Summary
הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.
Abstract
Homogenization ממכות חרוז הוא דרך מהירה ויעילה כדי לשחרר דנ"א, רנ"א, חלבונים ומטבוליטים מתאי שמרי ניצנים, שהם קשים לשמצה לשבש. כאן אנו מתארים את השימוש בטחנה homogenizer חרוז להפקת חלבונים לתוך המאגרים מותאמים לשמור את הפונקציות, אינטראקציות ולאחר translational שינויים של חלבונים. תאים גדלים וגריתמית המבטאים את החלבון של עניין הם גדלו בתקשורת צמיחה נוזלית של בחירה. את תקשורת הצמיחה עלולה להיות בתוספת חומרים כימיים כדי לגרום ביטוי חלבון מיזמים מושרים (למשל גלקטוז), לסנכרן את שלב מחזור תא (לדוגמא nocodazole), או לעכב פונקצית proteasome (למשל MG132). תאים אז pelleted וresuspended בחיץ מתאים המכיל פרוטאז ו / או מעכבי phosphatase ומעובדים או מייד או קפוא בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. Homogenization מושגת על ידי שישה מחזורים של 20 שניות ביהD-מכות (5.5 מ '/ שנייה), כל אחד ואחריו דגירה דקה אחת על קרח. Homogenate כתוצאה מכך אינו מסומן על ידי צנטריפוגה וניתן להסיר חלקיקים קטנים על ידי סינון. כל תמצית התא פינה כתוצאה מכך (WCE) הוא זירז באמצעות 20% TCA לניתוח ישיר של חלבונים הכולל ב-SDS אחריו מערבי סופג. תמציות מתאימות גם לטיהור זיקה של חלבונים מסוימים, זיהוי של לאחר translational שינויים, או הניתוח של חלבוני שיתוף לטיהור. כמו במקרה של רוב פרוטוקולי טיהור חלבונים, אנזימים וחלבונים מסוימים עשויים לדרוש תנאים ייחודיים או בהרכבי חיץ לטיהורם ואחרים עשויים להיות לא יציבים או לא מסיס בתנאים האמורים. במקרה האחרון, שהוצג הפרוטוקול עשוי לספק נקודת התחלה שימושית אמפירי כדי לקבוע את אסטרטגית חרוז המכות הטובה ביותר למיצוי חלבון וטיהור. אנחנו מראים את השאיבה וטיהור של epitope מתויג SUMO E3 האנזים, Siz1, מחזור תאמוסדר חלבון שהופך גם sumoylated וphosphorylated, כמו גם למקטע האנזים היוביקוויטין SUMO ממוקד, Slx5.
Introduction
כוח האדיר של שמרי גנטיקה הוא אגדי, אבל ההכנה והניתוח של חלבוני ילידים משמרי ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, הוא לעתים קרובות כרוכה בבעיות. האחרון הוא כתוצאה מהחוזק מכאני הניכר והאלסטיות של תא שמרי 1 הקיר. אמצעים שונים כבר תאר להאנזימטית, כימית, מכאני, ומבוסס לחץ השיבוש של תאי שמרים להשיג תמצית חלבון כל תא 2-6. טכניקות אלו משתנות במידה רבה ביעילותם להניב תמציות חלבוני תא נציגויות, ילידים שיכולים לשמש לניתוחים שלאחר מכן או צעדי טיהור. לדוגמה, ניתן להסיר את דופן תא השמרים עם אנזימים ממסים (למשל zymolyase) וכתוצאה מכך יכול spheroblasts להיות מופר על ידי גז, חומרי ניקוי, או תמוגה האוסמוטי לשחרר חלבונים. גישה זו כבר מועסק בהצלחה כנקודה מוצאת לחלוקות subcellular רבות אבל זה דורש incubations ארוךשאינם תואם את היציבות של חלבונים מסוימים 7.
