Summary
Подготовка высокого качества дрожжевых экстрактов клетка является необходимым первым шагом в анализе отдельных белков или целых протеомов. Здесь мы опишем быстрый, эффективный и надежный протокол для гомогенизации перспективных дрожжевых клеток, которая была оптимизирована для сохранения функции белков, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций.
Abstract
Гомогенизации шарик избиение быстрый и эффективный способ, чтобы освободить ДНК, РНК, белков и метаболитов из перспективных дрожжевых клеток, которые, как известно, трудно нарушить. Здесь мы описываем использование шарикового гомогенизатора мельница для извлечения белков в буферы оптимизированы для поддержания функций, взаимодействия и посттрансляционных модификаций белков. Логарифмически растущие клетки, экспрессирующие белок выращивают в жидкой питательной среды выбора. Питательной среды может быть дополнен реагентов для индукции экспрессии белка от индуцируемые промоторы (например, галактозы), синхронизировать стадии клеточного цикла (например, нокодазолом) или ингибирует протеасомы функции (например, MG132). Затем клетки осаждали и ресуспендировали в подходящем буфере, содержащем протеазу и / или ингибиторы фосфатазы и обрабатывалась непосредственно или замораживали в жидком азоте для последующего использования. Гомогенизация осуществляется посредством шести циклов по 20 сек BEAг избиение (5,5 м / с), каждым из которых следует один минут инкубации на льду. В результате гомогенат осветляли центрифугированием и малые частицы могут быть удалены путем фильтрации. Полученное очищен весь клеточный экстракт (WCE) осаждают с использованием 20% ТСА для прямого анализа общего белка в ДСН-ПААГ с последующим Вестерн-блоттингом. Экстракты также пригодны для аффинной очистки специфических белков, обнаружение посттрансляционной модификации или анализа совместного очистки белков. Как и в случае большинства протоколов очистки белка, некоторых ферментов и белков может потребовать уникальных условий или буфер композиций для их очистки и другие может быть нестабильным или нерастворимыми в условиях указано. В последнем случае, протокол, представленные может стать полезной отправной точкой для эмпирически определить лучших шарик избиение стратегии для извлечения и очистки белков. Мы покажем, добыче и очистке Эпитоп-меченый SUMO E3 лигазы, Siz1, клеточный циклрегулируется белком, который становится одновременно и SUMOylated фосфорилированному, а также SUMO-целевых убиквитином субъединицы лигазы, Slx5.
Introduction
Огромная сила дрожжей генетики является легендарным, но подготовка и анализ нативных белков от почкующихся дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE, часто сопряжено с проблемами. Последнее обусловлено значительной механической прочностью и эластичностью дрожжевой клеточной стенки 1. Различные средства были описаны ферментативные, химические, механические и на основе давления разрушение клеток дрожжей для получения цельноклеточной белкового экстракта 2-6. Эти методы различаются по их эффективности для получения клеточного представителя, родной экстракты белка, который может быть использован для последующего анализа или очистки. Например, стена дрожжевой клетки могут быть удалены с литических ферментов (например, зимолиазой), и в результате spheroblasts может быть нарушена сдвига, моющие средства, или осмотический лизис освободить белков. Этот подход был успешно использован в качестве отправной точкой для многих субклеточном фракционирования но это требует длительной инкубации, которые не совместимы со стабильностью некоторые белки 7.
