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Immunology and Infection

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50729
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

Summary

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes.

Abstract

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Les protocoles actuels pour répondre à ces questions comprennent des essais de comptage des colonies, des essais de protection gentamicine, et la microscopie électronique. le nombre de colonies et de protection de la gentamicine essais seulement évaluer la viabilité de l'ensemble de la population bactérienne et sont incapables de déterminer la viabilité bactérienne individu. La microscopie électronique peut être utilisé pour déterminer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations en ce qui concerne leur localisation dans les cellules hôtes. Cependant, les bactéries présentent souvent une gamme de densités d'électrons, ce qui rend difficile l'évaluation de la viabilité. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes. Ces tests ont été développés à l'origine pour évaluer la survie de Neisseria gonorrhoeae dans les neutrophiles humains primaires, mais doit être unpplicable toute interaction cellulaire bactérie-hôte. Ces protocoles associent des colorants fluorescents membrane perméable (SYTO9 et 4 ',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), qui colore toutes les bactéries, avec des colorants de membrane imperméable fluorescent (iodure de propidium et SYTOX vert), qui ne sont accessibles à bactéries non viables. Avant la perméabilisation de la cellule eucaryote, d'un anticorps ou d'un réactif fluorescent est ajouté à identifier les bactéries extracellulaires. Ainsi, ces tests de discrimination de la viabilité des bactéries adhérentes et à l'intérieur des cellules eucaryotes. Un protocole est également prévue en utilisant les colorants de viabilité en combinaison avec des anticorps fluorescents à des marqueurs de cellules eucaryotes, afin de déterminer la localisation subcellulaire des bactéries individuelles. Les colorants de viabilité bactériennes décrites dans cet article sont un complément et / ou solution de rechange adaptée à des techniques de microbiologie traditionnelle pour évaluer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations sur l'endroit où les bactéries survivent dans une cellule hôtes.

Introduction

Il existe une interaction dynamique et co-évolution entre les bactéries et les hôtes où ils résident. Les bactéries ont évolué organelles d'adhérence, des systèmes de sécrétion, et / ou la capacité de produire des toxines qui permettent leur infection productive de phagocytose de l'hôte et des cellules non phagocytaires. Les bactéries doivent également composer avec la reconnaissance et l'activité antimicrobienne du système immunitaire de l'hôte. Le système immunitaire de l'hôte est constitué de composants innée et adaptative, y compris des barrières physiques et chimiques, les cellules du système immunitaire, le système du complément et d'autres composants de l'immunité humorale. Alors que de nombreuses bactéries sont sensibles à la destruction et à un dégagement de la réponse de l'hôte immunisé à couches multiples, certaines bactéries pathogènes et opportunistes ont développé des mécanismes d'infecter une variété de cellules hôtes et de dénaturer un dégagement de l'hôte immunisé réponse 1. Neisseria gonorrhoeae est un exemple d'un agent pathogène bactérien qui est très adapté à persister dans son hôte humain. N. gonorrhoeae colonise rapidement les surfaces luminales de cellules épithéliales de la muqueuse du tractus urogénital, du pharynx, de la conjonctive, et le rectum. Colonisation déclenche le recrutement abondant des neutrophiles au niveau des muqueuses. Les neutrophiles sont des phagocytes professionnels qui possèdent une variété de procédés antimicrobiens pour tuer les micro-organismes, mais N. gonorrhoeae est capable de survivre en présence de neutrophiles 5.2. Comprendre comment les bactéries pathogènes telles que N. gonorrhoeae subvertir, supprimer, et détourner la réponse immunitaire à survivre finalement dans des environnements d'accueil normalement hostiles est cruciale pour le développement de nouvelles thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses.