ריאגנטים תמוגה שמרי קנייניות (כגון חומרי ניקוי) למיצוי הכימי של חלבונים של תאי שמרים זמינים מסחרי, אבל היעילות של חומרים כימיים האלה במיצוי חלבון והשפעתם על האפיון ביוכימי הבא של חלבונים לא תמיד ברורה 8. homogenizers לחץ גבוה, המכונה לעתים קרובות לוחץ צרפתית, ביעילות לשבור תאי שמרים על ידי חשיפתם הראשונה ללחץ גבוה ולאחר מכן extruding אותם דרך פתח קטן בתא לחץ. טכניקה זו מייצרת תמציות באיכות גבוהות, אבל הציוד מאוד יקר ולא יכול להיות מתאים לכמויות קטנות של תאים או במספר רב של דגימות 9. לכן, הפרעה מכאנית של תאי שמרים בטחנת חרוז היא לעתים קרובות את שיטת בחירה של חלבון הכנות שמרי ילידים 10. טכניקה זו כרוכה בהפרעה מכאנית של דופן תא השמרים עם חומצה-WAלשפוך חרוזי זכוכית, אשר יכול להיות שנערכו עם מגוון רחב של המלשינים, vortexers או טחנות חרוזים. יש לציין, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעבד בו זמנית מספר רב של מדגמים קטנים יותר (1 מ"ל של תאים או פחות). חרוזים שונים או מטריצות שיבוש טחנת חרוז זמינים מסחרי לשבש כמעט כל סוג של תא בסוג 2 צינורות מ"ל עכשיו. בהתחשב בטכניקות ובציוד האחרות, יש טחנת חרוז יתרון נוסף שהשיבוש של תאי שמרים מתרחש מהר מאוד, מה שעוזר לשימור לאחר translational שינויים כגון sumoylation, במיוחד כאשר את המאגרים המתאימים עם פרוטאז ו / או מעכבי proteasome מנוצלים והטמפרטורה של תמציות נשלטת.
פרוטוקול זה מתמקד בחילוץ המהיר, יעיל, ואמין של חלבונים אנדוגניים וביטוי יתר בתנאים עדינים עם המטרה הסופית לשמר את תפקוד חלבון, יחסי גומלין, ולאחר translational שינויים. תקשורת צמיחה, מאגר תמוגה תאקומפוזיציות והגדרות טחנת חרוז מותאמות לשמור על אינטראקציות חלבון ולאחר translational שינויים כגון sumoylation וubiquitylation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים המתבטאים בתאי שמרי ניצנים בתנאים מקומיים
1. צמיחה של תאי שמרים ואינדוקציה של ביטוי חלבון
(שונה מ 2)
אופציונלי: השתמש וגריתמית תרבויות שמרים גדלו מבטאות חלבון של עניין במקום תרבויות-Induced גלקטוז שתפורטנה להלן.
- להפוך תאים של גל + שמרי מתח עם קידוד פלסמיד-גלקטוז מושרה 6xHIS מתויג חלבון של בחירה. לדוגמה, ראה רשימת חומרים כימיים.
- לחסן transformants ב 5 מ"ל של תקשורת סלקטיבית המתאימה (SD-אורציל למשל) המכיל 2% סוכרוז. לדגור על 30 מעלות CO / N, מסתובב.
- לדלל תרבות O / N, כך שהצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מודדת 0.3 (OD 600 = 0.3) ב33 מ"ל של תקשורת סלקטיבית עם 2% סוכרוז. לגדול ב 30 מעלות צלזיוס, רעד (Δ150 סל"ד).
- כאשר התרבות הגיעה OD 600 = 0.8 -1.5, לגרום לביטוי של החלבון הרצוי על ידי הוספת 17 מ"ל של YEP 3x עם גלקטוז 6% (מתכון בטבלה מס '1), לריכוז סופי של 1x YEP עם 2% גלקטוז. נפח הכולל של התרבות הוא כעת 50 מ"ל. דגירה, רועד, על 30 מעלות צלזיוס במשך 5-6 שעות נוספות.
הערה: יכול להיות מגוון נפח התרבות. בשלב 1.3, לדלל לשני שלישים מהנפח הסופי הרצוי. בשלב 1.4, להוסיף נפח הסופי השליש מ3x YEP / 6% גלקטוז. - מדוד את OD 600 של התרבות המושרית ו צנטריפוגות Δ150-200 600 יחידות OD של תאים במשך 5 דקות ב 5000 סל"ד ב 4 ° C.
- Resuspend תא גלולה עם 1 מ"ל קר כקרח PBS 1X עם מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x ולהעביר צינור כובע בורג מ"ל 2.
- צנטריפוגה תאים 1 דקות ב15,000 סל"ד ב 4 ° C. למזוג supernatant.
- הצמד הקפאת תא גלולה בחנקן נוזלי, ואחריו תמוגה המיידית תא או אחסון ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
> 2. הומוגניזציה של תאי שמרים והפקה של חלבונים
- לקפוא תא גלולה מהשלב הקודם, להוסיף 200 μl של חרוזי זכוכית חומצת שטף ו500 μl של חיץ תמוגה קר כקרח (מתכון בטבלה 1 או להשתמש במאגר תמוגה תא של בחירה).
