Summary
Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.
Abstract
Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Os protocolos atuais para lidar com essas questões incluem ensaios de contagem de colônia, ensaios de proteção gentamicina, e microscopia eletrônica. Contagem de colônias e de proteção gentamicina ensaios apenas avaliar a viabilidade de toda a população bacteriana e são incapazes de determinar a viabilidade bacteriana individual. A microscopia electrónica pode ser usado para determinar a viabilidade das bactérias individuais e fornecer informações sobre a sua localização em células hospedeiras. No entanto, as bactérias freqüentemente exibem uma gama de densidades de elétrons, fazendo com que a avaliação de viabilidade difícil. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras. Estes ensaios foram desenvolvidos originalmente para avaliar a sobrevivência de Neisseria gonorrhoeae em neutrófilos humanos primários, mas deve ser umAPLICÁVEL a qualquer interação célula bactéria-hospedeiro. Estes protocolos combinar corantes fluorescentes à membrana permeável (SYTO9 e 4 ',6-diamidino-2-fenilindole [DAPI]), o qual mancha todas as bactérias, com corantes fluorescentes de membrana impermeável (iodeto de propídio e SYTOX verde), que só são acessíveis a bactérias não viáveis. Antes de permeabilização de células eucarióticas, de um anticorpo ou reagente fluorescente é adicionada para identificar bactérias extracelulares. Assim, estes ensaios de discriminar a viabilidade das bactérias aderentes e para dentro de células eucarióticas. Um protocolo é também fornecida para a utilização de corantes de viabilidade, em combinação com anticorpos fluorescentes para os marcadores de células eucarióticas, de forma a determinar a localização subcelular de bactérias individuais. Os corantes bacterianas viabilidade mencionados neste artigo são um complemento e / ou alternativa sensível às técnicas tradicionais de microbiologia para avaliar a viabilidade de bactérias individuais e fornecer informações sobre onde as bactérias sobrevivem em célula hospedeiras.
Introduction
Há uma interação dinâmica e co-evolução entre as bactérias e os anfitriões em que residem. As bactérias têm evoluído organelos aderência, sistemas de secreção, e / ou a capacidade de produzir toxinas que permitem a infecção produtiva de fagocítica hospedeiro e as células não fagocíticas. As bactérias também devem lidar com o reconhecimento e actividade antimicrobiana do sistema imune do hospedeiro. O sistema imune do hospedeiro é constituído por componentes inatos e adaptativos incluindo barreiras físicas e químicas, as células do sistema imunológico, o sistema do complemento, e outros componentes da imunidade humoral. Enquanto muitas bactérias são suscetíveis a morte eo afastamento por parte do anfitrião resposta imune de várias camadas, algumas bactérias patogênicas e oportunistas desenvolveram mecanismos para infectar uma variedade de células hospedeiras e subvertem alívio da resposta imune hospedeiro 1. Neisseria gonorrhoeae é um exemplo de um patógeno bacteriano que está altamente adaptada para persistir no hospedeiro humano. N. gonorrhoeae prontamente coloniza as superfícies luminais de células epiteliais da mucosa do tracto urogenital, da faringe, da conjuntiva, e recto. Colonização desencadeia o recrutamento abundante de neutrófilos nos locais de mucosas. Os neutrófilos são fagócitos profissionais que possuem uma variedade de processos antimicrobianos para matar microrganismos, no entanto, N. gonorrhoeae é capaz de sobreviver na presença de neutrófilos 2-5. Compreender como bactérias patogênicas, como N. gonorrhoeae subverter, suprimir, e sequestrar a resposta imune para sobreviver em última análise, em ambientes de host normalmente hostis é crucial para o desenvolvimento de novas terapias para o combate a doenças infecciosas.