Les protocoles expérimentaux souvent utilisés pour étudier la survie des bactéries dans les cellules hôtes comprennent des dosages de comptage de colonies, des essais de protection de la gentamicine, et la microscopie électronique. Dans les dosages de comptage de colonies, une population de cellules infectées est lysé (par exemple, avec un détergent à WHich les bactéries sont résistantes) pour libérer les bactéries. Les lysats sont dilués et étalés sur des milieux à base d'agar-agar-, et des unités formant des colonies dans les lysats sont énumérées pour chaque point de temps et / ou d'une condition expérimentale. Cette approche rend compte de la viabilité de l'ensemble de la population bactérienne, mais n'est pas capable de faire la différence entre la survie intracellulaire et extracellulaire. Une variante de l'essai de comptage de colonies, l'essai de protection de la gentamicine, la mesure spécifiquement la survie bactérienne intracellulaire, sur la base de l'incapacité des antibiotiques gentamicine à traverser la membrane plasmique eucaryote 6. Toutefois, ce dosage est dépendant de la bactérie étant sensible à la destruction par la gentamicine (ou un autre antibiotique qui est similaire à la membrane eucaryote impermeant) et l'incapacité de l'antibiotique d'avoir accès à des bactéries internes. Par conséquent, un test de protection de la gentamicine peut ne pas être efficace pour l'examen de toutes les espèces bactériennes ou lors de l'examen survie bactérienne dans trèspinocytaire cellules telles que les neutrophiles. Aucune de ces approches révèle la localisation subcellulaire ou tout autre comportement de bactéries individuelles (par exemple, si les bactéries forment des agrégats ou microcolonies qui se comportent différemment à partir de cellules bactériennes individuelles). Une autre approche fréquemment utilisé pour examiner la viabilité des bactéries externes et internes individuelles est la microscopie électronique à transmission à section mince (TEM). Cette approche est avantageuse en ce qu'elle peut fournir des informations concernant l'emplacement de la bactérie dans les cellules hôtes (par exemple phagosome, cytoplasme, autophagosome), qui peut être davantage étudiée par microscopie immuno-électronique avec des anticorps d'or couplés à des marqueurs contre subcellulaires. Cependant, la microscopie électronique n'est pas particulièrement sensible à l'évaluation de la viabilité bactérienne. Lorsque les sections sont colorées incorporées à l'acétate d'uranyle, le citrate de plomb, ou d'autres réactifs denses aux électrons et imagées par microscopie électronique, les bactéries denses aux électrons sont considérés comme viable et electron-lucent non viable 7,8. Toutefois, cette hypothèse surestime la viabilité bactérienne, puisque seuls les bactéries mortes avec des membranes gravement perturbés et dépourvu de cytoplasme semble électron-Lucent. De plus, certaines espèces bactériennes peuvent présenter une gamme de densités d'électrons en fonction de leur stade de croissance, ce qui rend difficile la détermination de la viabilité.

Comme alternative ou en plus de ces procédés couramment utilisés, nous fournissons ici les protocoles et les raisons de l'utilisation de colorants fluorescents qui indiquent la viabilité bactérienne afin d'évaluer la survie des bactéries fixées à et internalisées par des cellules hôtes. Pour identifier les bactéries extracellulaires, les cellules infectées sont d'abord exposés à un réactif fluorescent, tel que la lectine ou un anticorps spécifique de bactéries. Les cellules infectées sont ensuite perméabilisées et exposés à des colorants spécifiques à l'ADN qui sont accessibles aux bactéries de façon différentielle avec des membranes intactes vs dégradés, comme substitut de la viabilité bactérienne. Dans la première protocol, la membrane perméable SYTO9 de colorant identifie la population bactérienne totale, tandis que l'iodure de propidium est uniquement accessible aux bactéries qui ont compromis les membranes et sont donc considérés comme non viable. L'iodure de propidium et SYTO9 ont été utilisées pour évaluer la viabilité bactérienne dans les biofilms, discrimination pathogène à partir de bactéries non pathogènes, et énumérer les bactéries d'origine hydrique viables 9-12. Dans le second protocole, 4 ', 6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) identifie les bactéries totales, tandis que SYTOX vert est uniquement accessible à la population non viable. Ces paires viabilité de colorants peuvent être combinés avec immunofluorescence pour déterminer l'emplacement de chaque bactérie par rapport à une protéine d'intérêt, par exemple pour définir la localisation sous-cellulaire bactérienne. L'utilisation de ces tests donne un aperçu de la clé dans les interactions qui résultent en la destruction des bactéries ou de la survie au cours de l'infection de cellules hôtes. Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés pour évaluer la viabilité deN. gonorrhoeae qui est fixée à l'intérieur et les neutrophiles humains primaires, y compris dans les différentes populations de neutrophiles 5,13,14 phagosomes. Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la viabilité de bactéries gram-positives et gram-négatives dans les phagocytes professionnels, des phagocytes non-professionnels, des protozoaires et des 15 à 24.

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Protocol

Une. Évaluation de la viabilité bactérienne avec l'iodure de propidium et SYTO9

  1. Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries d'intérêt. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques.
  2. Rincer les cellules une fois doucement dans 0,1 M de 3 - (N-morpholino) propanesulfonique (MOPS), pH 7,2, contenant 1 mM de MgCl2 (MOPS / MgCl 2).
  3. Incuber les cellules pendant 10 min à l'obscurité à la température ambiante avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l'espèce bactérienne d'intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes.

REMARQUE: procéder à des contrôles par des bactéries vivantes et mortes, en l'absence de cellules hôtes, pour montrer que la lectine ou anticorps d'intérêt se lie toutes les bactéries indépendamment de la viabilité (Figure 1).

  1. Rincer les cellules deux fois avec MOPS / MgCl 2.
  2. Aspirer mdias de cellules et ajouter 0,5 ml Vivant / Mort coloration Solution. Vivant / Mort Solution de coloration est de 5 uM SYTO9, 30 uM de l'iodure de propidium, et 0,1% de saponine (concentrations finales) dans MOPS / MgCl 2.
  3. Incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
  4. Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2.
  5. lamelles Inverser face vers le bas sur des lames de verre et sceller avec du vernis à ongles transparent. N'utilisez pas de support de montage.
  6. Acquérir des images à l'intérieur de 30 min, en utilisant un microscope à fluorescence avec des jeux de filtres compatibles avec l'acquisition des images verte, rouge, et rouge lointain.