- בקצרה פיפטה מעלה ומטה. זה לא נדרש באופן מלא לresuspend תא גלולה. שמור צינורות על קרח בכל העת.
הערה: סוף קצה פיפטה עשוי להיות מנותק לפני pipetting למעלה ולמטה. - על 4 מעלות צלזיוס, מניח את הצינור (ים) עם תאים לתוך טחנת חרוז, שיווי המשקל, הנעילה, ולהפעיל את המכונה כהוראות יצרן לכל.
- הפעל את מקצף חרוז המכיל את הצינור (ות) עבור 20 שניות ב 5.5 מ '/ שנייה, ולאחר מכן מניח על קרח עכור דקות 1. חזור על 6x בסך הכל.
- נקה את החלבונים המופקים על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 15,000 סל"ד ב 4 ° C. אופציונלי: להסיר חלקיקים קטנים על ידי צנטריפוגה דרך פילטר SPINX.
- הכן מדגם של כל תא הדוארxtract (WCE) כדי לאשר את נוכחותו של החלבון של עניין על ידי כתם מערבי:
- הוסף WCE מקביל עם 2 600 יחידות OD של תאים (לדוגמא 5 μl של תמצית תנוקה אם 200 600 יחידות OD של תאים נקצרו) ל -20% חומצת 800 μl Trichloroacetic (TCA). מערבולת לערבב.
- צנטריפוגה במשך 2.5 דקות ב 15,000 סל"ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה.
- הוסף 800 μl של 2% TCA לגלולה ומערבולת הצינור, ואחריו צנטריפוגה ל2.5 דקות ב 15,000 סל"ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה.
- הוסף μl 100 של חיץ מדגם TCA (מתכון בטבלה מס '1), מערבולת לפזר גלולה. הערה: אם חיץ המדגם הופך להיות חומצי (הופך לצהוב) לאחר שבנוסף לגלולה, להוסיף aliquots של Δ10 טריס בסיס μl [1M] עד המדגם הוא כחול שוב.
- דגירה ב100 ° C גוש חום במשך 2-5 דקות.
- מערבולת AGעין לפזר באופן מלא אם שאריות של גלולה עדיין קיימות. פלטות שהוכנו על ידי שיטה זו הן קשה לשמצה להמסה מלאה. זה עלול לקחת Δ10 דקות של vortexing לפזר כדורים לחלוטין.
- מדגם בחנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
- הצמד להקפיא aliquots של WCE שנותר פינה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
3. טיהור אצווה של חלבונים מhomogenates התא שהמרים
הערה: שיטת טיהור זו הוטבה לטיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים על CO 2 + שרף זיקת מתכת.
- איזון שרף
- למדגם בWCE פינה הוכן מΔ20-40 600 יחידות OD של תאים, להוסיף 50-100 μl של שרף זיקה לצינור microcentrifuge. חלבונים המופקים מהתאים שלא מבטאים את החלבון הרצוי או שרף לא ספציפי, כגון amylose, עשויים לשמש כשליטהים לכריכה ספציפי.
- שטוף שרף 5x עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף: להפוך עליונה מעל לתחתית עד שרף הוא resuspended, ואז לסובב דקות 1 ב 5000 סל"ד ב 4 ° C. לשאוב supernatant.
הערה: אם מבצע חילוץ וטיהור באותו היום, ניתן לבצע איזון שרף לפני המיצוי.
- מחייב חלבון לטיהור זיקה
- הוסף 100-200 μl של lysate פינה (Δ20-40 יחידות OD 600) ל50-100 חרוזים שטף μl, ולהביא את הנפח הכולל עד 1 מ"ל עם חיץ תמוגה.
- דגירה עם nutation או נדנדה על 4 מעלות צלזיוס במשך 2-5 שעות.
- ספין דקות 1 ב 5000 סל"ד ב 4 ° C.
- אם תרצה, לשמור את דגימה של הנוזל העליון שנותר לניתוח שלאחר מכן של חלבונים מאוגד. TCA לזרז כמפורט לעיל לWCE (שלב 2.6).
- שטוף שרף עם חלבונים מאוגדים 5x עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף, ואחרי ספין דקות 1 ב 5000 סל"ד ב4 ° C. שמור דגימות קרות במהלך שוטף.