Собственные лизису дрожжей реагентов (например, моющих средств) для химической экстракции белков клеток дрожжей являются коммерчески доступными, но эффективность этих реагентов в экстракции белков и их влияние на последующее биохимическая характеристика белков не всегда ясно, 8. Гомогенизаторов высокого давления, часто упоминается как французский пресс, эффективно разрушить дрожжевые клетки, сначала подвергать их воздействию высокого давления, а затем их экструзии через небольшое отверстие в напорной камере. Этот метод обеспечивает высокое качество экстрактов но оборудование очень дорого и не могут быть пригодны для небольшого количества клеток или несколько образцов 9. Таким образом, механическое разрушение клеток дрожжей в шаровой мельнице часто методом выбора для родных дрожжей белковых препаратов 10. Этот метод включает механическое разрушение клеточной стенки дрожжей с кислотно-вапролить стеклянные шарики, которые могут быть проведены с различными шейкеры, vortexers или шаровых мельниц. Следует отметить, что этот метод может использоваться, чтобы одновременно обрабатывать множество меньших образцов (1 мл клеток или меньше). Много различных бусин или бисера матриц нарушения мельница теперь коммерчески доступных сорвать практически любой тип клеток в 2 мл пробирок. С учетом других методов и оборудования, шаровой мельнице имеет дополнительное преимущество, что разрушение клеток дрожжей происходит очень быстро, что помогает сохранить посттрансляционных модификаций, таких как сумоилирование, особенно когда соответствующие буферы с протеазы и / или ингибиторы протеасом используются и температура выдержки контролируется.
Этот протокол фокусируется на быстрое, эффективное и надежное извлечение эндогенных и сверхэкспрессированные белками в мягких условиях с конечной целью сохранения функции белка, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций. Рост средств массовой информации, буфер лизиса клетоккомпозиции и настройки стана шарика оптимизированы для поддержания белковых взаимодействий и пост-трансляционных модификаций, таких как SUMOylation и убиквитилированию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Очистка 6xHis-меченных белков выражается в перспективных дрожжевых клеток в естественных условиях
1. Рост дрожжевых клеток и индукции экспрессии белка
(С изменениями из 2)
ВАРИАНТ: Использование логарифмически растущей культуры дрожжей выражающий интерес белок вместо галактозы-индуцированных культур описано ниже.
- Преобразование клетки Gal + дрожжевого штамма плазмидой, кодирующей галактозы индуцируемый 6 × His-меченый белок выбора. Например, см. список реагентов.
- Трансформанты инокулируют в 5 мл соответствующей селективной среде (например, SD-урацил), содержащей 2% сахарозы. Инкубируют при 30 ° CO / N, вращается.
- Развести O / N культуру таким образом, что оптическая плотность при 600 нм меры 0,3 (OD 600 = 0,3) в 33 мл селективной среде, содержащей 2% сахарозы. Растут при 30 ° С, дрожь (Δ150 оборотов в минуту).
- Когда культура достигла OD 600 = 0,8-1,5, Индуцируют экспрессию целевого белка добавлением 17 мл 3 раза YEP с 6% галактозы (Рецепт в таблице 1), в конечной концентрации 1x YEP, содержащей 2% галактозу. Общий объем культура в настоящее время 50 мл. Инкубировать, встряхивании при 30 ° С в течение еще 5-6 часов.
Примечание: объем культуры можно варьировать. На шаге 1.3, разбавленного в две трети от желаемого конечного объема. На шаге 1.4, добавить одну треть конечного объема 3x YEP / 6% галактозу. - Измерить OD 600 индуцированного культуры и центрифуги Δ150-200 OD 600 единиц клеток в течение 5 мин при 5000 оборотах в минуту при 4 ° С.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл ледяной PBS с 1x 1x коктейль ингибиторов протеаз и трансфер в 2 мл пробирку крышкой.
- Центрифуга клеток в течение 1 мин при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С. Слейте супернатант.
- Привязка замораживании осадка клеток в жидком азоте с последующим немедленным лизиса клеток или хранения при -80 ° С до дальнейшего использования.
- Для замороженных осадок клеток из предыдущего шага, добавьте 200 мкл промытый кислотой стеклянных шариков и 500 мкл ледяного буфера для лизиса (Рецепт в таблице 1 или использовать клеточный лизис буфера выбора).
- Кратко пипетку вверх и вниз. Он не требуется для полного ресуспендируют осадок клеток. Хранить трубы на льду во все времена.
