Summary
세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 현재의 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 수와 겐타 마이신 보호 분석은 전체 세균 집단의 생존 능력을 평가하고 각각의 세균 가능성을 확인할 수 없습니다. 전자 현미경 개별 박테리아의 생존을 결정하고 숙주 세포에서의 지역화에 관한 정보를 제공하는데 사용될 수있다. 그러나 박테리아는 종종 생존 능력의 평가는 어렵게, 전자 밀도의 범위를 표시합니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 분석은 인간의 기본 호중구에 임균의 생존을 평가하기 위해 원래 개발 된, 그러나해야한다어떤 박테리아 숙주 세포의 상호 작용에 pplicable. 이러한 프로토콜은 막 투과 형광 염료 결합 만 액세스 할 수있는 막 투과성 형광 염료 (요오드화 프로피 듐 및 SYTOX 녹색)로, 모든 박테리아를 얼룩 (SYTO9 및 4 ', 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 [DAPI), 생존 할 박테리아. 종래 진핵 세포 permeabilization에, 항체 또는 형광 시약을 세포 외 박테리아를 식별하기 위해 추가된다. 따라서 이러한 분석은 진핵 세포와 내부에 부착 박테리아의 생존 능력을 차별. 프로토콜은 또한 개별 박테리아 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 진핵 세포 마커 형광 항체와 조합 생존력 염료를 사용하여 제공된다. 이 문서에서 설명하는 박테리아의 생존 염료 개별 박테리아의 생존 능력을 평가하고 박테리아가 숙주 세포에서 살아 남기 위치에 관한 정보를 제공하기 위해 기존의 미생물 기술에 민감한 보완 및 / 또는 대안의.
Introduction
동적 상호 작용과 그들이 거주하는 박테리아와 호스트 사이의 공동 발전이있다. 박테리아 부착 소기관, 분비 시스템, 및 / 또는 호스트 식세포 및 비 식세포 그들의 생산적 감염을 활성화 독소를 생산하는 능력을 진화 해왔다. 박테리아는 또한 인식과 숙주 면역 시스템의 항균 활동을 주장해야합니다. 숙주 면역 시스템은 물리적 및 화학적 장벽, 면역 세포, 보체계 및 체액 성 면역의 다른 구성 요소들을 포함하는 선천성 및 적응 구성 요소로 구성된다. 많은 박테리아가 다층 호스트 면역 반응에 의해 살해 및 통관에 민감하지만, 몇 가지 병원성 및 기회 박테리아가 숙주 세포의 다양한 감염 및 숙주 면역 반응 (1)에 의해 허가를 파괴하는 메커니즘을 진화했다. 임균은 세균성 병원체의 한 예입니다 그는 매우 그 사람의 호스트. N에서 지속하도록되어있다. 임질은 쉽게 비뇨 생식기의 기관, 인두, 결막, 그리고 직장의 점막 상피 세포의 내강 표면을 식민지화한다. 식민지 점막 사이트에서 호중구의 풍부한 모집을 트리거합니다. 호중구는 미생물을 죽이는 항균 다양한 공정을 가지고 전문 식세포 있습니다하지만, N. 임질은 호중구 2-5의 존재하에 생존 할 수있다. 같은 N. 같은 방법 세균성 병원균에 대한 이해 임질은, 파괴 억제하고 궁극적으로 일반적으로 적대적 호스트 환경에서 살아 남기 위해 면역 반응을 납치하는 것은 전염성 질병을 퇴치에 대한 새로운 치료법의 개발에 매우 중요합니다.
종종 숙주 세포에서 박테리아의 생존을 조사하는 데 사용 실험 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 카운트 분석법에서, 감염 세포의 집단은 ㅁ하는 세제, 예를 들어 (용해된다무형 문화 유산 박테리아는 박테리아를 해방하는) 저항한다. 해물 희석 한천 기반 미디어에 도금하고, 용 해물의 콜로니 형성 단위는 각 시점 및 / 또는 실험 조건에 대해 열거된다. 이 접근법은 전체 세균 집단의 생존 능력을보고하지만, 세포 내 및 세포 생존을 구별 할 수 없다는 것이다. 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석에 변화가 구체적으로 진핵 생물의 세포막 6 교차하는 항생제 겐타 마이신의 무능력에 따라 세포 내 박테리아의 생존을 측정한다. 그러나이 분석은 겐타 마이신 (또는 유사 진핵 막 impermeant 또 다른 항생제)와 내부 박테리아에 액세스 할 수있는 항생제의 무능력에 의해 살해에 감염되는 박테리아에 의존합니다. 따라서, 겐타 마이신 보호 분석은 모든 세균 종의 검사를 위해 효과적 일 또는하지 않을 수 있습니다 높은 세균의 생존을 검사 할 때이러한 호중구로 pinocytic 세포. (박테리아가 집계 또는 다른 개별 박테리아 세포에서 행동 microcolonies을 형성하는 경우 예) 둘 중 어떤 방법을 사용해도 세포 내 현지화 각각의 박테리아 또는 다른 동작을 보여준다. 각각의 외부 및 내부 박테리아의 생존을 조사하는 또 다른 자주 사용되는 방법은 얇은 단면 투과 전자 현미경 (TEM)이다. 이 방법은 상기 세포 내 마커에 대해 골드 결합 항체로 면역 전자 현미경으로 조사 할 수있는 숙주 세포에서 박테리아의 위치 (예 phagosome에, 세포질 autophagosome)에 관한 정보를 제공 할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러나 전자 현미경은 세균의 생존 능력을 평가에 특히 구분하지 않습니다. 포함 된 섹션은 우라 닐 아세테이트, 리드 시트 레이트, 또는 다른 전자 밀도 시약으로 염색과 전자 현미경에 의해 촬영하는 경우, 전자 밀도가 박테리아는 생존과 ELEC 간주됩니다트론 - 루슨트 생존 할 7,8. 그러나이 가정은 심각한 혼란 세포막과 세포질의 결여와 만 죽은 박테리아 때문에 전자 - 루슨트 표시, 세균의 생존 능력을 과대 평가. 또한, 일부 세균 종은 어려운 생존력을 결정하게하는, 성장의 그들의 단계에 따라 전자 밀도의 범위를 표시 할 수있다.