- Elution של חלבונים Bound
- הוסף 150 חיץ elution μl לשרף, nutate על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ספין דקות 1 ב 5000 סל"ד ב 4 ° C ולשמור את supernatant בצינור חדש. אופציונלי: חזור על 2x וelutions בריכת.
- הכן מדגם eluted לכתם מערבי: עד 25 μl של חלבוני eluted, להוסיף 25 סולפט μl 2x ליתיום dodecyl (LDS) חיץ מדגם עם 2 μl β-mercaptoethanol (BME) ו דגירה ב100 מעלות צלזיוס גוש חום למשך 2 דקות.
הערה: ניתן להשתמש גם בחיץ מדגם Laemmli 2X הרגיל. - הצמד חלבון eluted עודף הקפאה בחנקן נוזלי.
אופציונלי: חלבונים שנותרו רצועה משרף עם נפח שווה של חיץ מדגם LDS 2x על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, הסירו את חלבוני LDS-eluted לצינור חדש, ולאחר מכן להוסיף 2 BME μl לחלבוני eluted, לא לשרף. צו זה הוא למנוע ההסרה של כל יונים או נוגדני הconjugaטד את החרוזים. - חנות דגימות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
- כתם מערבי ובדיקה עם נוגדנים מתאימים כדי להמחיש חלבונים.
- טען 10-20 μl (Δ1-3 יחידות OD 600) של כל דגימה ו3-10 μl של סולם חלבון בג'ל-SDS של בחירה. ג'לי בשימוש שגרתי עבור פרוטוקול זה כולל 4-12% Bis-טריס ו8% טריס-גליצין.
- הפעל הג'ל על 200 V למשך 50 דקות.
- העבר את החלבונים מג'ל לקרום PVDF על ידי העברת חצי יבשה ב19 V במשך 20-30 דקות (מתכון בטבלה מס '1).
- הקרום בבלוק 4% milk/1x טריס נאגר מלוח-Tween (TBST) במשך שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C (מתכון בטבלה 1).
- דגירה הממברנה עם נוגדן עיקרי לחלבון epitope מתויג עניין ב4% TBST milk/1x עבור 1-3 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C.
- לשטוף קרום 3x במשך 5 דקות כל אחד עם TBST 1x.
- דגירה עם קרום מתאיםperoxidase המשני חזרת (HRP) מצומדות נוגדן ל1-3 שעות ב RT.
- לשטוף קרום 3x במשך 15 דקות כל אחד בנפח גדול של TBST 1x.
- לכסות עם קרום מצע ECL ולעטוף בניילון נצמד.
- לחשוף את הקרום לסרט ולפתח לדמיין חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות הנציג שלנו מגלות כי פרוטוקול חילוץ חרוז מכות וחלבון תאר שימושי להכנה לשחזור של חלבונים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם (בטבלה 2). -SDS אחריו מכתים Coomassie של WCEs מראה כי מגוון רחב של חלבונים (~ 12 ל> 250 KDA) ניתן לחלץ reproducibly מתאי שמרים (איור 1 א). להקות בדידות על פני טווח של משקלים מולקולריים מצביעות על תמציות חלבונים באיכות גבוהות. האיכות של תמציות יכולה להיות מאושרת על ידי מערבי סופג לחלבוני epitope-מתויגים ספציפיים. מוצגת לתוצאת נציג לגלקטוז-overexpressed, V5-tagged SUMO האנזים Siz1 שנודד בΔ120kDa (איור 1). באופן כללי, באופן חלקי חלבונים מושפלים היו רצים כמו שברים מרובים מתחת למשקל הצפוי, אבל כאן רק חלבון באורך מלא הוא ציין. בנוסף, adducts משקל מולקולרי גבוה של חלבון נתוןעשויים להצביע לאחר translational שינויים. לדוגמה, אנו מראים אורך Siz1 (איור 1 ג ו1D איור) Siz1Δ440 ומלא sumoylated גלקטוז-ביטוי יתר. ניתן גם השתמרו שינויים בSiz1 הביע endogenously (איור 1E).