Примечание: В конце кончика пипетки может быть обрезан перед отбором, вверх и вниз. - При 4 ° С, место трубки (ы) с клетками в шаровую мельницу, баланс, замок, и запустить машину в соответствии с инструкциями производителя.
- Запустите шарик колотушки содержащий трубу (трубы) в течение 20 с при 5,5 м / сек, а затем поместить на мокрой льду в течение 1 мин. Повторить 6 раз в общей сложности.
- Очистить извлеченных белков центрифугированием в течение 15 минут при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: удалить небольшие частицы центрифугированием через фильтр SPINX.
- Подготовка образца всей электронной клеткиРаспаковать (WCE), чтобы подтвердить наличие интересующего белка на Вестерн-блот:
- Добавить WCE, соответствующей 2 OD 600 единиц клеток (например, 5 мкл очищенного экстракта при 200 OD 600 единиц клетки собирали) в 800 мкл 20% трихлоруксусной кислоты (TCA). Vortex перемешать.
- Центрифуга в течение 2,5 мин при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С. Слейте супернатант, но будьте осторожны, чтобы сохранить гранул.
- Добавить 800 мкл 2% ТХУ к осадку и вихревые трубки с последующим центрифугированием в течение 2,5 мин при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С. Слейте супернатант, но будьте осторожны, чтобы сохранить гранул.
- Добавить 100 мкл буфера для образцов TCA (Рецепт в таблице 1), вихревые для растворения гранул. Примечание: Если образец буфера становится кислой (желтеет) после добавления к осадку, добавляют аликвоты Δ10 мкл Трис-основания [1M], пока образец синий снова.
- Выдержите в 100 ° C тепла блока в течение 2-5 мин.
- Vortex AGАйн, чтобы полностью раствориться, если остатки гранул по-прежнему присутствуют. Гранул, полученных этим методом, как известно, трудно полностью раствориться. Это может занять Δ10 мин встряхиванием до полного растворения гранул.
- Магазин образца при -80 ° С до дальнейшего использования.
- Привязать не заморозить оставшиеся аликвоты очищена WCE в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С до дальнейшего использования.
3. Пакетная очистки белков от Гомогенаты Дрожжи клеточной
Примечание: Этот способ очистки был оптимизирован для очистки 6xHis-меченных белков на Co 2 + металл смоле.
- Смола уравновешивания
- Для образца очищен WCE полученных из Δ20-40 OD 600 единиц клетки, добавляют 50-100 мкл смолы в микроцентрифуге трубки. Белки экстрагировали из клеток, которые не экспрессировали нужный белок или неспецифический смолу, такую как амилоза, могут быть использованы в качестве контрольныхс для неспецифического связывания.
- Вымойте смолы 5x с 1 мл промывочного буфера: Обратить верхней поверх нижней части, пока смола не ресуспендированы, а затем вращаться в течение 1 мин при 5000 оборотах в минуту при температуре 4 ° C. Аспирируйте супернатант.
Обратите внимание: если выполнение экстракции и очистки в тот же день, смолы уравновешивания может быть выполнена до извлечения.
- Связывание белка для аффинной очистки
- Добавить 100-200 мкл очищенного лизата (Δ20-40 OD 600 единиц) в 50-100 мкл промытых шариков, и довести общий объем до 1 мл лизирующего буфера.
- Инкубируют с нутации или качания при 4 ° С в течение 2-5 час.
- Вращаться в течение 1 мин при 5000 оборотах в минуту при температуре 4 ° C.
- При желании сохранить образец оставшейся надосадочной жидкости для последующего анализа несвязанных белков. TCA осадок, как описано выше для WCE (шаг 2.6).
- Мытье смолы связанные белки 5x с 1 мл промывочного буфера, а затем спин течение 1 мин при 5000 оборотах в минуту при4 ° С. Храните образцы холодно во время мытья.