대체 또는 이러한 널리 사용되는 방법에 추가로, 여기에서 우리는에 부착 숙주 세포에 의해 내면화 된 박테리아의 생존을 평가하는 세균 생존 능력을 나타내는 형광 염료의 사용을위한 프로토콜과 이론적 근거를 제공한다. 세포 외 박테리아를 식별하기 위해, 감염된 세포는 최초의 렉틴이나 박테리아의 특정 항체로 형광 시약에 노출되어 있습니다. 감염된 세포는 다음 permeabilized 및 세균 생존을위한 대리로, 성능이 저하 된 막 대 손상과 세균에 차별적으로 액세스 할 수있는 DNA 특정 염료에 노출되어 있습니다. 제 P 있음프로피 디움 요오드는 세포막을 손상하고, 따라서 생존 불가능한 것으로 간주되는 그 박테리아 만이 액세스 할 수있는 동안 rotocol, 막 투과성 염색 SYTO9는 총 세균 집단을 식별합니다. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9는 바이오 필름 세균 생존 능력을 평가하는 비병원성 박테리아 병원성 차별, 실행 가능한 수 인성 박테리아 9-12을 열거하는 데 사용되었습니다. SYTOX 녹색 생존 할 인구 만 액세스 할 수있는 동안 두 번째 프로토콜에서, 4 ', 6'-diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)는 총 박테리아를 식별합니다. 이들 생존 염료 쌍은 박테리아 세포 내 현지화를 정의하는 예를 들어, 관심있는 단백질과 관련하여, 각 세균의 위치를 결정하기 위해 면역 형광과 결합 될 수있다. 이러한 분석법의 사용은 숙주 세포의 감염시 세균 살상 또는 생존을 초래할 상호 작용에 대한 통찰력을 제공한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생존을 평가하기 위해 사용되었다호중구 된 phagosomes 5,13,14의 다른 인구를 포함하여 인간의 기본 호중구와 내부에 부착되어 N. 임질. 그러나, 이들 프로토콜은 프로 식세포, 비전문 식세포 및 원생 동물에 15-24 그람 양성 및 그람 음성 세균의 생존 능력을 평가하기 위해 적용될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9와 세균 생존 능력을 평가
- 그 박테리아를 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오.
- 회 부드럽게 세포를 헹구 0.1 M 3 - (N-모르 폴리 노) 1 mM의 MgCl2를 (MOPS / MgCl2를 2)를 함유하는 프로판 술폰산 (MOPS)의 pH 7.2.
- 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 품어.
참고 : 행동이 관심의 렉틴 또는 항체 (그림 1)에 관계없이 생존의 모든 박테리아를 바인딩 것을 보여주기 위해, 숙주 세포의 부재에서, 라이브와 죽은 세균 제어합니다.
- MOPS / MgCl2를 가진 세포를 두 번 씻어.
- 기음 M세포 edia 및 0.5 ㎖ 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가합니다. 라이브 / 죽은 염색 솔루션 MOPS / MgCl2를 5 μM의 SYTO9, 30 μM의 propidium 요오드화, 0.1 %의 사포닌 (최종 농도)입니다.
- 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 세포를 배양한다.
- MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어.
- 반전의 coverslips는 유리 슬라이드에 얼굴을 아래로하고 명확한 매니큐어로 밀봉. 설치 미디어를 사용하지 마십시오.
- 녹색, 빨강, 및 원적외선 이미지 수집과 호환 필터 세트와 형광 현미경을 이용하여 30 분 이내에 이미지를 획득.
