAPI und SYTOX Grün nach Protokoll 2 ausgesetzt. Nicht lebensfähigen Bakterien mit DAPI und SYTOX Grün gefärbt und erscheinen blau + grün. Wie alle Bakterien sind nicht lebensfähig, nicht nur DAPI, blau nur Bakterien nachgewiesen werden. N kennzeichnet die Neutrophilen-Kern. Maßstabsbalken = 5 um. Pfeilspitzen zeigen einige der nicht lebensfähigen Bakterien.
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4. (A) N. gonorrhoeae-infizierten menschlichen Neutrophilen wurden Alexa Fluor 647-gekoppelten Sojabohnenlectin (false farbenen blau) ausgesetzt, dann mit Saponin in der Gegenwart der Lebensfähigkeit permeabilisiert färbt Propidiumiodid (rot), den toten Bakterien zu kennzeichnen, und SYTO9 (grün), zu lebenden Bakterien Gegenfärbung. Externe nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen blau + rot, nicht lebensfähigen Bakterien internen rot erscheinen nur, externe lebensfähigen Bakterien blau + grün angezeigt werden, und interne lebensfähigen Bakterien erscheinen nur grün. (B) N. gonorrhoeae wurde mit DAPI (blau) markiert, dann auf Neutrophilen vorgestellt. Infizierte Zellen wurden dann auf Alexa Fluor 647-gekoppelten Sojabohnenlectin (false farbenen rot), dann mit Saponin in Gegenwart von SYTOX Green (grün), um tote Bakterien beschriften permeabilisiert ausgesetzt. Externe nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + grün, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien internen grün + blau, externe tragfähige bacrien erscheinen rot + blau, und die interne lebensfähigen Bakterien erscheinen nur blau. (C) N. gonorrhoeae infiziert Neutrophile wurden wie in B verarbeitet werden, mit Ausnahme eines Alexa Fluor 555-gekoppelten Antikörper gegen den Neutrophilen-Primärkörnchenprotein CD63 (rot) wurde zum Zeitpunkt der Permeabilisierung aufgenommen. Die Alexa Fluor 647-Soja-Lektin Färbung war falsch-violett gefärbt. Externe nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen lila + grün, nicht lebensfähigen Bakterien interne erscheinen nur grün, externe lebensfähigen Bakterien lila + blau erscheinen, erscheinen interne lebensfähigen Bakterien nur blau und CD63-Färbung erscheint rot. Der Einschub zeigt die Fluoreszenz von CD63 Bereich der mit dem weißen Quadrat angezeigt Bild. In AC, N kennzeichnet die Neutrophilen Kern. Maßstabsbalken = 5 um. Pfeilspitzen zeigen nicht lebensfähigen Bakterien und Pfeile zeigen lebensfähige Bakterien.
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Discussion
Präsentiert hier sind zwei Protokolle, die DNA-Bindung und Lebensfähigkeit Farbstoffe in Verbindung mit einem fluoreszierenden Lektin zu lebenden und toten Bakterien und menschlichen Zellen im Inneren angebracht identifizieren zu verwenden. Da beide Protokolle effektiv live aus toten Bakterien zu unterscheiden, deren Wahl-Protokoll zu verwenden, hängt von dem Ziel des Experiments. Das erste Protokoll verwendet Propidiumiodid zu nicht lebensfähigen Bakterien und SYTO9 intakte Nachweis von Bakterien zu erkennen. In Abbildung 4A ist ein repräsentatives Bild des Protokolls 1 für die menschliche Neutrophilen mit N. infiziert angewendet gonorrhoeae. Diese Farbstoffe wurden mit einem Lectin, Sojabohnen-Agglutinin kombiniert, um extrazelluläre N. erkennen gonorrhoeae, aber ein fluoreszierend gekoppelt Bakterien-spezifischen Antikörper können als Alternative verwendet werden. Protokoll 1 zeigt leicht die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien, da Ausschluss SYTO9 durch Propidiumiodid macht nicht lebensfähigen Bakterien fluoreszieren rot und lebensfähigen Bakterien fluoreszieren grün. However Dieses Protokoll kann mit Immunfluoreszenz für Wirtsproteine kombiniert werden, aufgrund der Fluoreszenz von Propidiumiodid in zwei der vier Kanäle für konventionelle Fluoreszenzmikroskopie zur