אנו מספקים תוצאות נציג ששני חלבונים מועשרים גרעיניים, וSlx5 Siz1Δ440, היו מטוהר בהצלחה מWCEs (2A דמויות, 2B, ו2 ג). יש לציין, אנו מראים כי חלבון 6xHIS-מתויג (איור 2 א; Slx5) יכול להיות זיקה מטוהרת מWCEs גם בתנאים מקומיים וdenaturing. לעומת זאת, Slx5-GST (איור 2) וSiz1Δ440-HA (איור 2 ג) חסר epitope 6xHIS אבל בתנאי ילידים עדיין אינטראקציה עם שרף מתכת הזיקה באופן imidazole רגיש. אנו מציעים כי Siz1, ומידה פחותה SLX5, מסוגל לאגד את שרף מתכת הזיקה דרך-תיאום מתכת תחום הטבעת שלהם. אמנם, למיטב ידיעתנו, לא דווחה תופעה מסוימת זה עדיין, מצב דומה תואר שבמקטע B רעלן הכולרה נקשר Ni 2 + שרף הזיקה באופן מתווך על ידי שאריות היסטידין 11 הטבעיות שלה. חשוב לציין, תצפית זו מצביעה על כך שהחלבונים בWCE הם, לפחות בחלקו, שילב באופן מקורי.
במיוחד עבור המחקר של תפקוד חלבון זה חשוב להראות שקומפלקסי חלבונים יישארו ללא שינוי בכל תמציות סלולריים. נתוני הנציג שלנו עולים כי Siz1Δ440, Slx5, וPgk1 (חלבון cytosolic המשמש כביקורת טעינה) נכחו בWCEs. Siz1Δ440 היה מטוהר מתמציות אלה בהתבסס על היכולת הגלומה בו כדי לאגד שרפים זיקה מתכת (להשוות איור 2 ג). כאשר Slx5 וSiz1 היו שיתוף מתבטאים בתאי שמרים, Slx5 הרמות בeluates הוגדלו,מעלה את האפשרות כי Slx5 עלולה ליצור אינטראקציה עם Siz1 (איור 3).
איור 1. נוכחותם של חלבונים שלמים וsumoylated בlysate תא שמרים לאחר חילוץ. אלא אם כן כל תמציות סלולריים צוין אחרת היו מוכנות כפי שתוארו בפרוטוקול זה. דגימות הופרדו על ידי-SDS ואחרי סופג מערביים נבדקו עם נוגדנים לאף HA, V5, או תגיות epitope myc. זני שמרים מופקים בטבלה 3. WB: כתם מערבי. () מדגמים מייצגים של WCE TCA-זירז (מיוק 2514 (שני נתיבים מהשמאל) ויוק 2592 (שני נתיבים מימין), (Δ0.2 OD / נתיב)) היו דמיינו ידי צביעה עם ג'ל הכתם ( ראה סעיף חומרים). (ב) 1 & 2 ליין: homogenates של שמרי זן יוק 2510 ויוק 2512 Siz1-V5/6xHIS גלקטוז-overexpressed המכיל. שים לב להעדרו של חלבון שברים חלקי מושפלים. מסיבות שאינן ידועות, מדגם המסוים הזה אינו חושף adducts sumoylated כשמשש עם נוגדן אנטי V5. עם זאת, ניתן לאתר sumoylation עם אנטי SUMO (אנטי Smt3) נוגדנים כפי שמוצג באיור. 1D. (ג) ליין 3 & 4: homogenates של שמרי זן יוק 2508 ויוק 2509 המכיל גלקטוז-overexpressed Siz1Δ440-HA. (ד) ליין 5, 6 ו -7: Siz1-V5/6xHIS גלקטוז-overexpressed היה מטוהר באמצעות CO 2 + שרף מתכת זיקה, eluted עם 200 מ"מ imidazole, ומשש עם אנטי V5 (מסלול 5), אנטי Smt3 (מסלול 6). ליין 7 הוא reprobe של נתיב 6 עם הנוגדן אנטי V5. ומראה שני Siz1 adducts Siz1 וsumoylated (Smt3 n). (ה) ליין 8: JD52 תאי wildtype רמות אנדוגניים של myc-tagged Siz1 (יוק 2397) המכילים. פינה lysate מוכן באמצעות מאגר תמוגה יונקים. 9 ליין: Lyלהשביע supernatant לאחר דגירה שעות 2 עם אנטי V5 agarose. שימו לב adducts sumoylated של Siz1. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. טיהור של ביטוי יתר טבעת תחום המכיל חלבונים עם שרף זיקת מתכת טאלון. האינדוקציה גלקטוז, שאיבה וטיהור חלבון בוצעו כפי שמתוארים בפרוטוקול זה. טיהור נעשתה בתנאים מקומיים ותנאי denaturing, שעבורו הידרוכלוריד guanidinium התווסף למדגם לז 6 לפני הדגירה עם שרף. Lysate היה מסתובב עם שני שרף שליטת amylose () ושרף TALON מתכת זיקה (T). חלבונים היו eluted עם 200 מ"מ imidazole במאגר elution. דגימות הופרדו על ידי-SDS והמערבית מחקו(WB) עם נוגדן לתג epitope המתאים.) גלקטוז-Induced Slx5-V5/6xHIS (יוק 2096) היה מטוהר עם שרף TALON תחת שני התנאים מקומיים denaturing ו-B) גלקטוז-Induced Slx5-GST (יוק 2071) היה מטוהר עם שרף TALON בילידים, אבל לא denaturing תנאים. יש להניח, תחום טבעת מתכת תיאום אינטראקציה עם שרף TALON כאשר מקפלים כראוי. C) גלקטוז-Induced Siz1Δ440-HA (יוק 2353) גם היה מטוהר עם שרף TALON בילידים, אבל לא denaturing תנאים. חלבונים אלה אינם מכילים תגי 6xHIS, אבל כל אחד עושה מכילים תחום טבעת, אשר מרכז באופן טבעי 2 + יוני Zn ועלול להעניק היכולת לקשור שרף זיקת מתכת TALON מהותי כאשר מקפלים כראוי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. שיתוף טיהור של חלבוני ביטוי יתר על שרף זיקת מתכת טאלון.
