Summary
Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.
Abstract
Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu soruları için geçerli protokollerin koloni sayımı tahlilleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı ve gentamisin koruma analizleri, yalnızca tüm bakteri nüfusunun canlılığını değerlendirmek ve bireysel bakteri canlılığını belirlemek mümkün değildir. Elektron mikroskobu ayrı ayrı bakterilerin yaşayabilirliği belirlemek ve ev sahibi hücrelerde lokalizasyon ile ilgili bilgi sağlamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bakteriler sık sık canlılığının değerlendirilmesi zor hale elektron yoğunluklarının bir aralığını gösterir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir. Bu deneyler birincil insan nötrofillerinde Neisseria gonorrhoeae hayatta kalmasını değerlendirmek için ilk olarak geliştirilmiş, ancak bir olmalıbir bakteri konakçı hücre etkileşimine pplicable. Bu protokoller, zar geçirgen floresan boyalar birleştirmek için erişilebilir membran geçirmeyen floresan boyalar (propidyum iyodür ve SYTOX Green) ile, tüm bakterileri leke (SYTO9 ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) cansız bakteri. Önceki ökaryotik hücre nüfuziyet için, bir antikor ya da tepkin madde flüoresan hücre dışı bakteri belirlemek için ilave edilmektedir. Bu nedenle, bu deneyler, ökaryotik hücrelere ve iç yapışık bakteri canlılığı ayırt edebilir. Bir protokol, aynı zamanda ayrı ayrı bakterilerin hücre içi lokalizasyonu belirlemek amacıyla, ökaryotik hücre işaretleyicileri için floresan antikorlar ile kombinasyon halinde canlılığı boyalar kullanılarak sağlanır. Bu makalede açıklanan bakteriyel canlılığı boyalar ayrı ayrı bakterilerin canlılığı değerlendirmek ve bakteri konakçı hücre hayatta burada ile ilgili bilgi sağlamak için, geleneksel teknikler mikrobiyoloji için hassas bir tamamlayıcı ve / veya alternatifs.
Introduction
Dinamik bir etkileşim ve ikamet ettikleri bakteri ve bilgisayarlar arasında işbirliği evrim vardır. Bakteriler bağlılık organellere, salgı sistemleri ve / veya konak fagositik ve fagositik olmayan hücrelerin kendi üretken enfeksiyon etkinleştirmek toksin üretme yeteneği gelişmiştir. Bakteriler de tanıma ve konakçı bağışıklık sisteminin antimikrobiyal aktiviteleri ile uğraşmak gerekir. Ev sahibi, bağışıklık sistemi, fiziksel ve kimyasal engeller, bağışıklık hücreleri, tamamlayıcı sistemin, ve humoral bağışıklık diğer bileşenleri de dahil olmak üzere doğal ve adaptif bileşenden oluşur. Birçok bakteri tabakalı konak immün tepkisi ile öldürülmesi ve temizlik duyarlı olsa da, bazı patojenik ve fırsatçı bakterilerin konakçı hücrelerin çeşitli enfekte ve konak immün cevabı 1 ile açıklık bozmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Neisseria gonorrhoeae bakteriyel patojen bir örneğidir Bu son derece insan konak. Yok inat uyarlanmıştır. gonorrhoeae kolayca ürogenital sistem, yutak, konjonktiva ve rektum mukoza epitelyal hücrelerin luminal yüzeyleri kolonize. Kolonizasyon mukozal sitelerde nötrofillerin bol işe tetikler. Nötrofiller mikroorganizmaları öldürmek için antimikrobiyal süreçlerin çeşitli sahip profesyonel fagositlerdir, ancak, N. gonorrhoeae nötrofillerin 2-5 mevcudiyetinde hayatta kalma yeteneğine sahiptir. Böyle N. nasıl gibi bakteriyel patojenler Anlamak gonorrhoeae, yıkmak bastırmak ve sonuçta normalde düşman konak ortamlarda hayatta kalmak için bağışıklık tepkisini kaçırmak bulaşıcı hastalıklarla mücadele için yeni tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.