REMARQUE: Les deux microscopie de fluorescence conventionnelle et la microscopie confocale à balayage laser peut être utilisé. Après 30 minutes, les colorants fluorescents commencent à fuir par les bactéries et les données acquises ne sont plus exactes. Les images présentées dans cet article ont été acquis sur un montant microscope à fluorescence Nikon Eclipse E800 avec appareil photo numérique Hamamatsu Orca-ER en utilisant un logiciel Openlab. La fluorescence de l'Alexa Fluor 647 a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d'onde d'excitation de 590-650 nm et un filtre d'émission de 663 à 735 nm, et est de couleur bleu-faux. La fluorescence de l'iodure de propidium a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d'onde d'excitation de 540-580 nm et un filtre d'émission de 600 à 660 nm. La fluorescence a été détectée à partir de SYTO9 en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 465-495 nm et un filtre d'émission de 515 à 555 nm.

  1. Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent bleu + rouge, bactéries internes non viables apparaissent en rouge seulement, bactéries viables externes apparaissent en bleu + vert, et les bactéries viables internes apparaissent en vert seulement. Compter oeil par le nombre de bactéries qui sont externes non viables, non viables interne, externe viable, et interne viable.
  2. Calculer le pour cent de bactéries viables externe en divisant le nombre de bactéries viables externes par le nombre total de bactéries externes (viable, plus nonvimesure). Calculer le pour cent des bactéries viables internes en divisant le nombre de bactéries viables internes par le nombre total de bactéries internes (non viable, plus viable) (Figure 4).
  3. Il existe deux contrôles essentiels à effectuer avec ce protocole. Tout d'abord, valider que toutes les bactéries non viables sont l'iodure de propidium positif et toutes les bactéries vivantes sont SYTO9 positif. Un milieu de culture logarithmique de bactéries (en l'absence de toute cellule de l'hôte) doit être> 95% SYTO9-positif. Illustrée à la figure 2 est une culture à mi-logarithmique de N. gonorrhoeae (à 10 8 unités formatrices de colonies par ml former) incubées avec mort Colorant / Live. Deuxièmement, valider que les deux iodure de propidium et SYTO9 peuvent entrer perméabilisées, des cellules hôtes infectées.
    1. Pour générer une population de bactéries mortes, de recueillir 2 x 10 8 unités colonie bactérienne dans un tube de 1,5 ml former, ajouter 70% d'isopropanol et de s'asseoir pendant 10 min. Pellet les bactéries dans une micro-une laver les bactéries deux fois dans du PBS pour éliminer l'isopropanol résiduel. Ensuite, suivez les étapes protocole 1.5 à 1.7. Ajouter 5 ul de suspension bactérienne à une lame de verre et recouvrir d'une lamelle. échantillons de l'image que dans le protocole étape 1.9. Dans ces conditions, 100% de la population devrait être l'iodure de propidium-positive (figure 2). Chez certaines espèces bactériennes, l'iodure de propidium peut pas complètement submerger SYTO9 coloration, et les bactéries non viables peut apparaître jaune ou orange.
    2. Pour des cellules phagocytaires telles que les neutrophiles, exposer les cellules de bactéries tuées par l'isopropanol et de veiller à ce que 100% des bactéries intracellulaires sont l'iodure de propidium-positif (Figure 3). Pour les cellules non phagocytaires qui ne peuvent pas internaliser les bactéries mortes, il peut être suffisant pour traiter les cellules infectées avec l'azoture de sodium ou d'autres agents antimicrobiens cellules infiltrant avant d'ajouter Vivant / Mort coloration Solution.

2. Évaluation de la viabilité bactérienne avec SYTOX Green et DAPI

  1. bactéries Label d'intérêt avec 10 pg / ml DAPI en milieu défini de Morse 25 pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
  2. Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries marquées au DAPI. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques.
  3. Rincer les cellules une fois avec MOPS / MgCl 2.
  4. Incuber les cellules pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l'espèce bactérienne d'intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes. Voir la note dans le protocole étape 1.3 pour les contrôles proposés.
  5. Aspirer le milieu de cellules et ajouter 0,5 ml 0,4 uM SYTOX vert dans MOPS / MgCl 2.
  6. Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante dans l'obscurité.
  7. Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2.
  8. Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min.

REMARQUE: La fluorescence à partir de l'Alexa Fluor 647 a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 590-650 nm et un filtre d'émission de 663 à 735 nm, et est de couleur rouge-faux. La fluorescence de SYTOX vert a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 465-495 nm et un filtre d'émission de 515 à 555 nm. La fluorescence de DAPI a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 355-375 nm et un filtre d'arrêt de 400 nm.