Slx5-GST וSiz1Δ440-HA באו לידי ביטוי בכוחות עצמם או בשילוב (+ / -) בJD52 תאים (זני YOKs 2353, 2402, 2224 בהתאמה). חלבונים שהוצאו כמתואר (WCE) וlysates היה nutated עם TALON מתכת זיקת שרף (ראה איור 2). חלבונים היו eluted מהשרף עם 200 מ"מ imidazole במאגר elution (eluate) והכינו בחיץ מדגם LDS. חלבונים הופרדו על ידי-SDS ואחרי מערביים סופג נבדקו עם נוגדן לתג HA או תג GST כמתאים. העמסה שווה של חלבונים הוא אישר עם PGK כביקורת טעינה. שימו לב שSlx5 טיהור היא משופרת בנוכחות Siz1Δ440. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| פתרון | רכיבים | תגובות |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 גרם תמצית השמרים גרם Peptone 60 ב700 מ"ל של DDH 2 O | מערבבים את חומרי חיטוי ולעקר. הוסף גלקטוז מעוקר מסנן עד 6% לaliquots הבודדים של 3x YEP כשמוכן לשימוש |
| חיץ מדגם TCA | 15% גליצרול 80 מ"מ טריס בסיס (הלא pH'd) 3.5% SDS bromophenol כחולים "לטעם." תביא נפח 25 מ"ל עם DDH 2 O | לפני שימוש: להוסיף 40 μl של β-mercaptoethanol (BME) לחיץ מדגם TCA 1 מ"ל |
| שטוף מאגר | 50 מ"מ 7.3 pH HEPES 200 מ"מ NaCl 1% טריטון X-100 20 מ"מ imidazole | Imidazole משמש לNi 2 + או CO 2 + טיהור זיקת מתכת בלבד |
| מאגר תמוגה | 50 HEPES pH 7.3 מ"מ 200 מ"מ NaCl קוקטייל 1% טריטון X-100 10 מ"מ imidazole 1x פרוטאז מעכב הוסף מעכבי פרוטאז קוקטייל מייד לפני השימוש. Imidazole משמש לNi 2 + או CO 2 + טיהור זיקת מתכת בלבד. אופציונלי: 25 מ"מ N-ethylmaleimide (מעכבי פרוטאז ציסטאין, כדי לשמר sumoylation), 1 orthovanadate נתרן מ"מ (מעכבי טירוזין פוספטאז חלבון), ו / או מעכבי פרוטאז לקבוע באופן אמפירי אחרים המבוססים על אזור הספציפי של מחקר | |
| הצפת elution | 50 מ"מ 7.3 pH HEPES 200 מ"מ NaCl 200 מ"מ imidazole | Imidazole נהג להתחרות על אתרי קישור היסטידין בNi 2 + או CO 2 רק + טיהור זיקת מתכת. שיטות אחרות של elution עשויות לשמש לרפי זיקה שונים. |
| מאגר ההעברה יבש למחצה (10x) | ב1 ליטר של DDH 2 O: 58 גרם טריס 29.3 גרם גליצין 18.75 מ"ל 20% SDS | כדי להפוך את חיץ 1X חצי יבש העברה: תמהיל הצפת 100 מיליליטר 10x חצי יבש העברה עם מתנול 200 מ"ל ו -700 מ"ל DDH 2 Os |
| טריס נאגר מלוח (TBS, 10x) | 50 מ"ל 1 M טריס-HCl, pH 8.0 150 מ"ל 5 M NaCl 300 מ"ל DDH 2 O | כדי להפוך 1x TBST, לערבב 100 מ"ל TBS 10x עם 900 מ"ל DDH 2 O ולהוסיף 1 מ"ל של Tween-20 |
טבלת מס '1. פתרונות ומאגרים.