Verfügung. Daher Protokoll 2 wurde entwickelt, die SYTOX Grün verwendet, um nicht lebensfähige Bakterien und DAPI zu identifizieren, um die Gesamtbakterienpopulation zu erkennen. Ein Beispiel für N. gonorrhoeae und innen mit menschlichen Neutrophilen assoziiert und mit DAPI SYTOX Grün und verarbeitet, ist in Fig. 4B gezeigt, und ein Beispiel in Verbindung mit Immunfluoreszenz ist in Fig. 4C gezeigt. Neben der Verfügbarkeit von zwei zusätzlichen Fluoreszenzkanälen ist dieses Protokoll für die Nutzung durch Personen mit Rot-Grün-Farbenblindheit vorteilhaft. Jedoch können nicht lebensfähigen Bakterien fluoreszieren grün oder blau-grün, abhängig von der relativen Intensität der DAPI und SYTOX Grünfärbung und auf den Bildaufnahmeparametern. Ein Nachteil bei der Verwendung von DAPI ist, dass es von N. austreten gonorrhoeaewährend der Verlauf der Infektion, obwohl dies nicht ein Problem für andere Bakterien wie Staphylococcus aureus (unsere unveröffentlichte Beobachtungen) sein. Um dieses Problem zu begegnen, infizierten Zellen wurden mit DAPI zusammen mit SYTOX Grün nach der Infektion markiert, aber die Intensität der Kernfärbung DAPI überwältigt die Fluoreszenz von N. gonorrhoeae (unsere unveröffentlichte Beobachtungen). Zusätzlich zu diesen beiden Protokollen auch andere kommerziell erhältliche Farbstoffe verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu offenbaren. Zum Beispiel könnte Carboxyfluoreszein Succinimidylester (CFSE) die Gesamtbakterienpopulation zu markieren, und SYTOX orange oder blau könnte nicht lebensfähigen Bakterien zu identifizieren. Da die relative Wirksamkeit dieser Verfahren können mit dem Bakterium und infizierten Zelltyp variieren, ist es wichtig, dass die Forscher vergleichen verschiedene Lebensfähigkeit Farbstoffkombinationen in ihrer Infektion Systemen.
Derzeit prüfen wir manuell jeweils mit diesen Protokollen erhalten pro Bild, um zu quantifizierenProzent Internalisierung Prozent Lebensfähigkeit intrazellulär und extrazellulär, und Co-Lokalisation mit subzellulären Markern. Während automatisierte Computer-basierte Verfahren kann theoretisch verwendet werden, um diese Parameter zu quantifizieren, können sie durch irgendeine ungleichmßige Färbung der Bakterien, die mit Farbstoffen und Lebensfähigkeit der starken Fluoreszenzsignal des Zellkerns kompliziert sein. Auch kann die Definition von bakteriellen Kolokalisation mit einer subzellulären Marker müssen für die Bakterien, Zelltyp und Marker von Interesse optimiert werden.
Eine Einschränkung dieser Protokolle ist die Annahme, dass die Durchlässigkeit für Propidiumiodid oder SYTOX Green ist ein echter Maßstab für bakterielle Tod. Das Molekulargewicht des Propidiumiodid und SYTOX Grün ist 668,4 Da und 600 Da auf. Diese Farbstoffe werden als Membran-impermeante und sollte nicht auf die bakteriellen Zytoplasma, es sei denn die Bakterien nicht reparierten Membranschäden. Allerdings bleibt die Möglichkeit, dass die Bakterien in einen Zustand der Stasisoder sogar ihre Membranschäden reparieren und weiter zu späteren Zeiten wachsen. Eine zweite Einschränkung ist, dass die Protokolle erlauben nicht die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Laufe der Zeit verfolgt werden. Life Technologies empfiehlt, dass die Einschätzungen der Lebensfähigkeit der Bakterien mit Propidiumiodid und SYTO9 innerhalb von 30 Minuten nach der Einwirkung der Farbstoffe durchgeführt werden, da die Bakterien Lebensfähigkeit verlieren, je länger sie gelagert und durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Infizierte Zellen mit DAPI / SYTOX Green-Farbstoff markiert Kombination muss auch schnell nach der Montage (unsere unveröffentlichte Beobachtungen) abgebildet werden. Drittens sind die Protokolle nicht mit den üblichen Befestigungstechniken kompatibel. Methanol