Protocolos experimentais muitas vezes utilizados para investigar a sobrevivência bacteriana em células hospedeiras incluem ensaios de contagem de colônia, ensaios de proteção gentamicina, e microscopia eletrônica. Em ensaios de contagem de colónia, uma população de células infectadas é lisadas (por exemplo, com um detergente para which as bactérias são resistentes) para libertar as bactérias. Os lisados são diluídas e plaqueadas em meio à base de agar, e as unidades formadoras de colónias nos lisados são enumerados para cada ponto de tempo e / ou condição experimental. Esta abordagem relata a viabilidade de toda a população de bactérias, mas não é capaz de diferenciar entre a sobrevivência intracelular e extracelular. Uma variação no ensaio de contagem de colónia, o ensaio de protecção de gentamicina, mede especificamente a sobrevivência bacteriana intracelular, com base na incapacidade do antibiótico gentamicina para atravessar a membrana plasmática eucariótica 6. No entanto, este ensaio é dependente das bactérias que são susceptíveis à morte por gentamicina (ou outro antibiótico que é semelhante eucariótica membrana impermeabilizante) e a incapacidade de o antibiótico para ter acesso às bactérias internos. Portanto, um ensaio de proteção gentamicina pode não ser eficaz para o exame de todas as espécies bacterianas ou ao examinar a sobrevivência bacteriana em altacélulas pinocytic tais como neutrófilos. Nenhuma destas abordagens revela a localização subcelular ou outro comportamento de bactérias individuais (por exemplo, se as bactérias formam agregados ou microcolônias que se comportam de forma diferente a partir de células bacterianas individuais). Outra abordagem frequentemente usado para examinar a viabilidade das bactérias externas e internas individuais é de secção fina de microscopia electrónica de transmissão (TEM). Esta abordagem é vantajosa na medida em que pode fornecer informação sobre a localização das bactérias nas células do hospedeiro (por exemplo, fagossoma, citoplasma, autophagosome), que pode continuar a ser investigada por microscopia imunoelectrónica com anticorpos acoplados a ouro contra marcadores subcelulares. No entanto, a microscopia eletrônica não é especialmente sensível a avaliação da viabilidade bacteriana. Quando seções embutidos são corados com acetato de uranila, citrato de chumbo, ou outros reagentes de elétron-densas e fotografada por microscopia eletrônica, as bactérias elétron-densas são considerados viáveis e electron-Lucent inviável 7,8. No entanto, esta hipótese superestima viabilidade bacteriana, uma vez que apenas as bactérias mortas com membranas severamente interrompidas e desprovido de citoplasma aparecem elétron-Lucent. Além disso, algumas espécies bacterianas podem exibir uma gama de densidades de electrões de acordo com a sua fase de crescimento, o que torna difícil determinar a viabilidade.
Como uma alternativa ou em adição a estes métodos amplamente utilizados, aqui podemos fornecer protocolos e racional para a utilização de corantes fluorescentes que indicam a viabilidade bacteriana para avaliar a sobrevivência de bactérias aderidas para e internalizados pelas células hospedeiras. Para identificar as bactérias extracelulares, as células infectadas são primeiro expostas a um reagente fluorescente, tal como uma lectina ou anticorpo de bactérias específicas. As células infectadas são então permeabilizadas e expostos a corantes específicos de DNA que são diferencialmente acessíveis às bactérias com membranas intactas versus degradados, como um substituto para a viabilidade bacteriana. No primeiro protocolo, a membrana permeável SYTO9 corante identifica a população bacteriana total, enquanto iodeto de propídio é acessível apenas para as bactérias que comprometeram membranas e são, portanto, consideradas inviáveis. Iodeto de propídio e SYTO9 têm sido utilizados para avaliar a viabilidade de bactérias em biofilmes, discriminar patogênica de bactérias não patogênicas, e enumerar bactérias viáveis transmitidas pela água 9-12. No segundo protocolo, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) identifica bactérias totais, enquanto SYTOX Verde só é acessível à população inviável. Estes pares de corantes de viabilidade pode ser combinada com a imunofluorescência para determinar a localização de cada bactéria em relação a uma proteína de interesse, por exemplo, para definir a localização subcelular bacteriana. A utilização destes testes proporciona uma visão chave nas interacções que resultam em sobrevivência ou morte bacteriana durante a infecção das células hospedeiras. Os protocolos descritos neste artigo foi utilizado para avaliar a viabilidade deN. gonorrhoeae que é anexado ao e dentro de neutrófilos humanos primários, incluindo em diferentes populações de neutrófilos phagosomes 5,13,14. No entanto, estes protocolos podem ser aplicados para avaliar a viabilidade das bactérias gram-positivas e gram-negativas em fagócitos profissionais, os fagócitos não profissionais, e protozoários 15-24.
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Protocol
1. Avaliando bacteriana Viabilidade com iodeto de propídio e SYTO9
- Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com as bactérias de interesse. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos.
- Lave as células uma vez gentilmente em 0,1 M de 3 - (N-morfolino) propanossulfónico (MOPS), pH 7,2, contendo MgCl2 1 mM (MOPS / MgCl 2).
- Incubar as células durante 10 min no escuro à temperatura ambiente com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl 2, para detectar bactérias externas.
NOTA: Conduta controla com bactérias vivas e mortas, na ausência de células hospedeiras, para mostrar que a lectina ou um anticorpo de interesse liga-se todas as bactérias, independentemente da viabilidade (Figura 1).
