Summary
إعداد جودة عالية مقتطفات خلية الخميرة هو خطوة أولى ضرورية في تحليل البروتينات الفردية أو proteomes بأكمله. نحن هنا وصف بروتوكول التجانس سريعة وفعالة، وموثوقة لخلايا الخميرة في مهدها الذي تم الأمثل للحفاظ على وظائف البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية.
Abstract
التجانس بالضرب حبة هو وسيلة سريعة وفعالة لإطلاق سراح DNA، RNA، البروتينات، ونواتج الأيض من خلايا الخميرة في مهدها، والتي من الصعب بمكان أن يتم تعطيل. نحن هنا وصف استخدام الخالط طاحونة حبة لاستخراج البروتينات في مخازن الأمثل للحفاظ على وظائف، والتفاعلات والتعديلات بعد متعدية من البروتينات. تزرع الخلايا المتنامية غاريثمي التعبير عن بروتين من الفائدة في وسائط النمو السائل في الاختيار. يمكن استكمال وسائل الاعلام النمو مع الكواشف للحث على التعبير البروتين من المروجين محرض (مثل اللبن)، وتزامن مرحلة دورة الخلية (مثل نوكودازول)، أو تثبيط وظيفة proteasome و(على سبيل المثال MG132). الخلايا ثم مكعبات ومعلق في منطقة عازلة مناسبة تحتوي على الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات إنزيم الفوسفاتيز وإما معالجتها فورا أو تجميدها في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. ويتم إنجاز تجانس من قبل ست دورات من 20 ثانية BEAD-الضرب (5.5 متر / ثانية)، تليها كل واحد الحضانة دقيقة على الجليد. يتم مسح جناسة الناتجة بواسطة الطرد المركزي، ويمكن إزالتها عن طريق الترشيح الجسيمات الصغيرة. وعجلت الناتجة تطهيرها استخراج خلية كاملة (WCE) باستخدام 20٪ TCA للتحليل المباشر من مجموع البروتينات بواسطة SDS-PAGE تليها الغربية النشاف. مقتطفات هي أيضا مناسبة لتنقية تقارب من بروتينات معينة، والكشف عن التعديلات بعد متعدية، أو تحليل البروتينات شارك في تنقية. كما هو الحال بالنسبة لمعظم بروتوكولات تنقية البروتين، قد تكون بعض الانزيمات والبروتينات تتطلب الظروف الفريدة أو التراكيب العازلة لتنقية والبعض الآخر قد يكون غير مستقر أو غير قابل للذوبان في إطار الشروط المنصوص عليها. في الحالة الأخيرة، يجوز للبروتوكول المعروضة توفير نقطة انطلاق مفيدة لتحديد تجريبيا أفضل استراتيجية حبة الضرب لاستخراج البروتين وتنقية. نقدم لك مجموعة من استخراج وتنقية حاتمة الموسومة السومو E3 يغاز، Siz1، دورة الخليةتنظم البروتين الذي يصبح كلا sumoylated وفسفرته، فضلا عن السومو استهداف اليوبيكويتين الوحيدات يغاز، Slx5.
Introduction
قوة رهيبة من الخميرة علم الوراثة هو الأسطوري، ولكن إعداد وتحليل البروتينات الأم من الخميرة في مهدها، خميرة الخباز، غالبا ما يكون محفوفا بالمشاكل. ويرجع ذلك إلى قوة ميكانيكية كبيرة ومرونة جدار خلية الخميرة 1 هذا الأخير. وقد وصفت وسائل مختلفة لالأنزيمية والكيميائية والميكانيكية، والقائم على الضغط تعطيل خلايا الخميرة للحصول على مستخلص بروتين كامل الخلية 2-6. هذه التقنيات تختلف على نطاق واسع في فعاليتها لانتاج الخلايا ممثل وعصائر البروتين الأصلية التي يمكن استخدامها لتحليلات لاحقة أو خطوات تنقية. على سبيل المثال، يمكن إزالة جدار خلية الخميرة مع الانزيمات التحللي (على سبيل المثال zymolyase) والناتجة spheroblasts يمكن أن تتعطل عن طريق القص والمنظفات، أو تحلل التناضحي للافراج عن البروتينات. واستخدمت هذه الطريقة بنجاح كنقطة انطلاق لكثير من fractionations التحت خلوية ولكنه يتطلب حضانات مطولةغير متوافقة مع استقرار بعض البروتينات 7.