Genellikle konakçı hücreler bakteriyel hayatta araştırmak için kullanılan deneysel protokol koloni sayısı deneyleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı deneylerinde, enfekte olmuş hücrelerin bir popülasyonu wh bir deterjan ile, örneğin, (parçalananaich bakteriler bakteri serbest bırakmak için) dirençlidir. Lizatlar seyreltildi ve agar bazlı ortam üzerine plakalanmıştır ve lizatlardaki koloni oluşturucu birim, her bir zaman noktasında ve / veya deney koşulu için numaralandırılır edilir. Bu yaklaşım, tüm bakteri nüfusunun canlılığı bildirir ancak hücre içi ve hücre dışı yaşam arasında ayırım yeteneğine sahip değildir. Koloni sayımı tahlili, gentamisin koruma deneyinde, bir varyasyonu özellikle ökaryotik plazma zarı 6 geçmeye antibiyotik gentamisin yetersizlik dayalı hücre içi bakteri hayatta, ölçer. Bununla birlikte, bu deney, gentamisin (ya da benzer bir ökaryotik membran geçirgen olmayan başka bir antibiyotik) ile iç bakterilere erişmek için antibiyotiğin yetersizlik ile öldürmeye karşı hassas olan bakteri bağlıdır. Bu nedenle, bir gentamisin koruma deneyi, tüm bakteri türlerinin incelenmesi için etkili ya da başka yüksek bakteriyel hayatta incelerkennötrofiller gibi pinocytic hücreleri. (Bakteri agrega ya da farklı bireysel bakteriyel hücrelerden davranır mikrokoloniler formu ise gibi) bu yaklaşımların hiçbiri hücre içi lokalizasyonu ya da ayrı ayrı bakterilerin diğer davranışları ortaya koymaktadır. Tek tek dış ve iç bakteri canlılığı incelemek için sıkça kullanılan bir başka yaklaşım, ince kesitli transmisyon elektron mikroskobu (TEM) 'dir. Bu yaklaşım daha fazla hücre içi işaretleri karşı altın bağlanmış antikorları ile immunoelectron mikroskobu ile incelenmiştir edilebilir konakçı hücrelerde bakterilerin yere (örneğin, fagosom, sitoplazma, autophagosome), ilgili bilgi sağlayabilir avantajlıdır. Bununla beraber, elektron mikroskobu bakteri uygunluğu değerlendirmek özellikle duyarlı değildir. Gömülü bölümler uranil asetat, kurşun sitrat veya diğer elektron yoğun reaktifleri ile boyanmış ve elektron mikroskopi ile görüntülenmiştir zaman, elektron-yoğun bakteri uygun ve elektrik olarak kabul edilirtron-Lucent cansız 7,8. Ancak, bu varsayım ciddi biçimde kesintiye membranların ve sitoplazma yoksun olan sadece bu ölü bakteri beri elektron-Lucent görünür, bakteri canlılığı overestimates. Ayrıca, bazı bakteri türlerinin zor canlılığını belirlemek için yapım büyüme aşamasına bağlı olarak, kendi elektron yoğunluklarının bir aralığını görüntüleyebilir.
Alternatif bir ya da bu yaygın olarak kullanılan yöntemlere ilave olarak olduğu gibi, burada eklenmiş ve konak hücreleri ile içeride bakterilerin hayatta kalmasını değerlendirmek için bakteriyel canlılığı göstermektedir floresan boyaların kullanımı için protokoller ve mantığını sağlar. Hücre dışı bakteriler belirlemek için, enfekte olmuş hücreler, ilk olarak bir lektin ya da bakteri özgü antikor gibi bir flüoresan tepkime maddesi, maruz kalmaktadır. Enfekte edilen hücreler daha sonra geçirgen ve bakteriyel canlılığı için bir vekil olarak, bozulmuş membran vs bozulmamış bakterilere farklı olarak erişilebilir DNA özgü boyalar maruz kalmaktadır. İlk olarak ppropidium iyodür membranlar tehlikeye ve böylece cansız kabul edilen bu bakterilerin sadece erişilebilir ise otokol, membran geçirgen boya SYTO9, toplam bakteri nüfusu tanımlar. Propidium iyodür ve SYTO9, Biyofilmlererde bakteri canlılığı değerlendirmek patojenik bakterilerin patojenik ayrımcılık ve uygulanabilir su-kaynaklı bakteri 9-12 numaralandırmak için kullanılır olmuştur. SYTOX Green cansız nüfusa erişilebilir iken, ikinci protokolde, 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), toplam bakteri tanımlar. Bu canlılığı boya çifti bakteriyel hücre içi lokalizasyonu tanımlamak Örneğin, ilgi konusu bir protein ile ilgili olarak her bir bakterinin yerini belirlemek için bağışıklık ile kombine edilebilir. Bu tahlillerin kullanılması konak hücrelerin enfeksiyonu esnasında bakteri öldürme veya hayatta kalması ile sonuçlanabilir etkileşimler içine önemli bilgiler sağlar. Bu makalede anlatılan protokoller canlılığı ve değerlendirmek için kullanılmıştırNötrofil phagosomes 5,13,14 farklı toplumlarda da dahil olmak üzere temel insan nötrofil, ve içine bağlanmış olup, N. gonorrhoeae. Bununla birlikte, bu protokoller profesyonel fagositlerin, non-profesyonel fagositlerin ve protozoa 15-24 gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerin uygulanabilirliğini değerlendirmek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Propidium iyodür ve SYTO9 ile Bakteriyel Canlılık Değerlendirilmesi
- Ilgi bakteri ile 24 yuvalı plakalar içinde 12 mm çapında yuvarlak cam lameller yapışık olan hücreleri, Infect. Aldehid veya organik çözücüler ile hücreleri tamir yapmayın.
- Bir kez yavaşça hücreleri yıkayın 0.1 M 3 - (N-morfolino) 1 mM MgCI2 (MOPS / MgCI2) ihtiva eden propanesülfonik asit (MOPS), pH 7.2,.
- Dış bakteri tespit etmek için, MOPS / MgCI2 içinde, ilgi konusu bakteriyel türe bağlanan Alexa Fluor 647-bağlı antikor veya lektin, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe hücreleri.
NOT: Davranış ilgilenilen lektin veya antikor (Şekil 1) bağımsız olarak canlılığı tüm bakteri bağlar olduğunu göstermek için, konakçı hücrelerin yokluğunda, canlı ve ölü bakteri ile kontrol eder.
- MOPS / MgCl2 ile hücreler iki kez durulayın.