- Lave as células duas vezes com MOPS / MgCl 2.
- Aspirar mEDIA a partir de células e adicionar 0,5 ml Live / solução de coloração Morto. Solução de coloração vivo / morto é SYTO9 5 uM, 30 uM de iodeto de propídio, e 0,1% de saponina (concentrações finais) em MOPS / MgCl 2.
- Incubar as células durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl 2.
- Lamelas Inverter face para baixo em lâminas de vidro e selar com clara unha polonês. Não use mídia de montagem.
- Adquirir imagens dentro de 30 minutos, utilizando um microscópio de fluorescência com conjuntos de filtros compatíveis com a aquisição de imagem verde, vermelho e vermelho-extremo.
NOTA: Ambos microscopia de fluorescência convencional e a microscopia confocal a laser pode ser utilizado. Após 30 min os corantes fluorescentes começam a vazar as bactérias e os dados adquiridos não são precisos. As imagens mostradas neste artigo foram adquiridos em uma Nikon Eclipse E800 microscópio de fluorescência na posição vertical com Hamamatsu Orca-ER câmera digital usando o software Openlab. Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e um filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa de cor azul. A fluorescência a partir de iodeto de propídio foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 540-580 nm e um filtro de emissão de 600-660 nm. A fluorescência a partir de SYTO9 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm.
- Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis externas aparecem azul + vermelho, as bactérias não viáveis internos aparecem vermelhos só, bactérias viáveis externas aparecem em azul + verde e bactérias viáveis internos aparecem apenas verde. Contagem por olho o número de bactérias que são externos inviável, inviável interna, externa viável, e interna viável.
- Calcular a percentagem de bactérias viáveis externo, dividindo o número de bactérias viáveis externos ao número total de bactérias externas (mais viável nonvicapaz). Calcular a percentagem de bactérias viáveis internos através da divisão do número de bactérias viáveis internos pelo número total de bactérias internas (mais viável não viável) (Figura 4).
- Há dois controles essenciais para realizar com este protocolo. Primeiro, validar que todas as bactérias não viáveis são iodeto de propídio-positivas e todas as bactérias vivas são SYTO9 positivo. Uma cultura semi-logarítmico de bactérias (na ausência de quaisquer células hospedeiras) deve ser> 95% SYTO9-positivo. Mostrado na Figura 2 é uma cultura semi-logarítmico de N. gonorrhoeae (a 10 8 colônia unidades por ml formando) incubadas com Live / solução de coloração Morto. Em segundo lugar, validar que tanto o iodeto de propídio e SYTO9 pode entrar permeabilizadas, as células hospedeiras infectadas.
- Para gerar uma população de bactérias mortas, recolher 2 x 10 8 unidades formadoras de colónias de bactérias em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 70% de isopropanol e sentar-se durante 10 min. Agregar as bactérias em uma microcentrífuga and lavar as bactérias duas vezes com PBS para remover o isopropanol residual. Em seguida, siga os passos do protocolo 1,5-1,7. Adicionar 5 mL de suspensão bacteriana para uma lâmina de vidro e sobreposição com uma lamela. Amostras de imagem como na protocolo passo 1.9. Sob estas condições, 100% da população deveria ser de iodeto de propídio-positivo (Figura 2). Em algumas espécies bacterianas, iodeto de propídio não pode sobrecarregar completamente coloração SYTO9, e as bactérias não viáveis podem aparecer amarelo ou laranja.
- No caso de células fagocíticas como os neutrófilos, expor as células de bactérias mortas por isopropanol e garantir que 100% das bactérias intracelulares são iodeto de propídio-positivo (Figura 3). Para as células que não podem nonphagocytic internalizar as bactérias mortas, pode ser suficiente para o tratamento de células infectadas com azida de sódio ou outras células de permeante agentes antimicrobianos antes da adição da solução de coloração vivo / morto.
2. Avaliando bacteriana Viabilidade com SYTOX Green e DAPI
- Etiqueta de bactérias de interesse com 10 ug / ml de DAPI, em meio definido de Morse de 25, durante 20 min à temperatura ambiente no escuro.
- Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com bactérias marcadas com DAPI. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos.
- Lave as células uma vez com MOPS / MgCl 2.
- Incubar as células durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl 2, para detectar bactérias externas. Veja a nota na protocolo passo 1.3 para controles sugeridas.
- Aspirar a mídia a partir de células e adicionar 0,5 ml de 0,4 mM SYTOX Verde em MOPS / MgCl 2.
- Incubar as células durante 5 min à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl 2.