  1. Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent rouge + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bactéries viables externes apparaissent en rouge + bleu, et les bactéries viables internes apparaissent en bleu uniquement (Figure 4). Quantifier le pour cent des bactéries internes et externes, comme décrit dans le protocole step 1,11.
  2. Les contrôles décrits dans le protocole étape 1.12 doivent être effectués avec le colorant combinaison DAPI / SYTOX vert (figures 2 et 3).

3. Évaluation de la viabilité bactérienne Outre la localisation subcellulaire

  1. bactéries Label d'intérêt avec 10 pg / ml DAPI dans Défini le moyen de Morse pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
  2. Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries marquées au DAPI. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques.
  3. Rincer les cellules une fois avec MOPS / MgCl 2.
  4. Incuber 10 min à température ambiante dans l'obscurité avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l'espèce bactérienne d'intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes. Voir la note dans le protocole étape 1.3 pour les contrôles proposés.
  5. Aspirer le milieu de cellules et rincer les cellules deux times dans MOPS / MgCl 2.
  6. Incuber les cellules avec Alexa Fluor 555 anticorps contre le marqueur couplé subcellulaire d'intérêt pendant 20 min, en MOPS / MgCl 2 contenant 0,2% de saponine.
  7. Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2.
  8. Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min.
  9. Aspirer le milieu de cellules et ajouter 0,4 uM SYTOX vert dans MOPS / MgCl 2.
  10. Incuber les cellules 5 min à température ambiante dans l'obscurité.
  11. Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2.
  12. Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min.
  13. Acquérir les images de diapositives dans les 30 minutes sur un microscope à fluorescence. Voir protocole étape 1.9 pour la description de microscope, appareil photo numérique, et le logiciel d'acquisition.

REMARQUE: Fluorescence de Alexa Fluor 647 a été détecté en utilisant un filtre à onde d'excitation de 590 à 650 nm et un filtre d'émission de 663 à 735 nm, et est faux de couleur pourpre. Fluorescence from Alexa Fluor 555 a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d'onde d'excitation de 540-580 nm et un filtre d'émission de 600 à 660 nm. La fluorescence de SYTOX vert a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 465-495 nm et un filtre d'émission de 515 à 555 nm. La fluorescence de DAPI a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 355-375 nm et un filtre d'arrêt de 400 nm.

  1. Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent violet + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bactéries viables externes apparaissent violet + bleu, bactéries viables internes apparaissent en bleu seulement, et la protéine intracellulaire apparaît rouge (Figure 4). Quantifier la perecent de bactéries viables externes et internes tel que décrit dans le protocole étapes 1.11.
  2. Les contrôles décrits dans le protocole étape 1.12 doivent être effectués avec le colorant combinaison DAPI / SYTOX vert (figures 2 et 3).
  3. Dansplus de compter des bactéries viables et non viables, de classer chaque bactérie comme positif ou négatif pour la colocalisation avec le marqueur subcellulaire d'intérêt.
  4. Calculer le pour cent de bactéries viables colocalisés avec le marqueur subcellulaire en divisant le nombre de bactéries viables colocalisés par le nombre total de bactéries viables. Calculer le pour cent des bactéries non viables colocalisés avec le marqueur subcellulaire en divisant le nombre de bactéries non viables colocalisés par le nombre total de bactéries non viables.

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Representative Results

Les protocoles décrits ont été utilisés pour examiner la survie de N. gonorrhoeae après l'exposition à l'humain primaire neutrophiles 5,26. Les neutrophiles ont été infectées par N. gonorrhoeae et traitées avec le protocole 1, en ​​utilisant la viabilité SYTO9 colorant vert fluorescent et de l'iodure de propidium-rouge fluorescent (figure 4A). Les colorants ont été ajoutés en présence de saponine, qui séquestre le cholestérol pour perméabiliser les membranes plasmiques de préférence de la cellule hôte, et pas N. membranes gonorrhoeae. Peuvent avoir besoin d'autres détergents à tester si les membranes des bactéries d'intérêt contiennent des quantités élevées de cholestérol. Tout N. gonorrhoeae tache avec SYTO9, mais seules les bactéries avec des membranes compromis coloration à l'iodure de propidium. L'iodure de propidium surmonte la fluorescence de SYTO9, si des bactéries vivantes semble bactéries vertes et mortes apparaissent en rouge 27. Chez certaines espèces bactériennes, l'iodure de propidium peut pas surmonter complètement SYTO9 staining, ce qui entraîne des bactéries mortes apparaissant jaune ou orange. Le rapport de l'iodure de propidium à SYTO 9 mai besoin d'être optimisé pour différentes espèces bactériennes. Avant la perméabilisation des cellules et en ajoutant SYTO9 et l'iodure de propidium, un Alexa Fluor 647 couplé soja lectine a été ajouté à des cellules infectées pour détecter N. extracellulaire gonorrhoeae, et le signal de fluorescence rouge lointain était bleu fausse couleur. Ainsi, dans ce protocole bactéries viables externes apparaissent turquoise (bleu + vert) et non viable externe apparaissent magenta (bleu + rouge). Bactéries viables internes apparaissent en vert seulement (flèche), et les bactéries internes non viables apparaissent en rouge seulement (tête de flèche). Il est important de noter que dans les cellules infectées, le noyau de la cellule eucaryote sera taché par SYTO9 et l'iodure de propidium ("N", la figure 4A). Les bactéries,, externes viables externes non viables internes viables et non viables internes ont été quantifiés à partir d'images de fluorescence pour donner le pour cent des bactéries internalisées une les bactéries viables pour cent à l'intérieur et à l'extérieur des cellules hôtes.