- Элюцию связанных белков
- Добавить 150 мкл буфера для элюции в смолу колебаться при 4 ° С в течение 5 мин, вращение течение 1 мин при 5000 оборотах в минуту при 4 ° С и сохранить супернатант в новую пробирку. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: повторяется 2 раза и бассейн элюирований.
- Подготовка образцов для элюированной Вестерн-блот: К 25 мкл элюированных белков, добавляют 25 мкл 2x литий додецилсульфата (LDS) буфере для образца с 2 мкл β-меркаптоэтанола (BME) и инкубируют при 100 ° блоке тепла С в течение 2 мин.
Примечание: Стандартные 2Х Laemmli буфера для образцов могут быть также использованы. - Привязка замораживание избыточной элюированного белка в жидком азоте.
ВАРИАНТ: полоса оставшихся белков из смолы с равным объемом 2x буфера дл образца LDS при 65 ° С в течение 5 мин, удаление LDS-элюированных белков в новую пробирку, затем добавляют 2 мкл BME в элюированных белков, а не со смолой. Этот порядок, чтобы предотвратить удаление любых ионов или антител, которые сопряжениеТед к шарикам. - Магазин образцы при -80 ° С до дальнейшего использования.
- Вестерн-блот и зонд с соответствующими антителами для визуализации белков.
- Загрузите 10-20 мкл (Δ1-3 OD 600 единиц) каждого образца и 3-10 мкл белка лестницы в SDS-PAGE гель выбора. Гели обычно используются для этого протокола включают 4-12% Bis-Tris и 8% Трис-глицина.
- Выполнить геля при 200 В в течение 50 мин.
- Передача белков из геля на мембрану PVDF полусухим передачи на 19 В в течение 20-30 мин (рецепт в таблице 1).
- Блок мембраны в 4% milk/1x трис-буферном солевом растворе TWEEN (TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре или O / N при 4 ° С (рецепт в таблице 1).
- Инкубируйте мембраны с первичным антителом к эпитопу-меченного белка в 4% milk/1x TBST в течение 1-3 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С.
- Вымойте мембраны 3x по 5 мин с 1 × TBST.
- Выдержите мембраны с соответствующимвторичный пероксидазой хрена (HRP) антитела, конъюгированного в течение 1-3 ч при комнатной температуре.
- Мытье мембраны 3x в течение 15 минут в каждом большом объеме 1 × TBST.
- Обложка ECL мембрану с подложкой и завернуть в обертку Сарана.
- Expose мембраны для фильма и развиваться, чтобы визуализировать белки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наши репрезентативные результаты показывают, что описанные шарик избиение и белки протокола экстракции полезно для воспроизводимого препарата белков для множества последующих применений (сведены в таблицу 2). SDS-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси из WCEs показывают, что широкий спектр белков (~ 12 до> 250 кДа) можно воспроизводимо извлеченный из дрожжевых клеток (фиг. 1А). Дискретные полосы в диапазоне молекулярных масс свидетельствуют о высоком экстракты белка. Качество экстракты могут быть подтверждена вестерн-блоттинга для специфического эпитопа-меченных белков. Показанный является представителем результат для галактозы сверхэкспрессированных, V5-меченый SUMO лигазу Siz1 которая мигрирует на Δ120kDa (рис. 1В). Как правило, частично разрушенным белков приводит к запуску несколько фрагментов ниже ожидаемого веса, но вот только полноразмерный белок наблюдается. Кроме того, высокий молекулярный вес аддуктов данного белкаможет указывать на пост-трансляционных модификаций. Например, мы показываем галактозу сверхэкспрессированных SUMOylated Siz1Δ440 и полной длины Siz1 (рис. 1в и рис 1D). Изменения также может быть сохранена на эндогенно выразил Siz1 (рис. 1д).