- Aspire mhücrelerden edia ve 0.5 ml / Canlı Ölü Boyama Çözüm ekleyin. Canlı / Ölü boyama solüsyonu MOPS / MgCI2 içinde 5 uM SYTO9, 30 uM propidyum iyodür ve% 0.1 saponin, (nihai konsantrasyonlar) 'dir.
- Karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- MOPS / MgCl2 içinde hücreler iki kez durulayın.
- Invert lamelleri cam slaytlar üzerine aşağı yüz ve şeffaf tırnak cilası ile mühür. Montaj ortamları kullanmayın.
- Yeşil, kırmızı, ve uzak-kırmızı görüntü alımı ile uyumlu filtre setleri ile bir floresan mikroskop kullanılarak, 30 dakika içinde görüntü kazanır.
NOT: Geleneksel floresan mikroskobu ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılmaktadır olabilir de. 30 dakika sonra, floresan boyalar bakterilerden sızıntı başlar ve edinilen veriler artık doğru. Bu makalede gösterilen Görüntüler openlabın yazılımını kullanarak Hamamatsu Orca-ER dijital kamera ile Nikon Eclipse E800 dik floresan mikroskop elde edildi. 650 nm ve 663 arasında bir emisyon filtresi - - Alexa Fluor 647 floresansı 590 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak saptandı 735 nm ve yanlış renkli mavidir. 580 nm ve 600 arasında bir emisyon filtresi - - 660 nm propidyum iyodür den Floresan 540 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi. 495 nm ve 515 arasında bir emisyon filtresi - - 555 nm SYTO9 gelen floresans 465 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi.
- Bu protokol harici cansız bakteri kırmızı + mavi görünür görüntüleri neden olur, iç cansız bakteri yalnızca kırmızı görünür, dış canlı bakteri yeşil + mavi görünür, ve iç canlı bakteriler sadece yeşil görünür. Gözle dış cansız iç cansız, uygun bir dış ve iç canlı bakteri sayısını saymak.
- Dış bakteri sayısının (harici canlı bakteri sayısının bölünmesiyle dış canlı bakteri yüzde hesaplama uygun artı nonvimümkün). İç bakteri sayısının (canlı artı cansız) (Şekil 4) iç tarafından canlı bakteri sayısının bölünmesiyle iç canlı bakterilerin yüzde hesaplayın.
- Bu protokol ile gerçekleştirmek için iki temel kontroller vardır. Öncelikle, tüm cansız bakteri propidium iyodür-pozitif ve tüm canlı bakteri SYTO9-pozitif olduğunu doğrulamak. (Herhangi bir konakçı hücrelerin yokluğunda) bakterilerin bir orta-logaritmik kültür>% 95 SYTO9 pozitif olmalıdır. N. bir orta-logaritmik bir kültür Şekil 2'de gösterilen, gonorrhoeae Canlı / Ölü boyama solüsyonu ile inkübe (10 8 koloni oluşturan birim başına ml). İkincisi, propidium iyodür ve SYTO9 hem geçirgenleştirilmiştir, enfekte konakçı hücrelerini girebilirsiniz doğrular.
- Ölü bakteri popülasyonu üretmek için, bir 1.5 ml mikrofüj tüpüne oluşturan üniteler 2 x 10 8 bakteri kolonisi toplamak,% 70 izopropanol ekleyin ve 10 dakika boyunca otur. Bir mikrofüj A'daki bakteri Peletnd kalıntı izopropanol çıkarmak için PBS içinde iki kere bakteriler yıkayın. 1.7 - Sonra takip protokolü 1.5 adımları. Bir cam slayt bakteri süspansiyonu 5 ul ilave edin ve bir lamel ile kaplama. Protokolün adım 1.9 olarak görüntü örnekleri. Bu koşullar altında, nüfusun% 100 propidyum iyodür pozitif (Şekil 2) az olmalıdır. Bazı bakteri türlerinde, propidium iyodür tamamen SYTO9 boyanma mahçup olabilir ve cansız bakteri sarı veya turuncu görünebilir.
- Nötrofiller gibi fagositik hücreler için, izopropanol ile öldürülmüş bakterilerin hücreleri ortaya çıkarmak ve hücre içi bakterilerin% 100 propidyum iyodür pozitif (Şekil 3) olduğundan emin olun. Ölü bakteriler özümsemesi olmayabilir nonphagocytic hücreler için, sodyum azit ya da önceden canlı / ölü boyama çözeltisi ilave diğer hücre geçirgenlik antimikrobiyal maddeler ile enfekte hücreleri tedavi etmek için yeterli olabilir.
2. SYTOX Gree ile değerlendirilmesi Bakteriyel Canlılıkn ve DAPI
- Etiket karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Morse tanımlandı Orta 25, 10 ug / ml DAPI ile çıkar bakterileri.
- DAPI-etiketli bakteriler, 24 yuvalı plakalar içinde 12 mm çapında yuvarlak cam lameller yapışık olan hücreleri, Infect. Aldehid veya organik çözücüler ile hücreleri tamir yapmayın.
- MOPS / MgCl2 ile bir kez hücreleri durulayın.
- Dış bakteri tespit etmek için, MOPS / MgCI2 içinde, ilgi konusu bakteriyel türe bağlanan Alexa Fluor 647-bağlı antikor veya lektin ile karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe hücreleri. Önerilen kontroller için protokol adım 1.3 nota bakınız.