La figure 4B est une image représentative de N. neutrophiles traitées avec le protocole 2 gonorrhoeae infectés, en utilisant les colorants de viabilité SYTOX verts et DAPI. Ce protocole évite l'utilisation de l'iodure de propidium, qui émet une fluorescence dans les deux canaux rouge et ultra-violets sur le microscope à fluorescence. Tout N. gonorrhoeae tache avec DAPI (bleu), mais seules les bactéries avec des membranes compromis tache avec SYTOX vert. Comme décrit ci-dessus, avant de perméabilisation des cellules, un Alexa Fluor 647 couplé soja lectine a été ajouté à des cellules infectées pour détecter N. extracellulaire gonorrhoeae, dont la fluorescence dans ce cas est faux de couleur rouge. Par conséquent, les bactéries viables externes apparaissent magenta (rouge + bleu) et des bactéries non viables externes apparaissent en jaune (rouge + vert / bleu). Bactéries viables internes apparaissent bleues seulement (flèches), et les bactéries non viables internes apparaissent vert / bleu (pointes de flèches). Deattente de l'intensité relative de fluorescence DAPI vs SYTOX vert, les bactéries non viables peuvent apparaître turquoise. Semblables à des cellules traitées avec de l'iodure de propidium et SYTO9, le noyau des cellules neutrophiles est coloré par DAPI SYTOX vert et sur ​​la figure 4B (indiqué par "N"). L'exposition des cellules infectées à SYTOX vert et DAPI révèle l'internalisation de pour cent et la viabilité des bactéries dans les cellules hôtes, quantifié comme décrit plus haut pour l'iodure de propidium et SYTO9. Les résultats de N. neutrophiles gonorrhoeae-infectés traités à l'aide SYTOX vert et DAPI sont comparables à ceux obtenus avec de l'iodure de propidium et SYTO9 26.

Comme représenté sur la figure 4C, le protocole 3 est une adaptation du protocole 2, dans lequel les colorants de viabilité bactérienne ont été combinés avec immunofluorescence pour la protéine primaire ou azurophiles des neutrophiles CD63 granule. Cette expérience a été menée afin de définir la composition de compartiments de phagosome ineutrophiles Nside qui contiennent N. viable ou non viable gonorrhoeae 26. Ce protocole nécessite un microscope de fluorescence pour une capacité de quatre-couleur pour détecter les bactéries viables, les bactéries non viables, les bactéries extracellulaires, et marqueur subcellulaire. Etant donné que les colorants de viabilité sont pas compatibles avec la fixation de l'aldéhyde (nos observations non publiées), nous avons effectué sans fixation immunofluorescence, en utilisant un anticorps directement couplé à un fluorophore afin de minimiser le temps nécessaire pour détecter l'antigène à l'intérieur des cellules. Cet anticorps est couplé au fluorochrome rouge Alexa Fluor 555. Comme dans le protocole 2, bactéries viables et non viables ont été distinguées en utilisant DAPI et SYTOX vert, respectivement, et les bactéries extérieures ont été marquées selon Alexa 647 couplé à la lectine de soja. Bactéries externes fluorescence rouge lointain et sont fausses de couleur pourpre. Bactéries viables externes apparaissent bactéries non viables violet + bleu et externes apparaissent violet + vert / bleu. Bactéries viables internes apparaissent en bleu (flèche) et entrebactéries non viables internes apparaissent en vert (flèche). Granules et phagosomes CD63-positif apparaissent en rouge. Le noyau des neutrophiles est coloré avec des colorants spécifiques d'ADN ("N"). L'analyse de ces images, chaque bactérie individuelle a été classé comme externe vs interne, viable vs non viable, et positif ou négatif pour une bague de CD63 coloration. N. gonorrhoeae a été considéré comme résidant dans un neutrophiles CD63-positif phagosome si il est ≥ 50% d'un anneau de CD63 fluorescence entourant les bactéries, et dans un phagosome CD63 négatif si il est <50% d'un anneau de CD63 fluorescence entourant les bactéries . La bactérie intracellulaire non viable indiqué par la flèche sur la figure 4C a un anneau de coloration pour CD63 entourant les bactéries. Cet anneau indique granules primaires sont enrichis à ce phagosome. La bactérie intra-cellulaire viable, indiqué par la flèche, manque de coloration pour CD63, indiquant granules primaires ne sont pas enrichies à sa phagosome. Nousutilisé cette technique pour montrer une corrélation entre la viabilité de N. gonorrhoeae et de séjour dans un granulé négatif primaire phagosome 26. Étant donné que ce dosage deux écoutes viabilité bactérienne et de la localisation en utilisant une protéine d'intérêt, il est possible de déterminer si les bactéries non viables et viables se trouvent dans les mêmes ou différents emplacements. Cette information donne une idée initiale importante dans les mécanismes qui contribuent à la survie des bactéries dans les cellules hôtes.