NOTE : 종래의 형광 현미경과 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용할 수있다 둘. 30 분 후, 형광 염료가 세균으로부터 새기 시작해야하며 취득한 데이터를 더 이상 정확하다. 이 문서에 표시된 이미지는 Openlab 소프트웨어를 사용하여 하마 오카-ER 디지털 카메라 니콘 이클립스 E800 강직 한 형광 현미경에 인수했다. 650 nm의 663의 발광 필터 - - 알렉사 플 루어 647의 형광은 590 여기 파장 필터를 사용하여 발견 된 735 nm의, 거짓 색 파란색입니다. 580 ㎚, 600의 방출 필터 - - 660 nm의 요오드화 프로피 듐에서 형광 540의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTO9의 형광은 465의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다.
- 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 적색 + 청색으로 이미지가 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 빨간색 만 표시, 외부 가능한 박테리아는 녹색 + 청색으로, 내부 가능한 세균은 녹색 나타납니다. 눈으로 외부 생존 할 내부 생존 할 외부 가능한, 내부 가능한 박테리아의 수를 계산합니다.
- 외부 박테리아의 총 수 (기준 외부 생균의 수를 분할함으로써 외부 생균의 퍼센트를 계산 가능한 플러스 nonvi수). 내부 박테리아의 총 수 (가능한 플러스 생존 불가능한) (도 4)에 의해 내부의 생균 수를 나눔으로써 내부 생균의 퍼센트를 계산한다.
- 이 프로토콜을 사용하여 수행 할 수있는 두 가지 중요한 컨트롤이 있습니다. 첫째, 모든 생존 할 박테리아의 propidium 요오드화 양성과 모든 살아있는 박테리아가 SYTO9 양성임을 확인합니다. (모든 호스트 세포의 부재) 박테리아의 중간 대수 문화> 95 % SYTO9 양성해야한다. N.의 중간 로그 문화는 그림 2에 보이는 임질은 라이브 / 죽은 염색 용액을 배양 (10에서 8 식민지 밀리리터 당 단위를 형성). 둘째, 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9 모두 permeabilized, 감염된 숙주 세포를 입력 할 수 있음을 확인합니다.
- 죽은 박테리아의 인구를 생성하려면, 1.5 ML의 microfuge 튜브의 단위를 형성하는 2 × 10 8 세균성 식민지를 수집, 70 % 이소프로판올을 추가하고 10 분 동안 앉아있다. 의 microfuge에 박테리아 펠렛차 잔류 이소프로판올을 제거하기 위해 PBS에 두 번 박테리아를 씻어. 1.7 - 다음에 따라 프로토콜은 1.5 단계를 반복합니다. 유리 슬라이드에 세균 현탁액의 5 μl를 추가하고 coverslip에와 오버레이. 프로토콜 단계 1.9에서와 같이 이미지 샘플. 이러한 조건에서, 인구의 100 %의 propidium 요오드화 양성 (그림 2)이어야한다. 일부 세균 종에 요오드화 프로피 듐 완전히 SYTO9 염색을 압도하지 않으며, 생존 할 박테리아는 황색 또는 오렌지 나타날 수 있습니다.
- 호중구와 같은 식세포를 들어, 이소프로판올 - 살해 박테리아 세포를 노출하고 세포 내 박테리아의 100 %의 propidium 요오드화 양성 (그림 3)되어 있는지 확인하십시오. 죽은 박테리아를 내면화하지 않을 수 있습니다 nonphagocytic 세포의 경우, 아 지드 화 나트륨 또는 이전에 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가하는 다른 세포 투과 항균제에 감염된 세포를 치료하기에 충분할 수있다.
2. SYTOX GREE와 평가 세균의 생존n 및 DAPI
- 라벨 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 모스의 정의 매체 (25)에서 10 ㎍ / ㎖의 DAPI와 관심의 박테리아.
- DAPI 표지 박테리아와 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오.
- MOPS / MgCl2를 한 번 세포를 씻어.
- 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 세포를 품어. 제안 컨트롤 프로토콜 단계 1.3에서 참고 사항을 참조하십시오.
- 기음 세포에서 미디어와는 MOPS / MgCl2를 0.5 ml의 0.4 μM SYTOX 녹색을 추가합니다.
- 어둠 속에서 실온에서 5 분 동안 세포를 배양한다.
- MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어.
- 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오.
참고 : 알렉사 플 루어 647에서 형광이 590 여기 파장 필터를 사용하여 감지되었습니다 - 650 ㎚, 663의 발광 필터 - 735 nm의, 거짓 색 빨간색입니다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTOX 녹색에서 형광 465의 여기 파장 필터를 이용하여 검출 하였다. 375 ㎚, 400 ㎚의 장벽 필터 - DAPI에서 형광은 355 여기 파장 필터를 사용하여 검출되었다.
- 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 빨강 이미지가 나타날 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 파란색 + 녹색 표시, 외부 가능한 박테리아는 파란색 + 빨간색 표시, 내부 가능한 박테리아는 (그림 4) 블루 나타납니다. 프로토콜 인트의 설명에 따라 외부 및 내부 세균의 비율을 정량화P 1.11.