Мы предоставляем репрезентативные результаты, что два ядерных белков обогащенного Slx5 и Siz1Δ440, были успешно очищают от наших WCEs (рис. 2A, 2B и 2C). В частности, мы показываем, что 6xHis-меченый белок (рис. 2А; Slx5) может быть близость очищают от наших WCEs как в родной и денатурирующих условиях. В противоположность этому, Slx5-GST (рис. 2В) и Siz1Δ440-HA (рис. 2С) не хватает Эпитоп 6xHis но в естественных условиях все еще взаимодействуют с металлом смоле в имидазола специфики. Мы полагаем, что Siz1, и в меньшей степени SLX5, способны связывать металлоаффинной смоле через их металл-координационный кольцевой домен. Хотя, насколько нам известно, данный феномен до сих пор не сообщили, аналогичная ситуация была описана в которой холерного токсина субъединицы связывает Ni 2 + смоле таким образом, опосредовано его естественной остатков гистидина 11. Важно отметить, что это наблюдение показывает, что белков в WCE, по крайней мере частично, изначально сложен.
Особенно для изучения функции белка важно, чтобы показать, что белковые комплексы остаются нетронутыми в целых клеточных экстрактов. Наши репрезентативные данные показывают, что Siz1Δ440, Slx5 и PGK1 (цитозольного белка, который служит в качестве управления загрузкой) присутствовали в WCEs. Siz1Δ440 очищали из этих экстрактов на основе присущей способностью связываться с металлом сродство смолы (сравните фиг.2С). Когда Slx5 и Siz1 были ко-экспрессируются в клетках дрожжей, Slx5 уровней в элюаты увеличилось,поднимая возможность что Slx5 могут взаимодействовать с Siz1 (рис. 3).
Рисунок 1. Присутствие неповрежденной и SUMOylated белков в дрожжах клеточного лизата после экстракции. Если не указано иное целом клеточные экстракты были получены, как описано в данном протоколе. Образцы были разделены SDS-PAGE и вестерн-блоттинга после зондировали антителами либо HA, V5, или Myc теги эпитоп. Штаммы дрожжей, представлены в таблице 3. ВБ: вестерн-блоттинга. () Репрезентативные пробы осажденного ТХУК WCE (СВО от 2514 (две полосы слева) и YOK 2592 (две полосы справа), (Δ0.2 OD / переулок)) были визуализированы с помощью окрашивания геля пятно ( Материалы см. раздел). (B) Дорожка 1 и 2: гомогенатах штамм дрожжей СВО 2510 и 251 YOK2, содержащий галактозу сверхэкспрессированных Siz1-V5/6xHIS. Обратите внимание на отсутствие частично деградированные фрагменты белка. По неизвестным причинам, данный образец не раскрывает SUMOylated аддуктов при зондировании анти-V5 антитела. Тем не менее, сумоилирование могут быть обнаружены с анти SUMO (анти-Smt3) антитело, как показано на рис. 1D. (C) переулок, дом 3 и 4: гомогенатами штамм дрожжей YOK 2508 и 2509 YOK содержащие галактозу сверхэкспрессированных Siz1Δ440-HA. (D), дорожка 5, 6 и 7: галактоза-сверхэкспрессии Siz1-V5/6xHIS очищали с использованием Co 2 + металл смоле, элюировали 200 мМ имидазола, и зондируют анти-V5 (дорожка 5), анти-Smt3 (дорожка 6). Lane 7 reprobe из дорожка 6 с анти-V5 антитела. и показывает как Siz1 и SUMOylated Siz1 аддуктов (Smt3 N). (E) полоса 8: JD52 дикого типа клеток, содержащих эндогенные уровни Myc-меченый Siz1 (СВО 2397). Очищенного лизата получали с использованием млекопитающих буфера для лизиса. Lane 9: LYнасытить супернатанта после 2-часовой инкубации с анти-V5 агарозы. Обратите внимание SUMOylated аддуктам Siz1. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 2. Очистка сверхэкспрессированного RING-домен, содержащий белки с TALON смолы сродство металла. Галактоза индукции белка экстракцию и очистку проводили, как описано в данном протоколе. Очистку проводили при нативных условиях и денатурирующих условиях, для которых гуанидина гидрохлорид добавляют к образцу до 6 м до инкубации смолой. Лизата вращался с обеих амилозы смолы управления (А) и TALON металла сродство смолы (T). Белки элюировали 200 мМ имидазола в элюирующего буфера. Образцы разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттингу(ВБ) с антителами к соответствующему тегу Эпитоп.) Галактозо-индуцированной Slx5-V5/6xHIS (СВО 2096) очищают смолой TALON под своей и денатурирующих условиях B) галактозо-индуцированной Slx5-GST (СВО 2071) был очищаться TALON смолы в родной, но не денатурирующих условиях. Предположительно, металла координации RING домен взаимодействует со смолой TALON при правильном сложить. C) галактозо-индуцированной Siz1Δ440-HA (СВО 2353) также очищается TALON смолы в родной, но не денатурирующих условиях. Эти белки не содержат 6xHis тегов, но каждый делает в нем кольца домена, что, естественно, координирует Zn 2 + и может давать возможность неразрывно связывают TALON Металл смоле при правильном сложить. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 3. Co-очистка сверхэкспрессированные белков на смоле TALON сродство металла.
Slx5-GST и Siz1Δ440-HA были выражены сами по себе или в комбинации (+ / -) в клетках JD52 (штаммы YOKs 2353, 2402, 2224 соответственно). Белки экстрагировали, как описано (ВХР) и лизаты nutated с TALON сродство металла смолы (см. Рисунок 2). Белки элюировали из смолы 200 мМ имидазола в элюирующего буфера (элюата) и получили в буфере образца LDS. Белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга после зондировали антителом к тегу HA или тег GST соответственно. Равные загрузки белков подтверждено PGK качестве управления загрузкой. Обратите внимание, что Slx5 очистки повышается в присутствии Siz1Δ440. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
| Решение | Компоненты | Комментарии |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 г дрожжевого экстракта 60 г пептона в 700 мл DDH 2 O | Смешайте ингредиенты и автоклав для стерилизации. Добавить стерилизовали фильтрованием галактоза до 6% в отдельные аликвоты 3x YEP когда готовый к использованию |
| TCA буфера для образца | 15% глицерина 80 мм Трис-основания (не pH'd) 3,5% SDS бромфенола синие "по вкусу". Принесите объемом до 25 мл DDH 2 O | Перед включением добавить 40 мкл β-меркаптоэтанола (BME) до 1 мл буфера для образцов TCA |
| Промывочного буфера | 50 мМ HEPES, рН 7,3 200 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 20 мМ имидазола | Имидазола используется для Ni 2 + или Co 2 + металл аффинной очистки только |
| Лизирующего буфера | 50 мМ HEPES, рН 7,3 200 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 10 мМ имидазола 1x коктейль ингибитора протеазы Добавить коктейль ингибитора протеазы непосредственно перед использованием. Имидазола используется для Ni 2 + или Co 2 + металл аффинной очистки только. ВАРИАНТ: 25 мМ N-этилмалеимидом (цистеин ингибитор протеазы, сохранить сумоилирование), 1 мМ орто-ванадата натрия (протеин-тирозин-фосфатазы, ингибитор) и / или другие определены эмпирически ингибиторы протеаз на основе конкретной области исследований | |
| Буфера для элюции | 50 мМ HEPES, рН 7,3 200 мМ NaCl, 200 мМ имидазола | Имидазола использоваться, чтобы конкурировать за места связывания гистидин в Ni 2 + или Co 2 + металл аффинной очистки только. Другие методы элюции может быть использован для различных смол аффинностью. |
| Полусухое буфера передачи (10x) | В 1 л DDH 2 O: 58 г трис 29,3 г Глицин 18,75 мл 20% SDS | Чтобы 1x полусухого буфера передачи: смешайте 100 мл полусухого 10x Буфер передачи с 200 мл метанола и 700 мл Ddh 2 Os |
| Tris солевым буфером (TBS, 10x) | 50 мл 1 М Трис-HCl, рН 8,0, 150 мл 5 М NaCl 300 мл DDH 2 O | Чтобы 1x TBST, смешайте 100 мл 10x TBS 900 мл DDH 2 O и добавить 1 мл Твин-20 |
Таблица 1. Растворы и буферы.