Figure 1
Figure 1. Un mélange de N. viable et non viable gonorrhoeae a été exposé à l'Alexa Fluor 647 de soja à couplage de la lectine, l'iodure de propidium, et SYTO9 selon le protocole 1, en ​​l'absence de cellules hôtes. Toutes les bactéries sont accessibles à la lectine et une fluorescence bleue. Bactéries non viables apparaissent bactéries bleu + rouge et non viables apparaissent en bleu+ Vert.

Figure 2
Figure 2. (AB) à mi-logarithmique phase de N. gonorrhoeae a été exposé à l'iodure de propidium et SYTO9 comme dans le protocole 1, avec (A) ou sans (B) le traitement de l'isopropanol pour tuer les bactéries. bactéries non viables sont accessibles à l'iodure de propidium et apparaissent en rouge. Bactéries viables sont colorées avec SYTO9 et apparaissent en vert. (CD) à mi-logarithmique phase de N. gonorrhoeae a été exposé à DAPI et SYTOX vert comme dans le protocole 2, avec (C) ou sans (D) le traitement de l'isopropanol pour tuer les bactéries. Bactéries non viables sont accessibles à DAPI et SYTOX vert et apparaissent en bleu + vert. Bactéries viables sont colorées avec du DAPI seulement et apparaissent en bleu seulement.

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Figure 3. (A) Les neutrophiles ont été autorisés à se lier et internaliser l'isopropanol tués N. gonorrhoeae, puis exposé à l'iodure de propidium et SYTO9 selon le protocole 1. Bactéries non viables sont colorées avec l'iodure de propidium et apparaissent en rouge. Comme toutes les bactéries sont non viable, pas SYTO9 positif, bactéries vertes sont détectés. (B) Les neutrophiles ont été autorisés à se lier et internaliser l'isopropanol tués N. gonorrhoeae, puis exposé à DAPI et SYTOX vert selon le protocole 2. Bactéries non viables sont colorées avec du DAPI et SYTOX vert et apparaissent + bleu-vert. Comme toutes les bactéries sont non viable, pas seulement DAPI, bleu seulement les bactéries sont détectées. N étiquettes le noyau des neutrophiles. Barre d'échelle = 5 um. Pointes de flèches indiquent certaines des bactéries non viables.

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Figure 4. (A) N. neutrophiles humains gonorrhoeae infectées ont été exposés à l'Alexa Fluor 647 couplé à la lectine de soja (bleu fausse couleur), puis perméabilisées avec de la saponine, en présence de la viabilité Colorants l'iodure de propidium (rouge), pour marquer des bactéries mortes, et SYTO9 (vert), à contre-colorer des bactéries vivantes. bactéries non viables externes apparaissent en bleu + rouge, bactéries internes non viables apparaissent en rouge seulement, bactéries viables externes apparaissent en bleu + vert, et les bactéries viables internes apparaissent en vert seulement. (B) N. gonorrhoeae a été marqué avec DAPI (bleu), a ensuite présenté aux neutrophiles. Les cellules infectées ont ensuite été exposées à l'Alexa Fluor de lectine de soja 647 couplé (rouge fausse couleur), puis perméabilisées avec de la saponine, en présence d'SYTOX Green (vert) pour étiqueter les bactéries mortes. Bactéries non viables externes apparaissent en rouge + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bac viable externetères apparaissent en rouge + bleu, et les bactéries viables internes apparaissent en bleu seulement. (C) N. neutrophiles gonorrhoeae infectées ont été traitées comme en B, à l'exception d'un anticorps Alexa Fluor 555 couplés contre la protéine de granules primaires neutrophiles CD63 (en rouge) a été ajouté au moment de la perméabilisation. La Alexa Fluor 647-lectine de soja coloration était faux de couleur pourpre. Bactéries non viables externes apparaissent violet + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert uniquement, bactéries viables externes apparaissent violet + bleu, bactéries viables internes apparaissent en bleu seulement, et CD63 coloration apparaît rouge. L'encart montre la fluorescence de CD63 de la zone de l'image indiquée par le carré blanc. En AC, N étiquettes le noyau des neutrophiles. Barre d'échelle = 5 um. Pointes de flèches indiquent les bactéries et les flèches indiquent non viables bactéries viables.