- 프로토콜 단계 1.12에 기재된 제어 DAPI / SYTOX 녹색 염료 조합 (도 2 및 3)으로 수행되어야한다.
3. 세포 내 현지화 외에도 세균 생존 능력을 평가
- 라벨 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 모스의 정의 중간에 10 ㎍ / ㎖의 DAPI와 관심의 박테리아.
- DAPI 표지 박테리아와 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오.
- MOPS / MgCl2를 한 번 세포를 씻어.
- 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 어둠 속에서 실온에서 10 분 알을 품다. 제안 컨트롤 프로토콜 단계 1.3에서 참고 사항을 참조하십시오.
- 기음 세포에서 미디어와 세포 두 TI 린스MOPS / MgCl2를 2 MES.
- 0.2 %의 사포닌을 포함 MOPS / MgCl2를 2, 20 분에 대한 관심의 세포 내 마커에 대한 알렉사 플 루어 555-결합 항체와 세포를 품어.
- MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어.
- 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오.
- 기음 세포에서 미디어와는 MOPS / MgCl2를 0.4 μM SYTOX 녹색을 추가합니다.
- 어둠 속에서 실온에서 세포에게 5 분을 품어.
- MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어.
- 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오.
- 형광 현미경에 30 분 이내에 슬라이드의 이미지를 획득. 현미경, 디지털 카메라, 및 수집 소프트웨어의 설명 프로토콜 단계 1.9를 참조하십시오.
참고 : 알렉사 플 루어 647에서 형광이 590 여기 파장 필터를 사용하여 감지되었습니다 - 650 nm의 663의 방출 필터 - 735 nm의, 거짓 색 보라색입니다. 형광 F580 ㎚, 600의 방출 필터 - - 660 nm의 ROM 알렉사 형석 555은 540의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTOX 녹색에서 형광 465의 여기 파장 필터를 이용하여 검출 하였다. 375 ㎚, 400 ㎚의 장벽 필터 - DAPI에서 형광은 355 여기 파장 필터를 사용하여 검출되었다.
- 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 보라색 이미지가 나타날 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 파란색 + 녹색 표시, 외부 가능한 박테리아가 파란색 + 보라색 표시, 내부 가능한 박테리아는 파란색 표시하고, 세포 내 단백질 (그림 4) 빨간색이 나타납니다. 프로토콜의 설명에 따라 외부 및 내부 가능한 박테리아의 PERECENT 1.11 단계를 정량화.
- 프로토콜 단계 1.12에 기재된 제어 DAPI / SYTOX 녹색 염료 조합 (도 2 및 3)으로 수행되어야한다.
- 에실행 가능하고 생존 할 박테리아를 계산에 추가, 관심의 세포 내 마커 colocalization을 긍정적이거나 부정적인 각 박테리아를 분류합니다.
- 생균의 전체 숫자로 colocalized 생균의 수를 분할함으로써 세포 내 마커 colocalized 생균의 퍼센트를 계산한다. 생존 불가능한 박테리아의 총 수에 의해 생존 할 colocalized 박테리아의 수를 분할함으로써 세포 내 마커 colocalized 생존 불가능한 박테리아의 퍼센트를 계산한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
설명 된 프로토콜은 N.의 생존을 검사하는 데 사용되었다 임질은 인간의 기본에 노출 된 후 5,26를 호중구. 호중구는 N. 감염된 임질 및 녹색 형광 생존력 염료 SYTO9 및 빨간색 형광 프로피 디움 아이오다 이드 (도 4A)를 사용하여, 한 프로토콜로 처리. 염료는 우선적으로 숙주 세포의 원형질막 아닌 N.을 투과하는 콜레스테롤 sequesters는 사포닌의 존재하에 첨가 임질 막. 그 박테리아의 세포막 콜레스테롤의 높은 금액을 포함하는 경우에 다른 세제 테스트 할 필요가 있습니다. 모든 N. SYTO9와 임질 얼룩하지만, 손상된 세포막 만 박테리아는 프로피 디움 요오드와 얼룩. 프로피 디움 요오드는 SYTO9 형광을 극복, 그래서 살아있는 박테리아는 녹색과 죽은 박테리아가 27 빨간색 표시가 나타납니다. 일부 세균 종에 요오드화 프로피 듐 완전히 SYTO9의 stainin을 극복 할 수 있습니다G는, 죽은 박테리아의 결과로 노란색 또는 주황색 나오는. SYTO 9 요오드화 프로피 듐의 비율은 다른 세균 종에 대해 최적화 될 필요가있다. 세포를 permeabilizing 이전 및 SYTO9 및 요오드화 프로피 듐을 추가 알렉사 형석 647 결합 대두 렉틴은 세포 N.를 검출 감염된 세포에 첨가 하였다 임질과 원적외선 형광 신호가 파란색 거짓 색이었다. 따라서,이 프로토콜에 외부 가능한 박테리아는 청록색 (파란색 + 녹색) 표시 및 외부 생존 할 마젠타 색 (파란색 + 빨간색)이 나타납니다. 내부 가능한 박테리아는 녹색 단지 (화살표)를 표시하고, 내부 생존 할 박테리아는 레드 만 (화살촉)이 나타납니다. 그것은 감염된 세포에서 진핵 세포의 핵 SYTO9 및 요오드화 프로피 디움 ( "N",도 4a)으로 물들 일 것이다하는 것이 중요합니다. 외부 가능한 외부 생존 할 내부 가능한, 내부 생존 할 박테리아는 내면화 된 박테리아의 비율을 산출하는 형광 이미지에서 정량화ND 숙주 세포 내외 퍼센트 생균.