- Aspire hücrelerden medya ve MOPS / MgCl2 0.5 ml 0.4 iM SYTOX Yeşil ekleyin.
- Karanlıkta, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- MOPS / MgCl2 içinde hücreler iki kez durulayın.
- 5 dakika boyunca MOPS / MgCI2 hücreler bir kez yıkayın.
Not: Alexa Fluor 647 floresans 590 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edilmiştir - 650 nm ve 663 arasında bir emisyon filtresi - 735 nm, ve yanlış renkli kırmızı. 495 nm ve 515 arasında bir emisyon filtresi - - 555 nm SYTOX Green Fluorescence 465 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi. 375 nm ve 400 nm bariyer filtreden - DAPI gelen floresans 355 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi.
- Bu protokol harici cansız bakteri yeşil + kırmızı görünür görüntüleri neden olur, iç cansız bakteriler mavi + yeşil görünür, dış canlı bakteri mavi + kırmızı görünür, ve iç canlı bakteriler sadece (Şekil 4) mavi görünür. Protokol ste de tarif edildiği gibi, dış ve iç bakterilerin yüzde ölçmekp 1.11.
- Protokolü Adım 1.12 açıklanan kontrol DAPI / SYTOX Green boya kombinasyonu (Şekiller 2 ve 3) ile yapılmalıdır.
3. Hücrealtı yerelleştirme yanı sıra Bakteriyel Canlılık Değerlendirilmesi
- Etiket karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Morse tanımlı bir ortam içinde 10 ug / ml DAPI ile çıkar bakterileri.
- DAPI-etiketli bakteriler, 24 yuvalı plakalar içinde 12 mm çapında yuvarlak cam lameller yapışık olan hücreleri, Infect. Aldehid veya organik çözücüler ile hücreleri tamir yapmayın.
- MOPS / MgCl2 ile bir kez hücreleri durulayın.
- Dış bakteri tespit etmek için, MOPS / MgCI2 içinde, ilgi konusu bakteriyel türe bağlanan Alexa Fluor 647-bağlı antikor veya lektin ile karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Önerilen kontroller için protokol adım 1.3 nota bakınız.
- Aspire hücrelerden medya ve hücreler iki ti durulayınMOPS / MgCI2 içinde mes.
- % 0.2 saponin içeren MOPS / MgCI2 içinde, 20 dakika boyunca çıkar hücre içi göstergesi karşı Alexa Fluor 555-bağlı antikor ile inkübe hücreleri.
- MOPS / MgCl2 içinde hücreler iki kez durulayın.
- 5 dakika boyunca MOPS / MgCI2 hücreler bir kez yıkayın.
- Aspire hücrelerden medya ve MOPS / MgCl2 0.4 mcM SYTOX Yeşil ekleyin.
- Karanlıkta, oda sıcaklığında, hücreler 5 dakika inkübe edin.
- MOPS / MgCl2 içinde hücreler iki kez durulayın.
- 5 dakika boyunca MOPS / MgCI2 hücreler bir kez yıkayın.
- Floresan mikroskop 30 dakika içinde slaytlar görüntü kazanır. Mikroskop, dijital kamera, ve toplama yazılımı açıklaması için protokol adımı 1.9 bakın.
NOT: Alexa Fluor 647 Floresan 590 dalgaboyu bir filtre kullanılarak tespit edildi - 650 nm ve 663 emisyon filtresi - 735 nm, ve sahte renkli mor. Floresan f580 nm ve 600 arasında bir emisyon filtresi - - 660 nm rom Alexa Fluor 555 540 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi. 495 nm ve 515 arasında bir emisyon filtresi - - 555 nm SYTOX Green Fluorescence 465 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi. 375 nm ve 400 nm bariyer filtreden - DAPI gelen floresans 355 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi.
- Bu protokol harici cansız bakteri yeşil + mor görünür görüntüleri neden olur, iç cansız bakteriler mavi + yeşil görünür, dış canlı bakteri mavi + mor görünür, iç canlı bakteriler sadece mavi görünür, ve subselüler protein (Şekil 4), kırmızı görünür. Protokolünde tarif edildiği gibi iç ve dış canlı bakteri perecent 1.11 adımları ölçmek.
- Protokolü Adım 1.12 açıklanan kontrol DAPI / SYTOX Green boya kombinasyonu (Şekiller 2 ve 3) ile yapılmalıdır.
- Içindecanlı ve cansız bakteri sayma ek olarak, ilgi subselüler marker ile ko için pozitif ya da negatif olarak her bakterileri sınıflandırmak.