| בקשה | כמות התאים | השלבים הבאים |
|---|---|---|
| תמוגה תא | 150-200 של מכנסי הש"כ נקטף תא גלולה | חרוז להכות כפי שמתואר בשלב 2 |
| כתם מערבי של WCE | 2 מכנסי הש"כ של תאי lysed שהוכנו | היכונו לכתם מערבי על ידי המשקעים TCA כמתואר בשלב 2.6. Δ0.3 יחידות OD (Δ15 μl) נגמרו בג'ל |
| זיקת טיהור ו / או נפתח | 30 מכנסי הש"כ של תאי lysed | יכופף, elute, ולהכין חלבונים כמתואר בשלבי 3.2 ו 3.3 |
| כ 1-2 ODS (אם הכין כמו בשלב 3.3) | כתם מערבי כמתואר בשלב 3.4 |
טבלת 2. סיכום של יישומים עבור פרוטוקול זה.
| שם | גנוטיפ רלוונטי או זנים הורים | פלסמיד (ים) או כניסה קלטת | עיון |
|---|---|---|---|
| יוק 2062 | מאטה URA3-52-his3 Δ200 LEU2-3, 112 trp1-Δ63 lys2-801 | Dohmen et al., 1995 | |
| יוק 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (בוק 629, OpenBiosystems שמרי GST אוסף YSC4515-202,484,078) | מחקר זה |
| יוק 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6 TOPO (בוק 390) | מחקר זה |
| יוק 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (629 בוק, OpenBiosystems שמרי אוסף GST YSC4515-202,484,078); pRS425 (בוק 343) | מחקר זה |
| יוק 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (בוק 795) | מחקר זה |
| יוק 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (מתויג endogenously) | מחקר זה |
| יוק 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (629 בוק, OpenBiosystems שמרי אוסף GST YSC4515-202,484,078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (בוק 795) | מחקר זה |
| יוק 2501 | MHY3765, סוג אלפא הזדווגות, URA3-52, lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, LEU2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; מחצלת-alpha2Δ :: kanMX | שיה et al., 2010 |
| יוק 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 מחצלת-alpha2Δ :: kanMX (יוק 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (בוק 795) | מחקר זה |
| יוק 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; מחצלת-alpha2Δ :: kanMX (יוק 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (629 בוק, OpenBiosystems שמרי אוסף GST YSC4515-202,484,078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (בוק 795) | מחקר זה |
| יוק 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; מחצלת-alpha2Δ :: kanMX (יוק 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (בוק 898); pRS425 (בוק 343) | מחקר זה |
| יוק 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; מחצלת-alpha2Δ :: kanMX (יוק 2501) | Slx5 חלבון (בוק 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (בוק 898) | מחקר זה |
| יוק 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (יוק 2397) | msn5Δ :: hygromycin | מחקר זה |
| יוק 2592 | msn5Δ :: hygromycin בJD52 (יוק 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | מחקר זה |
| יוק 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (בוק 898) | מחקר זה |