도 4b는 N.의 대표 이미지 생존의 염료 SYTOX 녹색과 DAPI를 사용하여 프로토콜 2로 처리 한 호중구를 임질에 감염된. 이 프로토콜은 형광 현미경에 모두 빨간색과 자외선 채널에서 형광을 프로피 디움 아이오다 이드의 사용을 피한다. 모든 N. 임질의 DAPI (파란색)와 얼룩하지만, 손상된 세포막 만 박테리아는 SYTOX 녹색으로 염색. 세포를 permeabilizing 전에, 상술 한 바와 같이, 알렉사 형석 647 결합 대두 렉틴은 세포 N.를 검출 감염된 세포에 첨가 하였다 그 형광이 경우 거짓 색 빨간색 임질,. 따라서, 외부 가능한 박테리아가 나타 마젠타 (빨강 + 파랑) 및 외부 생존 할 박테리아 (녹색 / 파랑, 빨강 +) 노란색 나타납니다. 내부 가능한 박테리아는 블루 만 (화살표)를 표시하고, 내부 생존 할 박테리아는 블루 / 그린 (화살촉)를 나타납니다. 드SYTOX 녹색 형광 대 DAPI의 상대 강도에 보류, 생존 할 박테리아는 청록색 나타날 수 있습니다. 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9로 처리 된 세포와 유사하게, 핵 호중구는 ( "N"으로 표시됨)도 4b에 SYTOX 녹색 및 DAPI로 염색된다. SYTOX 녹색 및 DAPI로 감염된 세포의 노출은 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9에 대해 전술 한 바와 같이 정량화 숙주 세포의 퍼센트 내면화 및 박테리아의 생존을 나타낸다. N.의 결과 임질에 감염된 호중구 SYTOX 녹색 및 DAPI는 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9 26로 얻은 것과 비교할 수 사용하여 처리.
도 4c에 도시 된 바와 같이, 프로토콜 3은 세균 생존의 염료가 기본 또는 분홍 - 보라색의 호중구 과립 단백질 CD63에 대한 면역과 결합 된에, 프로토콜 2의 적응이다. 이 실험의 phagosome 구획의 조성물을 정의하기 위해 수행되었다 I생존이나 생존 할 N.를 포함 내면 엔 호중구 임질 26. 이 프로토콜은 생균, 생존 불가능한 박테리아 세포 외 박테리아 및 세포 내 마커를 검출하기 위하여 4 색 형광 기능을 위해 현미경 필요하다. 생존력 염료 알데히드 고정 (트립 미발표 관측)에 대응하지 않는 때문에, 우리는 세포 내부의 항원을 검출하는 데 필요한 시간을 최소화하기 위해 직접적으로 형광 물질에 결합하는 항체를 사용하여, 고정없이 면역을 수행 하였다. 이 항체는 빨간색 형광 알렉사 플 루어 (555)에 연결된다. 이 프로토콜에서와 같이, 실행 가능하고 생존 할 박테리아 각각 DAPI와 SYTOX 그린을 사용하여 구별하고, 외부 박테리아 알렉사 647 커플 콩 렉틴을 이용하여 염색 하였다. 외부 박테리아는 원적외선 형광과 거짓 색 자주색입니다. 외부 가능한 박테리아는 파란색 + 보라색과 외부 생존 할 박테리아가 블루 / 그린 + 퍼플 나타납니다. 내부 가능한 박테리아는 파란색 (화살표) 간 표시NAL 생존 할 박테리아는 녹색 (화살촉)이 나타납니다. CD63 양성 과립과 phagosomes를 빨간색 나타납니다. 호중구 핵은 DNA 특정 염료 ( "N")로 염색한다. 이러한 이미지를 분석 할 때, 각각의 세균은 외부 대 내부, 생존 할 대 가능한, 긍정적 또는 CD63 염색의 링 음. N.으로 분류되었다 임질은 세균을 둘러싼 CD63 형광의 반지의 ≥ 50 %가있는 경우 호중구의 CD63 양성의 phagosome에 거주하는 것으로 간주되었다 CD63 음성의 phagosome에있는 박테리아를 둘러싼 CD63 형광 링의 <50 %가있는 경우 . 그림 4C의 화살촉으로 표시 생존 할 세포 내 세균은 박테리아를 주변의 CD63에 대한 염색의 링이 있습니다. 이 반지는 기본 과립이의 phagosome에 충실을 나타냅니다. 화살표로 표시 가능한 세포 내 박테리아, 차 과립의의 phagosome에 충실하지 않습니다 나타내는 CD63에 염색이 부족하다. 우리N.의 생존율의 상관 관계를 보여주기 위해이 기술을 사용 임질과 차 과립 음의 phagosome 26 거주지. 이 분석은 또한 단백질을 사용하여 생존율 및 세균성 지역화 양을 추적하고 있기 때문에 생존 할 생존 가능한 박테리아가 동일 또는 다른 위치에 상주하는 경우에 결정하는 것이 가능하다. 이 정보는 숙주 세포에 세균의 생존에 기여하는 메커니즘에 중요한 초기 통찰력을 제공합니다.