- Canlı bakteri sayısı ile kolokalize canlı bakteri sayısının bölünmesiyle hücre içi göstergesi ile birlikte lokalize canlı bakterilerin yüzde hesaplayın. Cansız bakteri sayısı ile cansız kolokalize bakteri sayısına bölünmesiyle hücre içi göstergesi ile birlikte lokalize cansız bakterilerin yüzde hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Belirtilen protokoller N. hayatta kalma incelemek için kullanılmıştır gonorrhoeae primer insan maruz kaldıktan sonra 5,26 nötrofil. Nötrofiller N. ile enfekte edildi gonore ve yeşil floresan canlılığı boya SYTO9 ve kırmızı floresan propidiyum iyodür (Şekil 4A) kullanılarak, protokolü 1 ile işlenir. Boyalar tercihen ev sahibi hücre, plazma zarının değil, N. geçirgenliği için kolesterol tecrit saponin varlığında ilave edildi gonorrhoeae membranlar. Ilgi konusu bakteri zarlar kolesterol yüksek miktarda ise diğer deterjanlar test edilmesi gerekebilir. Tüm N. SYTO9 ile gonorrhoeae leke ama tehlikeye membran ile tek bakteri propidyum iyodid ile boyanır. Propidium iyodür SYTO9 floresan üstesinden, böylece canlı bakteri yeşil ve ölü bakteriler 27 kırmızı gibi görünür. Bazı bakteri türlerinde, propidium iyodür tamamen SYTO9 lekelenme üstesinden olmayabilirg, ölü bakteri edilen sarı veya portakal rengi görünen. SYTO 9 propidiyum iyodür oranı, farklı bakteri türleri için optimize edilmesi gerekebilir. Hücreleri geçirimli öncesinde ve SYTO9 ve propidyum iyodür ilave bir Alexa Fluor 647-bağlı soya lektin hücre dışı N. tespit etmek için enfekte olmuş hücrelere ilave edildi gonorrhoeae ve uzak-kırmızı floresan sinyal mavi sahte renkli oldu. Dolayısıyla, bu protokol harici canlı bakteri turkuaz (mavi + yeşil) görünür ve dış cansız eflatun (mavi + kırmızı) görünür. İç canlı bakteri yeşil yalnızca (ok) görünür ve iç cansız bakteri yalnızca kırmızı (ok başı) görünür. Enfekte hücrelerde, ökaryotik hücre çekirdeği SYTO9 ve propidyum iyodür ("N", Şekil 4A) ile boyanmış olması dikkat etmek önemlidir. Harici uygun, dış cansız iç uygun ve iç cansız bakteri bakteri içsel bir yüzdesini elde etmek için floresan görüntülerden ölçüldünd konak hücreleri içinde ve dışında yüzde canlı bakteri.
Şekil 4B N. temsilcisi görüntü canlılığı boyalar SYTOX Yeşil ve DAPI kullanarak, protokol 2 ile işlenmiş nötrofiller gonore ile enfekte. Bu protokol, floresan mikroskop hem de kırmızı ve ultraviyole kanallarda fluoresces propidyum iyodür kullanımını önler. Tüm N. gonorrhoeae DAPI (mavi) ile leke, fakat tehlikeye membranlar sadece bakteri SYTOX Green ile leke. Hücreleri geçirimli önce, yukarıda tarif edildiği gibi, bir Alexa Fluor 647-bağlı soya lektin hücre dışı N. tespit etmek için enfekte olmuş hücrelere ilave edildi kimin floresan bu durumda sahte renkli kırmızı gonorrhoeae. Bu nedenle, dış canlı bakteri görünür kırmızı (kırmızı + mavi) ve dış cansız bakteri (yeşil / mavi, kırmızı + sarı) görünür. İç canlı bakteriler mavi yalnızca (oklar), görünür ve iç cansız bakteri, mavi / yeşil (ok başları) görünür. DeSYTOX Yeşil floresan vs DAPI'nin nispi yoğunluğu bekleyen, cansız bakteri turkuaz görünebilir. Propidium iyodür ve SYTO9 ile işlenen hücrelere benzer şekilde, nötrofil çekirdek ("N" ile gösterilir) Şekil 4B'de SYTOX Green ve DAPI ile boyanmış edilir. SYTOX Green ve DAPI ile enfekte olmuş hücrelerin maruz propidyum iyodür ve SYTO9 için yukarıda tarif edildiği gibi ölçülmüştür konakçı hücrelerde yüzde içselleştirme ve bakterilerin canlılığı, ortaya koymaktadır. N. sonuçları gonorrhoeae ile enfekte edilmiş nötrofiller SYTOX Green ve DAPI propidyum iyodür ve SYTO9 26 ile elde edilen ile karşılaştırılabilir kullanılarak işlenir.