| Применение | Количество клеток | Следующие шаги |
|---|---|---|
| Лизиса клеток | 150-200 ОР собрано осадок клеток | Шарик избиения, как описано в шаге 2 |
| Вестерн-блоттинга WCE | 2 ОП лизированных клеток, полученных | Подготовка к Вестерн-блот на TCA осадков как описано в пункте 2.6. Δ0.3 единиц ОП (Δ15 мкл) выбежал на гель |
| Affinity очистки и / или Pulldown | 30 ОР лизированных клеток | Привязка, элюируют и подготовить белков, как описано в шагах 3.2 и 3.3 |
| Приблизительно 1-2 ОП (если полученный, как на шаге 3.3) | Вестерн-блоттинга, как описано в пункте 3.4 |
Таблица 2. Обзор режимов для настоящего Протокола.
| Название | Соответствующие генотипу или родительский штамм | Плазмиду (ы) или вставки кассеты | Ссылка |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATa ura3-52-his3 Δ200 leu2-3, 112-trp1 Δ63 Lys2-801 | Dohmen соавт., 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (БОК 629, OpenBiosystems Дрожжи GST коллекции YSC4515-202484078) | это исследование |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (БОК 390) | это исследование |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (БОК 629, OpenBiosystems Дрожжи GST коллекции YSC4515-202484078); pRS425 (БОК 343) | это исследование |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-БДКК-Siz1Δ440-HA (БОК 795) | это исследование |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (эндогенно отмеченном) | это исследование |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (БОК 629, OpenBiosystems Дрожжи GST коллекции YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-БДКК-Siz1Δ440-HA (БОК 795) | это исследование |
| YOK 2501 | MHY3765, альфа типа спаривания, ura3-52, Lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; MAT-alpha2Δ :: kanMX | Се и др.., 2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 MAT-alpha2Δ :: kanMX (СВО 2501) | pAG425-GAL1-БДКК-Siz1Δ440-HA (БОК 795) | это исследование |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; MAT-alpha2Δ :: kanMX (СВО 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (БОК 629, OpenBiosystems Дрожжи GST коллекции YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-БДКК-Siz1Δ440-HA (БОК 795) | это исследование |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; MAT-alpha2Δ :: kanMX (СВО 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (БОК 898); pRS425 (БОК 343) | это исследование |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; MAT-alpha2Δ :: kanMX (СВО 2501) | Slx5-белком А (БОК 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (БОК 898) | это исследование |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (СВО 2397) | msn5Δ :: гигромицин | это исследование |
| YOK 2592 | msn5Δ :: гигромицин в JD52 (СВО 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | это исследование |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (БОК 898) | это исследование |
Таблица 3. Штаммов дрожжей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол сосредоточен на подготовке нетронутыми, родной, и после трансляции модифицированных белков из перспективных дрожжевых клеток для вниз по течению приложений. Перед этим протоколом, очень важно, чтобы определить, если интересующего белка могут быть легко обнаружены в экстрактах, полученных белков в денатурирующих условиях 12. Если поликлональных антител, которые не доступны может быть выгодно, чтобы эпитоп-метку белка, представляющего интерес, так что слитый белок может быть обнаружен на Вестерн-блоттинга. В настоящем протоколе, мы отмеченных SIZ1 с HA, 6xHis-V5 или Myc теги Эпитоп и эта стратегия позволила нам четко определить белка и его SUMOylated форм на Западной пятна (рис. 1). У нас был меньший успех обнаружения GFP-меченных белков, возможно, из-за высокого сродства анти-GFP антител трудно