그림 1. 실행 가능하고 생존 할 N.의 혼합 임질은 숙주 세포의 부재하에, 1 프로토콜에 따른 알렉사 형석 647 커플 콩 렉틴, 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9에 노출시켰다. 모든 박테리아가 렉틴에 접근 및 청색 형광. 생존 할 박테리아는 파란색 + 빨간색과 생존 불가능한 세균이 청색으로 표시+ 녹색.
그림 2. (AB) 중간 대수 위상 N. 임질은 (A) 또는 박테리아를 죽일 수있는 (B) 이소프로판올 처리하지 않고, 프로토콜 1과 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9에 노출되었다. 생존 할 박테리아의 propidium 요오드화에 액세스 할 수 있으며 붉은 나타납니다. 실행 가능한 박테리아 SYTO9 염색과 녹색 나타납니다. (CD) 중간 대수 위상 N. 임질은 (C) 또는 박테리아를 죽일 수있는 (D) 이소프로판올 처리하지 않고, 프로토콜 2와 DAPI와 SYTOX 그린에 노출되었다. 생존 할 박테리아는 DAPI와 SYTOX 녹색으로 액세스 할 수있는 녹색 + 청색 나타납니다. 실행 가능한 박테리아는 DAPI로 염색과 파란색 만 나타납니다.
그림 3. (A) 호중구 이소프로판올 죽인 N.를 바인딩하고 내면화 할 수 있었다 임질, 그때 한 프로토콜에 따라 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9에 노출. 생존 할 박테리아는 프로피 디움 요오드로 염색과 빨간색 나타납니다. 모든 박테리아가 생존 할 수 있습니다으로, 녹색 박테리아가 긍정적 인 더 SYTO9 감지되지 않습니다. (B) 호중구 이소프로판올 죽인 N.를 바인딩하고 내면화 할 수 있었다 임질은 다음 프로토콜 2에 따라 DAPI와 SYTOX 그린에 노출. 생존 할 박테리아는 DAPI와 SYTOX 녹색으로 염색과 파란색 + 녹색 나타납니다. 모든 박테리아가 생존 할 수 있습니다으로, 더 DAPI은 블루 만 박테리아가 검출되지 않습니다. N은 호중구 핵 레이블. 스케일 바 = 5 μm의. 화살촉은 생존 할 박테리아의 일부를 나타냅니다.
에서 "SRC ="/ files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg "/>
그림 4. (A) N. 임질에 감염된 사람의 호중구는 알렉사 플 루어 647 커플 대두 렉틴 (블루 거짓 색)에 노출 된 후, 생존의 존재에 사포닌과 permeabilized 죽은 박테리아에 라벨을, 요오드화 프로피 디움 (적색) 염료 및 SYTO9 (녹색), 살아있는 박테리아를 counterstain 할 수 있습니다. 외부 생존 할 박테리아는 빨강 + 파랑, 내부 생존 할 박테리아가 외부 가능한 박테리아가 녹색 + 청색으로 만 빨간색 표시, 내부 가능한 박테리아는 녹색 표시가 나타납니다. (B) N. 임질은 DAPI (파란색)으로 표시 한 후 호중구에 발표했다. 감염된 세포는 다음 다음 죽은 박테리아를 레이블에 SYTOX 그린 (녹색)의 존재에 사포닌과 permeabilized 알렉사 플 루어 647 커플 대두 렉틴 (거짓 색 빨간색)에 노출되었다. 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 빨강 표시, 내부 생존 할 박테리아는 녹색 + 청색, 외부 가능한 BAC에게 표시테크놀로지 기준 파란색 + 빨간색 표시, 내부 가능한 박테리아는 파란색 나타납니다. (C) N. 임질에 감염된 호중구는 CD63 (빨간색)이 permeabilization시 추가 된 호중구 차 과립 단백질에 대한 알렉사 플 루어 555 결합 된 항체를 제외하고, B에서와 같이 처리 하였다. 알렉사 플 루어 647 - 콩 렉틴 염색은 false 색 보라색이었다. 