Şekil 4C'de gösterildiği gibi, protokol 3 bakteriyel canlılığı boyalar, birincil ya da Azürofilik nötrofil granül protein CD63 için bağışıklık ile kombine edildiği, protokol 2'nin bir uyarlamasıdır. Bu deney, fagosom bölmelerin kompozisyon tanımlamak amacıyla yapılmıştır icanlı veya cansız N. içeren nside nötrofiller gonorrhoeae 26. Bu protokol canlı bakteri, cansız bakteri, hücre dışı bakteriler, ve subsellüler işaretleyici algılamak için dört renkli floresan yeteneği için bir mikroskop gerektirir. Canlılığı boyalar aldehit tespit (yayınlanmamış gözlemler) ile uyumlu değildir, biz hücreleri içinde antijeni tespit etmek için gerekli olan zamanı en aza indirmek için, doğrudan bir florofor bağlanmış bir antikor kullanılarak, sabitleme olmaksızın immünofloresan gerçekleştirilir. Bu antikor kırmızı florofor Alexa Fluor 555 ile birleştirilir. Protokol 2'de olduğu gibi, canlı ve cansız bakteriler sırasıyla, DAPI ve SYTOX Yeşil kullanılarak ayırt edildi ve dış bakteri Alexa 647 çiftli soya lektini kullanılarak boyandı. Harici bakteri uzak-kırmızı floresan ve yanlış renkli mor. Dış canlı bakteri + mavi, mor ve dış cansız bakteri, mavi / yeşil + mor gibi görünür. İç canlı bakteriler mavi (ok) ve inter görünürnal cansız bakteri yeşil (ok) görünür. CD63-pozitif granüller ve phagosomes kırmızı görünür. Nötrofil çekirdeği DNA özel boyalarla ("N") ile boyandı. Bu görüntüleri analiz ederken, her bir bakteri, dış vs iç, cansız vs canlı, pozitif ve CD63 boyanma bir halka için negatif. N. olarak sınıflandırılmış gonorrhoeae bakteri çevresindeki CD63 floresans bir halka ≥% 50 olup, bir CD63-pozitif nötrofil fagozomun ikamet olarak kabul edilmiş ve bir CD63-negatif fagozomun bakterileri çevreleyen CD63 floresans bir halka <% 50 olması durumunda . Şekil 4C'de ok ile gösterilen cansız hücre içi bakteri bakteri çevresindeki CD63 için boyama bir halkası vardır. Bu halka primer granüller bu fagozomun de zenginleştirilmiştir gösterir. , Ok ile gösterilen uygun bir hücre içi bakteri, birincil tanecikler kendi fagozomun olarak zenginleştirilmiş değildir gösteren, CD63 için boyama yoksundur. BizN. canlılığı arasında bir korelasyon göstermek için bu tekniği kullanılır gonore ve primer granül-negatif fagozomun 26 residence. Bu deney, ilgi konusu bir protein kullanılarak canlılığı ve bakteriyel lokalizasyonu her iki parça için, cansız ve canlı bakteri, aynı veya farklı yerlerde bulunan olmadığını belirlemek mümkündür. Bu bilgiler konak hücrelerde bakteriyel hayatta kalmasına katkıda mekanizmalarına önemli ilk fikir verir.
Şekil 1. Canlı ve cansız N. A mix gonorrhoeae konakçı hücrelerin yokluğunda, 1 protokolüne uygun olarak Alexa Fluor 647-bağlı soya lektin, propidyum iyodür ve SYTO9 maruz bırakılmıştır. tüm bakteriler lektin için erişilebilir ve mavi floresan. Cansız bakteri, mavi + kırmızı ve cansız bakteri mavi gibi görünür+ Yeşil.
Şekil 2. (AB) Orta-logaritmik faz N. gonore (A) ile veya bakterileri öldürmek için (B) izopropanol tedavi olmadan, protokolü 1 olarak propidium iyodür ve SYTO9 maruz kalmıştır. cansız bakteri propidiyum iyodür erişilebilir ve kırmızı görünür. Canlı bakteri SYTO9 ile boyandı ve yeşil görünür. (CD) Orta-logaritmik faz N. gonore (C) veya bakterileri öldürmek için (D) izopropanol tedavi olmadan, protokol 2 gibi DAPI'nin ve SYTOX Green maruz kalmıştır. Cansız bakteri DAPI'nin ve SYTOX Green erişilebilir ve yeşil + mavi görünür. Canlı bakteriler sadece DAPI ile boyanmış ve mavi sadece görünür.
Şekil 3,. (A) Nötrofiller izopropanol-öldürdü N. bağlamak ve içselleştirmek için izin verildi gonorrhoeae, daha sonra protokol 1'e göre propidium iyodür ve SYTO9 maruz. Cansız bakteri Propidyum iyodür ile boyanmış ve kırmızı görünür. Tüm bakteriler cansız olduğundan, yeşil bakteriler olumlu hiçbir SYTO9 tespit edilir. (B) Nötrofiller izopropanol-öldürdü N. bağlamak ve içselleştirmek için izin verildi gonorrhoeae, daha sonra protokol 2'ye göre DAPI ve SYTOX Green maruz. Cansız bakteri DAPI'nin ve SYTOX Green ile boyanmış ve mavi + yeşil görünür. Tüm bakterilerin cansız olduğu için, hiçbir DAPI sadece mavi sadece bakteri tespit edilir. N, nötrofil çekirdeği etiketler. Ölçek çubuğu = 5 um. Ok uçları cansız bazı bakteri göstermektedir.