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Discussion

Présentés ici sont deux protocoles qui utilisent liaison à l'ADN et les colorants de viabilité en conjonction avec une lectine fluorescente pour identifier les bactéries vivantes et mortes et attachés à l'intérieur des cellules humaines. Depuis deux protocoles pénalisent en direct de bactéries mortes, le choix de protocole à utiliser dépend du but de l'expérience. Le premier protocole utilise l'iodure de propidium pour détecter les bactéries non viables et SYTO9 pour détecter les bactéries intactes. Représenté sur la figure 4A est une image représentative de protocole 1 appliqué à des neutrophiles humains infectés par N. gonorrhoeae. Ces colorants ont été combinées avec une agglutinine lectine, de soja, de reconnaître N. extracellulaire gonorrhoeae, mais un anticorps spécifique de la bactérie fluorescente couplée pourraient être utilisés comme une alternative. Protocole 1 révèle facilement la viabilité des bactéries individuelles, car l'exclusion de SYTO9 par l'iodure de propidium fait bactéries non viables fluorescence des bactéries rouges et viables fluorescence verte. Uter, ce protocole ne peut être combiné avec immunofluorescence de protéines de l'hôte, en raison de la fluorescence de l'iodure de propidium dans deux des quatre canaux disponibles pour la microscopie par fluorescence classique. Par conséquent, le protocole 2 a été développé, qui utilise SYTOX vert pour identifier les bactéries non viables et DAPI pour détecter la population bactérienne totale. Un exemple de N. gonorrhoeae à l'intérieur et associé à des neutrophiles humains et traité à l'aide du DAPI et SYTOX vert est représentée sur la figure 4B, et, par exemple, en combinaison avec d'immunofluorescence est représenté sur la figure 4C. Outre la disponibilité de deux canaux de fluorescence supplémentaires, ce protocole est avantageux pour une utilisation par des personnes ayant le daltonisme rouge-vert. Cependant, les bactéries non viables peuvent émettre de la fluorescence verte ou bleu-vert, en fonction de l'intensité relative du DAPI et SYTOX coloration vert et sur les paramètres d'acquisition de l'image. Un inconvénient de l'utilisation de DAPI est qu'il ne peut s'échapper de N. gonorrhoeaeau cours de l'infection, même si cela peut ne pas être un problème pour d'autres bactéries telles que Staphylococcus aureus (Nos observations non publiées). Pour contrer ce problème, les cellules infectées ont été marquées au DAPI avec SYTOX vert après l'infection, mais l'intensité de la coloration DAPI nucléaire maîtrisé la fluorescence de N. gonorrhoeae (Nos observations non publiées). En plus de ces deux protocoles, d'autres colorants disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour révéler la viabilité bactérienne. Par exemple, succinimidylester carboxyfluorescéine (CFSE) pourrait marquer la population bactérienne totale, et SYTOX orange ou bleu pourrait identifier des bactéries non viables. Étant donné que l'efficacité relative de ces procédures peut varier avec la bactérie et le type de cellules infectées, il est important que les chercheurs comparent différentes combinaisons viabilité de colorants dans leurs systèmes d'infection.

Actuellement, nous examinons manuellement chaque image obtenue avec ces protocoles de quantifier parinternalisation cent, pour cent viabilité au niveau intracellulaire et extracellulaire, et co-localisation avec des marqueurs subcellulaires. Bien que les méthodes informatiques automatisés peuvent théoriquement être utilisés pour quantifier ces paramètres, ils peuvent être compliquées par une coloration non uniforme de la bactérie avec des colorants de viabilité et le signal de fluorescence forte du noyau de la cellule. En outre, la définition de la co-localisation avec un marqueur bactérien intracellulaire peut avoir besoin d'être optimisé pour les bactéries, le type de cellule, et le marqueur d'intérêt.

Une limitation de ces protocoles est l'hypothèse que la perméabilité à l'iodure de propidium ou SYTOX vert est une mesure réelle de la mort des bactéries. Le poids moléculaire de l'iodure de propidium et SYTOX vert est 668,4 Da et 600 Da, respectivement. Ces colorants sont considérés membrane imperméant et ne doivent pas accéder au cytoplasme bactérien à moins que les bactéries ont subi des dommages de la membrane non réparés. Cependant, il reste la possibilité que les bactéries entrent dans un état de staseou même de réparer les dégâts de la membrane et continuer à croître à un moment ultérieur. Une seconde limitation est que les protocoles ne permettent pas la viabilité des bactéries individuelles à être suivi au cours du temps. Life Technologies recommande que l'évaluation de la viabilité bactérienne avec de l'iodure de propidium et SYTO9 être effectuées dans les 30 minutes après l'exposition aux colorants, étant donné que les bactéries vont perdre leur viabilité plus ils sont montés et imagées par microscopie à fluorescence. Les cellules infectées marquées par la combinaison de colorant vert DAPI / SYTOX doivent également être visualisés rapidement après le montage (nos observations non publiées). Troisièmement, les protocoles ne sont pas compatibles avec les techniques de fixation utilisés couramment. Méthanol ou l'acétone fixation sera perméabiliser et de tuer les bactéries associées à des cellules hôtes, et des fixateurs à base d'aldéhyde perméabiliser N. gonorrhoeae à l'intérieur des neutrophiles humains à l'iodure de propidium et SYTOX verte (observations non publiées). Ainsi, en utilisant ces protocoles nécessite un accès immédiat à un MICR de fluorescenceoscope et la capacité d'achever les protocoles en une seule journée. Enfin, chacun des colorants utilisés dans ces protocoles lier double brin d'acides nucléiques et de l'ADN nucléaire se lient d'accueil ainsi que l'ADN bactérien (Figure 1). Étant donné que la fluorescence de l'ADN nucléaire est beaucoup plus lumineux que la fluorescence de l'ADN bactérien, la viabilité des bactéries qui sont à proximité du noyau eucaryote ne peut pas être évaluée. La microscopie confocale à balayage laser et marquage préalable des bactéries avec du DAPI aide à réduire le signal de fluorescence nucléaire. Fluorescence de l'ADN nucléaire restera une complication de ces protocoles jusqu'à bactériennes colorants de viabilité non-liaison à l'ADN sont développées.