- Lave as células uma vez em MOPS / MgCl 2 durante 5 min.
NOTA: Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e um filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa cor vermelha. A fluorescência a partir de SYTOX Green foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm. A fluorescência a partir de DAPI foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 355-375 nm e um filtro barreira de 400 nm.
- Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis externas aparecem vermelho + verde, as bactérias não viáveis internos aparecem em verde + azul, bactérias viáveis externas aparecem em vermelho + azul, e bactérias viáveis internos aparecem em azul apenas (Figura 4). Quantificar o percentual de bactérias externas e internas, conforme descrito no protocolo step 1,11.
- Os controlos descritos no protocolo de passo 1,12 deve ser realizada com a combinação de corante de DAPI / SYTOX verde (Figuras 2 e 3).
3. Avaliando bacteriana Viabilidade Junto localização subcelular
- Etiqueta de bactérias de interesse com 10 ug / ml de DAPI, em meio definido de Morse de 20 min à temperatura ambiente no escuro.
- Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com bactérias marcadas com DAPI. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos.
- Lave as células uma vez com MOPS / MgCl 2.
- Incubar 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl 2, para detectar bactérias externas. Veja a nota na protocolo passo 1.3 para controles sugeridas.
- Aspirar a mídia a partir de células e lave as células duas times em MOPS / MgCl 2.
- Incubar as células com Alexa Fluor 555 anticorpo acoplado contra o marcador subcelular de interesse, durante 20 min, em MOPS / MgCl2 contendo 0,2% de saponina.
- Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl 2.
- Lave as células uma vez em MOPS / MgCl 2 durante 5 min.
- Aspirar a mídia a partir de células e adicionar 0,4 mM SYTOX Verde em MOPS / MgCl 2.
- Incubar as células 5 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl 2.
- Lave as células uma vez em MOPS / MgCl 2 durante 5 min.
- Adquirir imagens de lâminas dentro de 30 min em microscópio de fluorescência. Veja protocolo passo 1.9 para descrição do microscópio, câmera digital e software de aquisição.
NOTA: Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectado por um filtro com comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa cor roxa. Fluorescência from Alexa Fluor 555 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 540-580 nm e um filtro de emissão de 600-660 nm. A fluorescência a partir de SYTOX Green foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm. A fluorescência a partir de DAPI foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 355-375 nm e um filtro barreira de 400 nm.
- Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis externas aparecem roxo + verde, as bactérias não viáveis internos aparecem em verde + azul, bactérias viáveis externas aparecem roxo + azul, bactérias viáveis internos aparecem em azul só, e proteína subcelular aparece em vermelho (Figura 4). Quantificar a perecent de bactérias viáveis externos e internos como descrito no protocolo de passos de 1,11.
- Os controlos descritos no protocolo de passo 1,12 deve ser realizada com a combinação de corante de DAPI / SYTOX verde (Figuras 2 e 3).
- EmAlém de contagem de bactérias viáveis e não viáveis, classificar cada bactéria como positivo ou negativo para a co-localização com o marcador subcelular de interesse.
- Calcular a percentagem de bactérias viáveis com o marcador colocalized subcelular, dividindo o número de bactérias viáveis colocalized pelo número total de bactérias viáveis. Calcular a percentagem de bactérias não viáveis colocalized com o marcador subcelular pela divisão do número de bactérias colocalized não viáveis por o número total de bactérias não viáveis.
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Representative Results
Os protocolos descritos foram usados para examinar a sobrevivência de N. gonorrhoeae após a exposição ao humano primário neutrófilos 5,26. Os neutrófilos foram infectados com N. gonorrhoeae e processados com o protocolo 1, utilizando o corante de viabilidade SYTO9 verde-fluorescente e o iodeto de propídio vermelho fluorescente (Figura 4A). Os corantes foram adicionados, na presença de saponina, que sequestra o colesterol para permeabilizar preferencialmente membranas de plasma da célula hospedeira, não N. membranas gonorrhoeae. Outros detergentes podem precisar de ser testado, se as membranas das bactérias de interesse contêm quantidades elevadas de colesterol. Todos N. gonorrhoeae mancha com SYTO9, mas somente as bactérias com membranas comprometidas manchar com iodeto de propídio. O iodeto de propídio supera a fluorescência SYTO9, assim bactérias vivas aparecem bactérias verdes e mortos aparecem vermelhos 27. Em algumas espécies bacterianas, iodeto de propídio pode não ultrapassar completamente SYTO9 staining, resultando em bactérias mortas aparecem amarelo ou laranja. A proporção de iodeto de propídio para SYTO 9 pode precisar de ser optimizada para diferentes espécies bacterianas. Antes de permeabilização das células e adição de SYTO9 e iodeto de propídio, uma lectina de soja Alexa Fluor 647 acoplado foi adicionado às células infectadas para detectar N. extracelular gonorrhoeae, eo sinal de fluorescência vermelha distante era falsa de cor azul. Assim, neste protocolo bactérias viáveis externas aparecem turquesa (azul + verde) e inviável externo aparecer magenta (azul + vermelho). Bactérias viáveis internos aparecem em verde só (seta), e as bactérias não viáveis internos aparecem vermelhos só (cabeça de seta). É importante notar que, em células infectadas, o núcleo da célula eucariótica serão coradas por SYTO9 e iodeto de propídio ("N", a Figura 4A). Os,, bactérias externas viáveis externas inviáveis internos viáveis e não viáveis internos foram quantificados a partir de imagens de fluorescência para produzir o percentual de bactérias internalizadas umª os percentuais bactérias viáveis dentro e fora células hospedeiras.