oder Aceton-Fixierung wird permeabilisieren und töten die Bakterien mit Wirtszellen assoziiert und Aldehyd-basierte Fixiermittel permeabilisieren N. gonorrhoeae innerhalb der menschlichen Neutrophilen an Propidiumiodid und SYTOX Green (unveröffentlichte Beobachtungen). Somit mit Hilfe dieser Protokolle sofort die geeigneten Fluoreszenz MICROscope und die Fähigkeit, die Protokolle in einem Tag abgeschlossen. Schließlich ist jeder der in diesen Protokollen verwendeten Farbstoffe binden doppelsträngige Nukleinsäuren binden und Wirtszellkern-DNA als auch die bakterielle DNA (Fig. 1). Da Fluoreszenz der Zellkern-DNA ist deutlich heller als Fluoreszenz der Bakterien-DNA, kann die Lebensfähigkeit der Bakterien, die in der Nähe des eukaryotischen Zellkern nicht beurteilt werden. Die konfokale Laser Scanning Mikroskopie und prelabeling Bakterien mit DAPI dazu beitragen, die Kernfluoreszenzsignal. Fluoreszenz der Zellkern-DNA wird eine Komplikation dieser Protokolle, bis nicht-DNA-bindende Farbstoffe, die Lebensfähigkeit der Bakterien entwickelt.
Trotz dieser Einschränkungen, die Protokolle in diesem Artikel einen sensiblen Weg, um die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien und eukaryotischen Zellen im Inneren angebracht beurteilen. Koloniezahl oder Gentamicin-Schutztests haben das Rückgrat der mikrobiellen Pathogenese Forschung. Doch sie provide eine Bewertung der bakteriellen Überlebens über eine potentiell heterogenen Bevölkerung. Im Gegensatz dazu sind die hier beschriebenen Lebensfähigkeit Farbstoff Protokolle erlauben die Integrität der einzelnen Bakterien untersucht werden. Daher können die Forscher Daten über die Schicksale der extrazellulären gegen intrazelluläre Bakterien, Bakterien in verschiedenen phagosomalen Arten oder Bakterien in einem Phagosom vs Zytoplasma zu sammeln. Dünntransmissionselektronenmikroskopie wurde oft verwendet, um die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien zu untersuchen. Während Bakterien, die Elektronen-Lucent oder nicht mehr intakt durch TEM erscheinen, sind eindeutig nicht lebensfähig, ist es schwierig zu beurteilen, ob Bakterien, die eine Elektronendichte in ihrem Zytoplasma zu behalten sind eigentlich intakt. Zusätzlich kann es viele Stunden Elektronenmikroskop Zeit, auch in der kurzen Zeit für die Bildaufnahme zu treffen, ob genug mikroskopischen Aufnahmen zu analysieren, zu erwerben, während viele Low-Power-Felder können aus Zellen, um die Fluoreszenz-basierten Lebensfähigkeit Farbstoffe ausgesetzt erworben werden. Während die Bestimmungended-Protokolle wurden mit N. optimiert gonorrhoeae und primären humanen Neutrophilen, können sie geeignet ist, die Lebensfähigkeit von vielen Arten von Gram-negativen und gram-positiven Bakterien in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich aller phagozytische und nonphagocytic eukaryotischen Zellen 5,15-24,26 beurteilen. Bakterielle Lebensfähigkeit Farbstoffe bieten eine leistungsfähige experimentelles Werkzeug Mechanismen der bakteriellen Pathogenese in eukaryotischen Zellen und die Fähigkeit der eukaryontischen Zellen um bakterielle Infektion zu kontrollieren untersuchen. In Zukunft sind diese Protokolle wahrscheinlich noch mehr sinnvoll mit besseren Werkzeugen für die automatisierte Bildaufnahme und-verarbeitung, zusammen mit der Entwicklung von bakteriellen Lebensfähigkeit Farbstoffe, die mit Aldehyd-Fixierung kompatibel und spezifisch für Prokaryoten werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir danken Asya Smirnov und Laura Gonyar für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse NIH R00 und R01 TW008042 AI097312 zu AKCMBJ wurde zum Teil durch NIH T32 AI007046 getragen wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
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