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 보라색, 내부 생존 할 박테리아가 외부 가능한 박테리아가 파란색 + 보라색 표시 만 녹색으로 나타남 내부 가능한 박테리아는 파란색 표시하고, CD63 염색 빨간색이 나타납니다. 삽입 된 페이지는 흰색 사각형으로 표시되는 이미지 영역의 CD63의 형광을 보여줍니다. AC에서, N은 호중구 핵 라벨. 스케일 바 = 5 μm의. 화살촉은 생존 할 박테리아와 화살표가 가능한 박테리아를 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA는 인간의 세포와 내부에 부착 된 라이브 및 죽은 박테리아를 식별 할 수있는 형광 렉틴과 함께 결합과 생존의 염료를 사용하는 두 개의 프로토콜은 여기에서 소개하고 있습니다. 두 프로토콜 효과적으로 사균의 라이브 판별하기 때문에, 사용하는 프로토콜의 선택은 실험의 목표에 의존한다. 제 1 프로토콜은 생존 불가능한 박테리아 그대로 박테리아를 검출하는 SYTO9를 검출 프로피 듐 요오다 이드를 사용한다. 그림 4a에 도시 N.에 감염된 사람의 호중구에 적용되는 프로토콜 1의 대표 이미지입니다 임질. 이러한 염료는 세포 외 N. 인식하는 렉틴, 대두 응집소와 합하고 임질하지만 형광 결합 박테리아 특이 항체는 대안으로서 사용될 수있다. 프로피 디움 요오드에 의한 SYTO9의 배제가 생존 할 박테리아가 빨간색과 실행 가능한 박테리아가 녹색 형광 형광을 만드는 것이므로 프로토콜 1은 쉽게, 개별 박테리아의 생존 능력을 보여준다. HoweveR,이 프로토콜에 의한 종래의 형광 현미경이 가능하고 네 개의 채널 중 2 개에서 요오드화 프로피 듐의 형광을, 숙주 단백질에 대한 면역 형광 결합 될 수 없다. 그러므로,이 프로토콜은 전체 세균 집단을 검출 생존 불가능한 박테리아 및 DAPI를 식별 SYTOX 그린을 사용하는 개발되었다. N.의 예 임질으로는 인간 호중구와 연결된 내측 SYTOX 녹색 및 DAPI를 사용하여 처리도 4b에 도시되어 있고 면역과 조합 예는도 4C에 도시된다. 두 개의 추가 형광 채널의 가용성 게다가,이 프로토콜은 빨강 - 녹색 색맹을 가진 개인이 사용하기에 유리하다. 그러나, 박테리아가 생존 할 DAPI와 SYTOX 그린 염색의 상대 강도를 상기 화상 획득 매개 변수에 따라, 녹색 또는 청색 - 녹색 형광있다. DAPI를 사용하는 한 가지 단점은 N.로부터 누출 수 있다는 임질감염의 과정에서, 비록이는 황색 포도상 구균 (우리의 게시되지 않은 관찰)와 같은 다른 세균에 대한 문제가되지 않을 수 있습니다. 이 문제를 대응하기 위해, 감염된 세포는 감염 후 SYTOX 그린과 함께 DAPI으로 표시하지만, 핵 DAPI 염색의 강도는 N의 형광을 압도했다 임질 (우리의 게시되지 않은 관찰). 이 두 가지 프로토콜뿐만 아니라, 다른 상업적으로 이용 가능한 염료는 박테리아 생존을 표시하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 카르복시 숙신 에스테르 (CFSE)는 총 세균 집단의 레이블을 수 있고, SYTOX 오렌지 또는 파랑 생존 할 박테리아를 식별 할 수 있습니다. 이러한 절차의 상대적인 효능이 세균 감염된 세포 유형에 따라 달라질 수 있기 때문에, 연구자들은 감염 시스템에서 상이한 생존 염료 조합을 비교하는 것이 중요하다.
현재, 우리는 수동으로 이러한 프로토콜로 얻은 각 이미지에서 계량 검사%의 내면화, 세포 내 및 세포 외 %의 가능성, 그리고 세포 내 마커 colocalization을. 자동화 된 컴퓨터 기반의 방법은 이론적으로 이러한 파라미터를 정량화하는데 사용될 수 있지만, 그들은 생존력 염료 및 세포 핵의 강한 형광 신호에 박테리아의 불균일 염색에 의해 복잡하게 될 수있다. 또한, 세포 내 박테리아 colocalization을 마커의 정의는 박테리아 세포 유형 및 그 마커를 위해 최적화 될 필요가있다.