לוח 3. זני שמרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתמקד בהכנת שלמה, ילידים, ולאחר translationally שונה חלבונים מתאי שמרי ניצנים עבור יישומים למטה הנחל. לפני שאנסה פרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לקבוע אם החלבון של עניין ניתן לאתר בקלות בתמציות חלבונים שהוכנו תחת denaturing תנאי 12. אם נוגדני polyclonal אינם זמינים זה עשוי להיות יתרון לepitope תג החלבון של עניין, כך שחלבון ההיתוך ניתן להבחין בכתמים מערביים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתויגים SIZ1 עם HA, 6xHIS-V5, או תגיות epitope myc ואסטרטגיה זו אפשרה לנו לזהות באופן ברור את החלבון וצורות sumoylated על כתמי מערב (איור 1). היו לנו פחות הצלחה איתור חלבונים בתיוג GFP, אולי בגלל נוגדנים אנטי-GFP גבוהה זיקה קשה להשיג (מידע לא מוצג). נושא קריטי נוסף נוגע לרמת הביטוי של החלבון של עניין. רמות של אדםחלבונים להשתנות במידה רבה בתאי שמרי ניצנים 4 וכמה חלבונים צריכים להיות ביטוי יתר ולכן הם יכולים להיות מזוהים ו / או מטוהרים. וקטורי גלקטוז מושרים זמינים לביטוי ברמה גבוהה של גן השמרים של עניין 2. במקרה של Siz1, שהיינו מסוגל לזהות באורך המלא או חלבון קטוע כאשר הביעו מORFs כרומוזומלית-מתויג או כאשר הביעו תחת שליטה של promotor גלקטוז מושרה החזק מפלסמיד (איור 1). השימוש בtruncations עשויה להיות שימושי בניתוחים / פונקצית מבנה או כאשר המולקולה באורך המלאה היא קשה להביע או לא יציב. בעוד ביטוי יתר הנגרם גלקטוז משפר זיהוי חלבון וטיהור, יש לו מגבלות ברורות כאשר לומדים את הרלוונטיות של שינויים פיסיולוגי פוטנציאליים מחזור התא ספציפיים לאחר translational ואינטראקציות. לדוגמה, sumoylation של Siz1 הוא נפוץ ביותר בשלב G2 / M של מחזור התא, ושינויים או אינטראקציות שלחלבון ביטוי היתר עשוי להיות מאושר על ידי אמצעים ניסיוניים אחרים. לבסוף, התוספת של פרוטאז הספציפי, phosphatase, ו / או מעכבי proteasome היא שיקול חשוב להצלחתו של פרוטוקול זה. באופן כללי, התוצאות הטובות ביותר מתקבלות על ידי הוספת מעכבי האלה לפני שהתאים קפואים ולתוך מאגרי מיצוי ודילול. התוספת של EDTA, chelator יון מתכת לפעמים נוכח בקוקטיילי מעכבי פרוטאז, לא מומלצת מכיוון שהוא עלול להפריע לpurifications הבאים מתכת הזיקה.
תמציות חלבון המתקבלים ממכות חרוז מתאימות גם כחומר מוצא לטיהור של חלבונים בודדים. באופן ספציפי, אנו מראים כי יכול להיות מטוהרים Slx5 overexpressed נושא תג זיקת 6xHIS מWCEs באמצעות שרף זיקת מתכת (איור 2 א). כדי לשמר לאחר translational שינויים ולהפחית את פירוק חלבונים, חלבוני 6xHIS-מתויגים מטוהרים לעתים קרובות בתנאי denaturing5. עם זאת, יש יתרונות ברורים הקשורים לטיהור של חלבונים בתנאים מקומיים. כך, למשל, חלבונים אלו עשויים לשתף לטהר עם שותפים מחייבים או עשויים לשמש בהמשך במבחנת מבחני 13,14. במקרה של Siz1 וSlx5 אנו serendipitously קבעו כי שני החלבונים מפגינים זיקה מהותית לשרף זיקת המתכת, העצמאי של תג 6xHIS, ותצפית זו הציעה לנו ששני החלבונים להניח אישורים מקומיים. למרבה הצער, פעילות מתקפלת וביולוגית תקינה של חלבונים מטוהרים צריכה להיקבע על מקרה לגופו. לשם כך, המיקום של תגי זיקה וepitope בתחנה הסופית או אמינו או carboxy, עשוי להשפיע באופן משמעותי את הפעילות או יציבות של חלבון היתוך והוא שיקול חשוב בתכנון אסטרטגית טיהור חלבונים.
עבודה עתידית תתמקד בכיצד לשפר לאחר translational שינויים במהלך טיהור, לבחינהple באמצעות השימוש בזני פרוטאז לקויים שמרים, מעכבי פרוטאז שונים, או תגי זיקה אחרים. אנו צופים כי פרוטוקול זה בצורתו הנוכחית או חיץ המותאם שלה הוא ישים למיצוי, טיהור ולאחר מכן ניתן להרחבה המחקר של חלבונים רבים שמרי ניצנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לכל החברים במעבדה Kerscher על תמיכתם. אנו מודים למארק Hochstrasser לזן שמרי MHY3765. עבודה זו נתמכה על ידי NSF מענק 1051970 (לאישור) והווארד יוז רפואי במכון לתואר ראשון ומסעות מענק מונרו חוקרי גרנט תכנית (לES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