A Figura 4B é uma imagem representativa de N. neutrófilos processados com o protocolo 2 gonorrhoeae-infectados, utilizando os corantes de viabilidade SYTOX verde e DAPI. Este protocolo evita o uso de iodeto de propídio, o qual fluoresce em ambos os canais de vermelho e ultravioleta sobre o microscópio de fluorescência. Todos N. gonorrhoeae mancha com DAPI (azul), mas somente as bactérias com membranas comprometidas manchar com SYTOX Green. Como descrito acima, antes de permeabilização das células, uma lectina de soja Alexa Fluor 647 acoplado foi adicionado às células infectadas para detectar N. extracelular gonorrhoeae, cuja fluorescência, neste caso, é falsa de cor vermelha. Portanto, bactérias viáveis externas aparecem magenta (vermelho + azul) e as bactérias não viáveis externas aparecem amarelo (vermelho + verde / azul). Bactérias viáveis internos aparecem azuis apenas (setas), e as bactérias não viáveis internos aparecem verde / azul (setas). DeDependendo da intensidade relativa de DAPI vs SYTOX verde fluorescência, as bactérias não viáveis podem aparecer turquesa. Semelhante a células transformadas com iodeto de propídio e SYTO9, o núcleo de neutrófilos é corado por DAPI SYTOX verde e na Figura 4B (indicado por "N"). A exposição de células infectadas para SYTOX Green and DAPI revela a percentagem de internalização e de viabilidade das bactérias nas células do hospedeiro, quantificado tal como descrito acima para o iodeto de propídio e SYTO9. Os resultados de N. neutrófilos gonorrhoeae infectadas transformadas utilizando SYTOX Green and DAPI são comparáveis aos obtidos com iodeto de propídio e SYTO9 26.
Como representado na Figura 4C, o protocolo de 3 é uma adaptação do protocolo 2, em que os corantes de viabilidade bacteriana foram combinados por meio de imunofluorescência para a proteína de grânulos de neutrófilos primários ou azurófilos CD63. Este experimento foi realizado a fim de definir a composição de compartimentos phagosome ineutrófilos Nside que contêm N. viável ou inviável gonorrhoeae 26. Este protocolo requer um microscópio de fluorescência para a capacidade de quatro cores para detectar bactérias viáveis, bactérias não viáveis, bactérias extracelulares e marcador subcelular. Uma vez que os corantes de viabilidade não são compatíveis com a fixação de aldeído (nossas observações não publicadas), é realizada sem fixação de imunofluorescência, utilizando um anticorpo directamente acoplado a um fluoróforo para minimizar o tempo necessário para detectar o antigénio no interior das células. Este anticorpo é acoplado ao fluoróforo vermelho Alexa Fluor 555. Como no protocolo 2, bactérias viáveis e não viáveis foram distinguidos com DAPI e SYTOX Verde, respectivamente, e bactérias externas foram coradas utilizando lectina de soja Alexa 647-coupled. Bactérias externas fluorescência vermelha distante e são falsos de cor roxa. Bactérias viáveis externas aparecem roxo + azul e externos bactérias não viáveis aparecer roxo + verde / azul. Bactérias viáveis internos aparecem em azul (seta) e interbactérias não viáveis nal aparecer verde (cabeça de seta). Grânulos e phagosomes CD63 positivo aparecer vermelho. O núcleo é de neutrófilos corados com corantes de ADN específicos ("N"). Ao analisar essas imagens, cada bactéria indivíduo foi classificado como externo versus interno, viável vs inviável, e positivo ou negativo para um anel de coloração CD63. N. gonorrhoeae foi considerada a residir num neutrófilo CD63-positivo fagossoma se houver ≥ 50% de um anel de fluorescência de CD63 em torno das bactérias, e em um fagossoma CD63-negativo, se houver <50% de um anel de fluorescência de CD63 em torno das bactérias . A bactéria intracelular inviável indicado pela seta na Figura 4C tem um anel de coloração para CD63 em torno das bactérias. Este anel indica grânulos primários são enriquecidas neste fagossoma. A bactéria intracelular viável, indicado pela seta, carece de coloração para CD63, indicando grânulos primários não são enriquecidas no seu fagossoma. Nósusou esta técnica para mostrar uma correlação entre a viabilidade de N. gonorrhoeae e residência num grânulo negativa phagosome primário 26. Uma vez que este ensaio de faixas viabilidade e localização bacteriana utilizando uma proteína de interesse, é possível determinar se as bactérias não viáveis e viáveis residir na mesma ou em diferentes locais. Esta informação fornece uma visão inicial importante em mecanismos que contribuem para a sobrevivência bacteriana em células hospedeiras.