이러한 프로토콜의 하나의 한계는 프로피 듐 요오다 이드 또는 SYTOX 그린 투과성 세균 사망 사실 측정이라는 가정이다. 요오드화 프로피 듐 및 SYTOX 녹색의 분자량은 각각 668.4 다 600 다이다. 이 염료는 막 impermeant 간주되어 박테리아가 수리되지 않은 막 손상이되지 않는 세균의 세포질에 액세스 할 수 없습니다. 그러나, 가능성은 박테리아의 정체 상태가 남아 있는지심지어 자신의 막 손상을 복구하고 나중에 시간에 성장을 계속. 두 번째 제한은 프로토콜이 개개의 균의 생존 시간 경과를 추적하는 것을 허용하지 않는다는 것이다. 생활 기술은 박테리아들이 장착 및 형광 현미경에 의해 촬영 된 이상 생존 능력을 잃게됩니다 때문에 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9와 세균의 생존에 대한 평가는, 염료에 노출 된 후 30 분 이내에 수행 할 것을 권장합니다. DAPI / SYTOX 녹색 염료의 조합으로 표시 감염된 세포는 (우리의 게시되지 않은 관찰)을 설치 한 후 신속하게 몇 군데해야합니다. 셋째, 프로토콜은 일반적으로 사용되는 고정 기술과 호환되지 않습니다. 메탄올, 아세톤 고정이 투과 및 숙주 세포와 관련된 박테리아를 죽이고 알데히드 기반의 고정 제는 N.을 투과한다 임질의 propidium 요오드화 SYTOX 그린 (게시되지 않은 관찰) 인간 호중구 내부. 따라서 이러한 프로토콜을 사용하는 형광 MICR에 즉시 액세스 할 수 있어야합니다oscope과 하루에 프로토콜을 수행 할 수있는 능력. 마지막으로, 이러한 프로토콜에 사용되는 염료의 각각은 두 핵산 인드 호스트 핵 DNA뿐 아니라 세균성 DNA (도 1) 가닥 결합한다. 핵 DNA의 형광 세균성 DNA의 형광보다 상당히 더 밝은 때문에, 진핵 세포 핵에 근접 박테리아의 생존 능력이 평가 될 수 없다. DAPI의 도움으로 공 초점 레이저 주사 현미경과 prelabeling 박테리아는 핵 형광 신호를 줄일 수 있습니다. 비-DNA 결합 세균 생존의 염료가 개발 될 때까지 핵 DNA의 형광 이러한 프로토콜의 합병증 유지됩니다.
이러한 한계에도 불구하고,이 문서의 프로토콜과 진핵 세포 내부에 부착 된 개별 박테리아의 생존 능력을 평가하는 중요한 방법을 제공합니다. 콜로니 수 또는 겐타 마이신 보호 분석은 미생물 병인 연구의 근간이었다. 그러나, 그들은 수 prov잠재적으로 이기종 인구를 통해 세균의 생존에 대한 평가를 IDE. 대조적으로, 여기에 설명 생존력 염색 프로토콜은 개별 박테리아의 무결성을 검사 할 수있다. 따라서, 연구진은 세포 대 세포 내 박테리아, 다른 phagosomal 종류의 박테리아, 또는 세포질 대 phagosome에있는 박테리아의 운명에 관한 데이터를 수집 할 수 있습니다. 얇은 단면 투과 전자 현미경은 종종 개별 박테리아의 생존을 조사하는 데 사용되었다. TEM에 의해 더 이상 전자 - 루슨트 또는 그대로 표시되지 박테리아가 명확하게 생존 할 동안, 그들의 세포질에서 일부 전자 밀도를 유지 박테리아가 실제로 손상을 받는지의 여부를 평가하기 어렵다. 다양한 저전력 필드 형광 기반 생존력 염료에 노출 된 세포로부터 얻어 질 수있는 반면 또한, 심지어 이미지 획득을 수득 단시간에, 분석하기에 충분한 현미경을 취득하는 전자 현미경 시간에 많은 시간이 걸릴 수있다. 동안 수 proviDED 프로토콜 N. 최적화 된 임질 및 일차 인간 호중구, 그들은 모두 식세포 및 nonphagocytic 진핵 세포 5,15-24,26 포함한 세포 유형의 다양한 그람 음성 및 그람 양성 박테리아의 많은 종의 생존력을 평가하기 위해 적응 될 수있다. 박테리아 생존력 염료는 진핵 세포에서 세균의 병인 기전 및 세균 감염을 제어하는 진핵 세포의 능력을 시험하는 실험 강력한 도구를 제공한다. 미래에, 이러한 프로토콜은 더욱 유용 원핵위한 알데히드 고정과 호환 특정한 박테리아 생존력 염료의 개발과 함께 자동화 된 이미지 획득 및 처리에 대한 더 나은 도구가 될 가능성이있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 원고의 중요한 읽기 아샤 스 미르 노프와 Laura Gonyar 감사합니다. 이 작품은 AKCMBJ 보조금 NIH R00 TW008042 및 R01 AI097312는 NIH T32 AI007046에 의해 부분적으로 지원되었다에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S.
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