получить (данные не показаны). Другой важный вопрос касается уровня экспрессии интересующего белка. Уровни отдельныхбелки широко варьировать в перспективных дрожжевых клеток 4 и некоторые белки должны быть избыточно экспрессируется так что они могут быть обнаружены и / или очищена. Галактоза индуцируемый векторы для экспрессии высокого уровня из дрожжевого гена 2. В случае Siz1, мы смогли обнаружить полную длину или усеченный белок при экспрессии из хромосомной-меченый ORF, или когда экспрессируется под контролем сильного промотора галактозы индуцибельной из плазмиды (фиг. 1). Использование усечения может быть полезным в структуре / анализов функции или когда полная длина молекулы трудно выразить или нестабильной. В то время как галактоза-индуцированной сверхэкспрессией улучшает обнаружение и очистки белков, он имеет четкие ограничения при изучении физиологическое значение потенциала клеточного цикла конкретных посттрансляционных модификаций и взаимодействий. Например, сумоилирование из Siz1 наиболее распространен в G2 / M стадии клеточного цикла и модификации или взаимодействийсверхэкспрессированную белка, возможно, придется быть подтверждены другими экспериментальными средствами. Наконец, добавление специфической протеазы, фосфатазы и / или ингибиторы протеасом является важным фактором для успеха этого протокола. Как правило, наилучшие результаты получают при добавлении этих ингибиторов до клетки замораживают и в добыче и разбавление буферов. Добавлением ЭДТА, хелатирующий агент иона металла иногда присутствуют в коктейль ингибитора протеазы, не рекомендуется, поскольку это может помешать последующей очищения сродство металла.
Белки экстракты, полученные путем шарик-биение хорошо подходят в качестве исходного материала для очистки отдельных белков. В частности, мы показываем, что сверхэкспрессированных Slx5 несет тег 6xHis сродства может быть очищена от WCEs использованием смолы сродство металла (рис. 2А). Чтобы сохранить посттрансляционных модификаций и уменьшить деградацию белка, 6 × His-меченных белков часто очищенный в денатурирующих условиях5. Тем не менее, существуют различные преимущества, связанные с очистки белков в естественных условиях. Например, эти белки могут совместно очищают с партнерами по связыванию или могут быть использованы в последующих анализов в пробирке 13,14. В случае Siz1 и Slx5 мы интуитивно установлено, что оба белка обладают внутренней сродство к смоле вл ющего сродство металла, независимо от тега 6 × His, и это наблюдение предложено нам, что оба белка предполагается родной подтверждений. К сожалению, правильному сворачиванию и биологическая активность очищенных белков должен быть определен от случая к случаю. Для этого, размещение сродством и эпитоп теги либо на амино-или карбокси-конце, может значительно влиять на активность или стабильность слитого белка и является важным фактором в планировании стратегии очистки белков.
Будущая работа будет сосредоточена на том, как улучшить пост-трансляционных модификаций во время очистки, для экзаменаPLE с помощью дефицитом протеазы штаммы дрожжей, различные ингибиторы протеазы или другие теги аффинностью. Мы прогнозируем, что этот протокол в его нынешнем или буфер оптимизированный форму следует использовать масштабируемую исследование экстракции, очистки и последующего многие начинающие дрожжевых белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим всех членов Kerscher лаборатории за их поддержку. Мы благодарим Марка Хохштрассер для штамма дрожжей MHY3765. Эта работа была поддержана грантом NSF 1051970 (в порядке), и Медицинского института Говарда Хьюза Бакалавриат Путешествия грантов и Монро Ученые программы Грант (Е. С.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al.
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