Figura 1. Uma mistura de N. viável e inviável gonorrhoeae foi exposta ao Alexa Fluor lectina de soja 647 acoplada, iodeto de propídio, e SYTO9 acordo com o protocolo 1, na ausência de células hospedeiras. Todas as bactérias são acessíveis para a lectina e uma fluorescência azul. Bactérias não viáveis aparecem bactérias azul + vermelho e não viáveis aparecem em azul+ Verde.
Figura 2. (AB) Mid-logarítmica fase N. gonorrhoeae foi exposto a iodeto de propídio e SYTO9 como no protocolo 1, com (A) ou sem (B) tratamento de isopropanol para matar as bactérias. bactérias inviáveis são acessíveis ao iodeto de propídio e aparecem vermelho. Bactérias viáveis estão manchadas com SYTO9 e aparecem em verde. (CD) Mid-logarítmica fase N. gonorrhoeae foi exposto a DAPI e SYTOX verde como no protocolo 2, com (C) ou sem (D) tratamento de isopropanol para matar as bactérias. Bactérias não viáveis são acessíveis a DAPI e SYTOX verde e aparecem em azul + verde. Bactérias viáveis são corados com DAPI e só aparecem em azul só.
Figura 3. (D) Os neutrófilos foram deixados a ligar e internalizar N. matou-isopropanol gonorrhoeae, em seguida, expostos a iodeto de propídio e SYTO9 acordo com o protocolo 1. Bactérias inviáveis são corados com iodeto de propídio e aparecem vermelho. Como todas as bactérias são inviáveis, não SYTO9 positivo, são detectadas bactérias verdes. (B) Os neutrófilos foram deixados a ligar e internalizar N. matou-isopropanol gonorrhoeae, em seguida, expostos a DAPI e SYTOX verde acordo com o protocolo 2. Bactérias inviáveis são corados com DAPI e SYTOX verde e aparecem em azul + verde. Como todas as bactérias são não viáveis, não apenas DAPI, azul somente as bactérias são detectadas. N rotula o núcleo de neutrófilos. Barra de escala = 5 um. As setas indicam algumas das bactérias não viáveis.
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Figura 4. (A) N. neutrófilos humanos gonorrhoeae-infectadas foram expostas a Alexa Fluor 647 acoplado lectina de soja (falso de cor azul), seguida permeabilizadas com saponina, na presença de corantes da viabilidade de iodeto de propídio (vermelho), para identificar as bactérias mortas, e SYTO9 (verde), para contracoloração bactérias vivas. Externas bactérias não viáveis aparecem em azul + vermelho, as bactérias não viáveis internos aparecem vermelhos só, bactérias viáveis externas aparecem em azul + verde e bactérias viáveis internos aparecem apenas verde. (B) N. gonorrhoeae foi marcado com DAPI (azul), então apresentada aos neutrófilos. As células infectadas foram então expostos a Alexa Fluor lectina de soja 647 acoplado (falso de cor vermelha), depois permeabilizadas com saponina, na presença de SYTOX Green (verde) para rotular bactérias mortas. Bactérias não viáveis externas aparecem vermelho + verde, as bactérias não viáveis internos aparecem em verde + azul, bac viável externotérios aparecer vermelho + azul, e bactérias viáveis internos aparecem apenas azul. (C) N. neutrófilos gonorrhoeae-infectadas foram processadas como em B, excepto um Alexa Fluor 555 anticorpo acoplado contra a proteína de grânulos de neutrófilos primários CD63 (vermelho) foi adicionada no momento da permeabilização. O Alexa Fluor 647-soja lectina coloração era falsa de cor roxa. Bactérias não viáveis externas aparecem roxo + verde, bactérias não viáveis internos aparecem em verde somente, bactérias viáveis externas aparecem roxo + azul, bactérias viáveis internos aparecem em azul só, e coloração CD63 aparece vermelho. A inserção mostra a fluorescência de CD63 da área da imagem indicada com o quadrado branco. Em CA, N rotula o núcleo de neutrófilos. Barra de escala = 5 um. As setas indicam as bactérias não viáveis e setas indicam bactérias viáveis.