in "src =" / files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg "/>
Şekil 4. (A) N. gonorrhoeae ile enfekte edilmiş insan nötrofil Alexa Fluor 647-bağlı soya lektin (mavi renkli false) maruz bırakıldı, daha sonra yaşayabilirliği varlığında, saponin ile geçirgenleştirir hale ölü bakteri etiketlemek için, propidyum iyodür (kırmızı) boyar maddeler ve SYTO9 (yeşil), canlı bakteri counterstain için. Dış cansız bakteri kırmızı + mavi, iç cansız bakteri dış canlı bakteri yeşil + mavi görünür, sadece kırmızı görünür, ve iç canlı bakteriler sadece yeşil gibi görünür. (B) N. gonorrhoeae DAPI (mavi) ile etiketlenmiş, daha sonra nötrofiller için sunulmuştur. Enfekte hücreler, daha sonra ölü bakteri etiket SYTOX Green (yeşil) varlığında, saponin ile geçirgenleştirir hale Alexa Fluor 647-bağlı soya lektin (false renkli kırmızı), maruz bırakılmıştır. Dış cansız bakteri yeşil + kırmızı görünür, iç cansız bakteri yeşil + mavi, dış yaşayabilir Bac görünürteria mavi + kırmızı görünür, ve iç canlı bakteriler sadece mavi görünür. (C) N. gonorrhoeae enfekte nötrofillerin CD63 (kırmızı) nüfuziyet zamanında ilave edildi, nötrofil birinci granül proteine karşı bir Alexa Fluor 555-bağlı antikor hariç, B'de olduğu gibi işlendi. Alexa Fluor 647-soya lektin boyama yanlış renkli mor oldu. Dış cansız bakteri yeşil + mor, iç cansız bakteri dış canlı bakteri mavi + mor görünür, sadece yeşil gibi görünür, iç canlı bakteriler sadece mavi görünür, ve CD63 boyama kırmızı görünür. Ilave beyaz bir kare ile gösterilen görüntünün alanının CD63 floresan gösterir. AC olarak, N nötrofil çekirdeği etiketler. Ölçek çubuğu = 5 um. Ok uçları cansız bakteri ve oklar yaşayabilir bakteri işaret etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA, insan hücrelerine ve içine bağlanmış canlı ve ölü bakteri belirlemek için bir flüoresan lektin ile bağlantılı olarak bağlanması ve canlılığı boyalar kullanan iki protokol burada sunulmuştur. Her iki protokol etkili ölü bakteri canlı ayırmak için, kullanımı protokol seçimi denemenin hedefi bağlıdır. Birinci protokol cansız bakteri ve sağlam bakteri tespit etmek için tespit SYTO9 propidiyum iyot kullanmaktadır. Şekil 4A'da gösterilen N bulaşmış insan nötrofillerinden uygulanan protokol 1 bir temsili resimdir gonorrhoeae. Bu boyalar, hücre dışı N. tanımak için, bir lektin, soya agglutinin ile birleştirildi gonorrhoeae, ancak bir floresan bağlanmış bakteri özgü antikor bir alternatif olarak kullanılabilir. Propidyum iyodür tarafından SYTO9 dışlanması cansız bakteri, kırmızı ve canlı bakteri yeşil floresan floresan yapar beri Protokolü 1. kolaylıkla bireysel bakterilerin canlılığı ortaya koymaktadır. However, bu protokol nedeniyle geleneksel floresan mikroskobu için kullanılabilen dört kanal ikisinde propidyum iyodür floresansla, ana proteinler için bağışıklık ile birleştirilemez. Bu nedenle, protokol 2 toplam bakteri nüfusu tespit etmek için cansız bakteri ve DAPI tanımlamak için SYTOX Yeşil kullandığı, hangi geliştirilmiştir. N. bir örneği gonorrhoeae ve insan nötrofil iç bağlantılı ve SYTOX Green ve DAPI kullanılarak işlenir Şekil 4B'de gösterilmektedir ve bağışıklık ile bir arada bir örnek Şekil 4C'de gösterilmektedir. Iki ek floresan kanal durumu yanı sıra, bu protokol, kırmızı-yeşil colorblindness sahip kişiler tarafından kullanım için avantajlıdır. Ancak, cansız bakteri DAPI ve SYTOX Yeşil boyanması nispi yoğunluğuna ve görüntü elde etme parametrelere bağlı olarak, yeşil veya mavi-yeşil floresan olabilir. DAPI kullanımı için bir dezavantajı, N. sızabilir olmasıdır gonorrhoeaeenfeksiyon sırasında, her ne kadar bu tür Staphylococcus aureus (yayınlanmamış gözlemler) gibi diğer bakteriler için bir sorun olmayabilir. Bu sorunu ortadan kaldırmak için, enfekte olmuş hücreler, enfeksiyondan sonra SYTOX Green ile birlikte DAPI ile etiketlenmiş, ancak nükleer DAPI boyama yoğunluğu N. floresan overpowered gonore (yayınlanmamış gözlemler). Bu iki protokollere ek olarak, diğer ticari olarak temin edilebilen boya bakteriyel canlılığı ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Örneğin, carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE) toplam bakteri nüfusu etiket olabilir ve SYTOX Turuncu veya Mavi cansız bakteri tespit olabilir. Bu işlemlerin nispi etkinliği, bakteri ve enfekte olan hücre tipine bağlı olarak değişebilir bu yana, araştırmacılar, enfeksiyon sistemlerinde farklı canlılığı boya kombinasyonları karşılaştırmak önemlidir.
Şu anda, biz el bu protokolleri ile elde edilen her görüntü başına ölçmek için incelemekcent içselleştirme, hücre ve hücre dışı olarak yüzde canlılığı ve subselüler işaretleri ile kolokalizasyon. Otomatik bilgisayar tabanlı yöntemler teorik olarak bu parametreleri ölçmek için kullanılabilir olsa da, canlılığı boyalar ve hücre çekirdeğinin güçlü bir floresan sinyali ile herhangi bir bakteri eşit olmayan boyama ile komplike olabilir. Aynı zamanda, bir hücre içi bakteri işaretleyici ile yardımcı sınırlama tanımı bakteri, hücre tipi, ve ilgi marker için optimize edilmesi gerekebilir.