En dépit de ces limitations, les protocoles de cet article de fournir un moyen sensible pour évaluer la viabilité de bactéries individuelles attachées à et à l'intérieur des cellules eucaryotes. comptage des colonies ou la gentamicine protection essais ont été l'épine dorsale de la recherche de la pathogenèse microbienne. Cependant, ils provide à une évaluation de la survie des bactéries dans une population potentiellement hétérogène. En revanche, les protocoles viabilité de colorants décrits ici permettent à l'intégrité de bactéries individuelles à examiner. Par conséquent, les chercheurs peuvent recueillir des données concernant les sorts de extracellulaires contre les bactéries, les bactéries intracellulaires dans les types de phagosome différentes, ou des bactéries dans un phagosome contre le cytoplasme. La microscopie électronique à transmission de la section mince a souvent été utilisé pour examiner la viabilité de bactéries individuelles. Bien que les bactéries qui apparaissent-Lucent électrons ou plus intact par MET sont clairement non viable, il est plus difficile de déterminer si les bactéries qui conservent une certaine densité d'électrons dans leur cytoplasme sont en fait intact. En outre, il peut prendre de nombreuses heures de temps de microscope électronique à acquérir suffisamment de micrographies à analyser, tandis que de nombreux champs de faible puissance peuvent être acquis à partir de cellules exposées à des colorants de viabilité basées sur la fluorescence, même dans le peu de temps accordé pour l'acquisition d'image. Bien que la dispositionprotocoles ded ont été optimisés avec N. gonorrhoeae et les neutrophiles humains primaires, ils peuvent être adaptés pour évaluer la viabilité de nombreuses espèces de bactéries gram-négatives et gram-positives dans une variété de types de cellules, y compris toutes les cellules eucaryotes phagocytaires et non phagocytaires 5,15-24,26. Les colorants de viabilité bactérienne fournissent un outil expérimental puissant pour étudier les mécanismes de la pathogenèse bactérienne dans des cellules eucaryotes et de la capacité des cellules eucaryotes pour contrôler une infection bactérienne. Dans le futur, ces protocoles sont susceptibles de devenir encore plus utile avec de meilleurs outils pour l'acquisition et le traitement d'image automatisé, avec le développement des colorants de viabilité bactérienne qui sont compatibles avec l'aldéhyde et de fixation spécifique pour les procaryotes.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Asya Smirnov et Laura Gonyar pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions du NIH R00 R01 TW008042 et AI097312 à AKCMBJ a été soutenu en partie par les NIH T32 AI007046.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection Becton Dickinson 367251  
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml Becton Dickinson 366480  
Sterile water for irrigation Baxter 07-09-64-070  
Dextran 500 Sigma 31392  
Sodium Chloride Fisher Scientific S641  
Dextrose Ricca Chemical Company RDCD0200  
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ Thermo Scientific SH3002802  
Ficoll solution GE Healthcare 17-1440-03  
Acetic Acid Fisher Scientific BP2401  
12 mm circular glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
24-well plates Corning Incorporated 3524  
Pooled Human Serum Sigma S7023  
RPMI Mediatech 15-040-CV  
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007103  
Human interleukin-8 R&D Systems 208-IL/CF  
MOPS Sigma M3183  
MgCl2 Fisher Scientific BP214  
Propidium Iodide Life Technologies L7007 or L7012  
SYTO9 Life Technologies L7007 or L7012  
Saponin Fluka Analytical 47036  
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin Life Technologies L-32463  
DAPI Sigma D8417  
SYTOX Green Life Technologies S7020  
Mouse anti-CD63 Developmental Studies Hybridoma Bank H5C6  
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit Life Technologies A20187  
Hemacytometer Bright Line Hausser Scientific 1492  
Forceps EMS 78320  
Sorvall Legend RT + Centrifuge Thermo Scientific 75004377  

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