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Discussion
Apresentamos aqui dois protocolos que usam ligação ao DNA e corantes de viabilidade em conjunto com uma lectina fluorescente para identificar bactérias vivas e mortas anexados a e no interior das células humanas. Como ambos os protocolos efetivamente discriminar ao vivo a partir de bactérias mortas, a escolha de qual protocolo usar depende do objetivo do experimento. O primeiro protocolo utiliza iodeto de propídio para detectar bactérias não viáveis e SYTO9 para detectar bactérias intactas. Mostrado na Figura 4A é uma imagem representativa de um protocolo aplicado aos neutrófilos de seres humanos infectados com N. gonorrhoeae. Estes corantes foram combinados com uma lectina de aglutinina de soja, para reconhecer N. extracelular gonorrhoeae, mas um anticorpo de bactérias específicas fluorescentemente acoplado poderia ser usado como alternativa. Protocolo 1 prontamente revela a viabilidade de bactérias individuais, uma vez que a exclusão de SYTO9 por iodeto de propídio faz as bactérias não viáveis fluorescência bactérias vermelhas e viáveis fluorescência verde. However, este procedimento não pode ser combinada com a imunofluorescência de proteínas do hospedeiro, devido à fluorescência do iodeto de propidio em dois dos quatro canais disponíveis para a microscopia de fluorescência convencional. Portanto, o protocolo 2 foi desenvolvido, que utiliza SYTOX verde para identificar bactérias não viáveis e DAPI para detectar a população bacteriana total. Um exemplo de N. gonorrhoeae associado e dentro de neutrófilos humanos e processados usando SYTOX Green and DAPI é mostrado na Figura 4B e um exemplo em combinação com a imunofluorescência é mostrado na Figura 4C. Além da disponibilidade de dois canais adicionais de fluorescência, este protocolo é vantajoso para utilização por pessoas com daltonismo vermelho-verde. No entanto, as bactérias não viáveis podem fluorescência verde ou azul-verde, dependendo da intensidade relativa de DAPI e SYTOX coloração verde e sobre os parâmetros de aquisição de imagem. Um inconveniente para o uso de DAPI é que ele pode vazar a partir de N. gonorrhoeaedurante o curso da infecção, embora isso possa não ser um problema para outras bactérias, tais como Staphylococcus aureus (as nossas observações não publicadas). Para contrariar este problema, as células infectadas foram marcadas com DAPI, juntamente com SYTOX verde após a infecção, mas a intensidade da coloração nuclear DAPI dominado a fluorescência de N. gonorrhoeae (nossas observações não publicadas). Além destes dois protocolos, outros corantes comercialmente disponíveis pode ser usada para revelar a viabilidade bacteriana. Por exemplo, éster succinimidyl carboxifluoresceína (CFSE) poderia rotular a população bacteriana total e SYTOX laranja ou azul poderia identificar as bactérias não viáveis. Uma vez que a eficácia relativa destes procedimentos podem variar de acordo com a bactéria e tipo de célula infectada, é importante que os investigadores comparar diferentes combinações de corantes de viabilidade em seus sistemas de infecção.
Atualmente, examinamos manualmente cada imagem obtida com estes protocolos de quantificar porinternalização cento, por cento viabilidade intracelular e extracelular, e co-localização com marcadores subcelulares. Embora os métodos baseados em computadores automatizados pode, teoricamente, ser utilizada para quantificar esses parâmetros, que pode ser complicada por qualquer coloração não uniforme das bactérias com corantes de viabilidade e o sinal de fluorescência forte do núcleo da célula. Além disso, a definição de uma co-localização de bactérias com um marcador subcelular pode necessitar de ser optimizado para as bactérias, o tipo de célula, e marcador de interesse.