Bu protokollerden biri sınırlama propidiyum iyodür veya SYTOX Green geçirgenlik bakteriyel ölüm gerçek bir tedbir olduğunu varsayım. Propidium iyodür ve SYTOX Green moleküler ağırlığı, sırasıyla, 668.4 Da ve 600 Da'dır. Bu boyalar membran geçirgenliği olmayan olarak kabul edilir ve bakteriler unrepaired membran hasar yoksa bakteri sitoplazma erişmek gerekir. Ancak, olasılık bakteri statik bir devlet girmek kalırhatta onların membran hasarı onarmak ve sonraki zamanlarda büyümeye devam ediyor. İkinci bir kısıtlama protokolleri ayrı ayrı bakterilerin canlılığı zaman içinde takip izin kalmamasıdır. Life Technologies bakteri onlar monte edilmiş ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiş uzun canlılığını kaybeder beri propidium iyodür ve SYTO9 bakteriyel canlılığı değerlendirmeler, boyalara maruz kaldıktan sonra 30 dakika içinde yapılabilir önerir. DAPI / SYTOX Yeşil boya kombinasyonu ile etiketlenmiş enfekte hücreleri de (yayınlanmamış gözlemler) montaj sonrası hızla yansıması gerekir. Üçüncü olarak, yaygın olarak kullanılan protokoller sabitleme teknikleri ile uyumlu değildir. Metanol ya da aseton tespit geçirgenliği ve konakçı hücreler ile ilgili bakterileri öldürmek ve aldehit esaslı sabitleyici N. permeabilize doyurmaya gonore propidium iyodür ve SYTOX Green (yayınlanmamış gözlemler) insan nötrofil içeride. Böylece bu protokolleri kullanarak bir floresan MICR anında erişimi gerektirirOscope ve bir gün içinde protokolleri tamamlamak için yeteneği. Son olarak, bu protokoller kullanılan boyaların her iki nükleik asitleri ve bağlama ana nükleer DNA yanı sıra, bakteriyel DNA (Şekil 1) çok telli bağlar. Nükleer DNA floresans bakteriyel DNA floresans çok daha parlak olduğu için, ökaryotik çekirdeğe yakın olan bakterilerin canlılığı değerlendirilemez. DAPI yardımıyla konfokal lazer tarama mikroskopisi ve prelabeling bakteri nükleer floresan sinyalini azaltır. Non-DNA bağlayıcı bakteri canlılığı boyalar geliştirilmiştir kadar nükleer DNA floresan bu protokollerin bir komplikasyon olmaya devam edecektir.
Bu kısıtlamalara rağmen, bu makalede protokolleri ve ökaryot hücrelerin içine bağlanmış bireysel bakterilerin canlılığını değerlendirmek için hassas bir yol sağlar. Koloni sayısı veya gentamisin-koruma analizleri mikrobiyal patojen araştırma belkemiği olmuştur. Ancak, ataBir potansiyel heterojen nüfusun genelinde bakteriyel hayatta bir değerlendirmesini ide. Aksine, burada tarif edilen canlılığı boya protokolleri ayrı ayrı bakterilerin bütünlüğü incelenecek izin verir. Bu nedenle, araştırmacılar dışı genel hücre içi bakteri, farklı phagosomal tipte bakteri ya da sitoplazma vs fagozomun bakterilerin kaderi ile ilgili bilgiler toplayabilir. Ince kesit transmisyon elektron mikroskopisi, genellikle ayrı ayrı bakterilerin canlılığı incelemek için kullanılmıştır. TEM ile artık elektron-Lucent veya sağlam görünen bakteri açıkça cansız iken, sitoplazmalarında bazı elektron yoğunluğunu korumak bakteri aslında sağlam olup olmadığını değerlendirmek daha zordur. Çok düşük güç alanlar floresan tabanlı canlılığı boyalara maruz kalan hücrelerin elde edilebilir ise Ayrıca, hatta görüntü alımı için tanınan kısa süre içinde, analiz için yeterli mikrograflarıdır elde etmek için elektron mikroskop kaç saat sürebilir. Birlikte yazarlaraded protokolleri N. ile optimize edildi gonorrhoeae ve primer insan nötrofil, hepsi fagositik ve nonphagocytic ökaryotik hücreler de dahil olmak üzere hücre tiplerinin 5,15-24,26 çeşitli gram-negatif ve gram-pozitif bakterilere birçok türün uygulanabilirliğini değerlendirmek için adapte edilebilir. Bakteriyel canlılığı boyalar ökaryotik hücreler bakteriyel patojenez mekanizmalarının ve bakteriyel enfeksiyonu kontrol etmek için ökaryotik hücrelerin yeteneğini incelemek için güçlü bir deneysel araç sağlar. Gelecekte, bu protokoller daha kullanışlı prokaryotlar için aldehit fiksasyon ile uyumlu ve spesifik bakteri canlılığı boyaların gelişimi ile birlikte otomatik görüntü toplama ve işleme için daha iyi araçlar ile olma olasılığı vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz yazının eleştirel okuma için Asya Smirnov ve Laura Gonyar teşekkür ederim. Bu çalışma AKCMBJ hibe NIH R00 ve R01 TW008042 AI097312 NIH T32 AI007046 tarafından kısmen desteklenen tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S.
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