Uma limitação desses protocolos é a suposição de que a permeabilidade ao iodeto de propídio ou SYTOX verde é uma verdadeira medida de morte bacteriana. O peso molecular de iodeto de propídio e SYTOX verde é 668,4 Da e 600 Da, respectivamente. Estes corantes são considerados membrana impermeabilizante e não devem acessar o citoplasma bacteriano, a menos que as bactérias têm membrana danos não reparados. No entanto, permanece a possibilidade de que as bactérias entram em um estado de estaseou até mesmo reparar seu dano de membrana e continuar a crescer em momentos posteriores. A segunda limitação é a de que os protocolos de que não permitem que a viabilidade das bactérias individuais a ser rastreado ao longo do tempo. Life Technologies recomenda que as avaliações de viabilidade bacteriana com iodeto de propídio e SYTO9 ser realizada dentro de 30 minutos após a exposição aos corantes, uma vez que as bactérias perdem a viabilidade a longo elas são montadas e fotografadas através de microscopia de fluorescência. As células infectadas marcados com a combinação corante verde DAPI / SYTOX também deve ser trabalhada rapidamente após a montagem (nossas observações não publicadas). Em terceiro lugar, os protocolos que não são compatíveis com as técnicas de fixação usados. Metanol ou acetona fixação irá permeabilizar e matar as bactérias associadas com as células hospedeiras, e fixadores com base em aldeído permeabilizar N. gonorrhoeae dentro neutrófilos humanos para iodeto de propídio e SYTOX Green (observações não publicadas). Assim, através destes protocolos requer acesso imediato a uma micr fluorescênciaoscope e a capacidade de completar os protocolos em um dia. Finalmente, cada um dos corantes utilizados nestes protocolos ligam cadeia dupla de ácidos nucleicos e de acolhimento de ligação do ADN nuclear, bem como o ADN bacteriano (Figura 1). Porque fluorescência do ADN nuclear é significativamente mais brilhantes do que a fluorescência do ADN bacteriano, a viabilidade das bactérias que estão na proximidade do núcleo eucariótico não pode ser avaliada. Microscopia confocal a laser e bactérias prelabeling com DAPI ajudar a reduzir o sinal de fluorescência nuclear. Fluorescência de DNA nuclear continuará a ser uma complicação destes protocolos até corantes viabilidade bacteriana não vinculativo de DNA são desenvolvidas.
Apesar destas limitações, os protocolos descritos neste artigo fornecer uma forma sensível de avaliar a viabilidade de bactérias individuais ligadas a e no interior das células eucarióticas. Contagem de colônias ou de proteção gentamicina ensaios têm sido a espinha dorsal da investigação da patogénese microbiana. No entanto, eles provide uma avaliação da sobrevivência de bactérias em uma população potencialmente heterogêneo. Em contraste, os protocolos de corantes de viabilidade aqui descritos permitem que a integridade das bactérias individuais a serem examinados. Portanto, os pesquisadores podem coletar dados sobre os destinos de extracelulares contra bactérias, bactérias intracelulares em diferentes tipos phagosomal, ou bactérias em um phagosome contra o citoplasma. A microscopia electrónica de transmissão secção fina tem sido muitas vezes utilizado para examinar a viabilidade das bactérias individuais. Enquanto as bactérias que aparecem elétron-Lucent ou deixaram intacta por TEM são claramente inviável, é mais difícil avaliar se as bactérias que retêm alguma densidade de elétrons em seu citoplasma são realmente intacta. Além disso, pode levar muitas horas de tempo de elétrons do microscópio para adquirir micrografias suficientes para analisar, enquanto muitos campos de baixa potência pode ser adquirida a partir de células expostas a corantes de viabilidade baseados em fluorescência, mesmo no curto período de tempo concedido para a aquisição da imagem. Enquanto o provided protocolos foram otimizados com N. gonorrhoeae e neutrófilos humanos primários, eles podem ser adaptados para avaliar a viabilidade de muitas espécies de bactérias gram-negativas e gram-positivas, em uma variedade de tipos de células, incluindo todas as células eucarióticas e fagocítica nonphagocytic 5,15-24,26. Corantes de viabilidade bacteriana fornecer uma poderosa ferramenta experimental para examinar os mecanismos de patogénese bacteriana em células eucarióticas e a capacidade das células eucarióticas para controlar a infecção bacteriana. No futuro, estes protocolos tendem a se tornar ainda mais útil com melhores ferramentas para a aquisição de imagem automatizada e processamento, juntamente com o desenvolvimento de corantes de viabilidade de bactérias que são compatíveis com a fixação aldeído e específico para procariontes.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos Asya Smirnov e Laura Gonyar para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R00 e R01 TW008042 AI097312 para AKCMBJ foi apoiado em parte pelo NIH T32 AI007046.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