الملكية الكواشف تحلل الخميرة (مثل المنظفات) لاستخراج المواد الكيميائية للبروتينات من خلايا الخميرة متاحة تجاريا ولكن فعالية هذه الكواشف في استخراج البروتين وتأثيرها على توصيف البيوكيميائية لاحقة من البروتينات ليست دائما واضحة 8. المجانسة ارتفاع الضغط، وغالبا ما يشار الى المطابع الفرنسية، وكسر على نحو فعال خلايا الخميرة عن طريق إخضاع الأول لهم لضغط عال ومن ثم ينبثق منها من خلال فتحة صغيرة في خلية الضغط. هذه التقنية تنتج مقتطفات جودة عالية ولكن معدات مكلفة للغاية، وربما لا تكون مناسبة لكميات صغيرة من الخلايا أو عينات متعددة 9. ولذلك، تعطل ميكانيكي لخلايا الخميرة في طاحونة حبة وغالبا ما يكون الأسلوب المفضل لأصلي الاستعدادات بروتين الخميرة 10. هذا الأسلوب الذي ينطوي على اضطراب الميكانيكية للجدار خلية الخميرة مع حمض واتسليط الخرز الزجاجي، والتي يمكن أن تتم مع مجموعة متنوعة من الهزازات، vortexers أو المطاحن حبة. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في وقت واحد لمعالجة عدة عينات أصغر (1 مل من الخلايا أو أقل). العديد من حبات مختلفة أو حبة مصفوفات اضطراب مطحنة هي الآن متاحة تجاريا لتعطيل أي تقريبا نوع من نوع من الخلايا في أنابيب 2 مل. النظر في التقنيات والمعدات الأخرى، طاحونة حبة لديه ميزة إضافية أن تعطل من خلايا الخميرة يحدث سريع جدا، مما يساعد على الحفاظ على التعديلات بعد متعدية مثل sumoylation، وخصوصا عندما تستخدم المخازن المؤقتة المناسبة مع الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات proteasome و ويتم التحكم في درجة الحرارة من مقتطفات.
ويركز هذا البروتوكول على استخراج سريع، فعال، وموثوق بها من البروتينات الذاتية والإفراط في المعبر عنه في ظروف لطيف مع الهدف النهائي المتمثل في الحفاظ على وظيفة البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية. وسائط النمو، العازلة تحلل الخليةيتم تحسين التراكيب، وإعدادات طاحونة حبة للحفاظ على تفاعلات البروتين والتعديلات بعد متعدية مثل sumoylation وubiquitylation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنقية البروتينات 6xHIS الموسومة أعرب في خلايا الخميرة في مهدها في ظل ظروف الأم
1. نمو خلايا الخميرة وتحريض من بروتين تعبير
(تم التعديل من 2)
اختياري: استخدم غاريثمي تزايد الثقافات الخميرة معربا عن بروتين من الفائدة بدلا من الثقافات الجالاكتوز التي يسببها هو موضح أدناه.
- تحويل خلايا من غال + سلالة الخميرة مع ترميز البلازميد والجالاكتوز محرض 6xHIS الموسومة البروتين في الاختيار. على سبيل المثال، انظر قائمة الكواشف.
- تطعيم transformants في 5 مل من وسائل الاعلام انتقائية مناسبة (مثل SD-اليوراسيل) التي تحتوي على 2٪ سكروز. احتضان عند 30 درجة CO / N، بالتناوب.
- تمييع O / N الثقافة بحيث الكثافة البصرية في 600 نانومتر يقيس 0.3 (OD 600 = 0.3) في 33 مل من وسائل الإعلام الانتقائي مع 2٪ سكروز. ينمو بمعدل 30 درجة مئوية، والهز (Δ150 دورة في الدقيقة).
- عندما وصلت إلى ثقافة OD 600 = 0.8 -1.5، لحث تعبير عن البروتين المطلوب وذلك بإضافة 17 مل من YEP 3x مع اللبن 6٪ (وصفة في الجدول رقم 1)، لتركيز النهائي من 1X YEP مع 2٪ سكر اللبن. اجمالى حجم الثقافة هي الآن 50 مل. احتضان، والهز، عند 30 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعة إضافية.
ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم الثقافة. في الخطوة 1.3، مخفف إلى ثلثي الحجم النهائي المطلوب. في الخطوة 1.4، إضافة ثلث الحجم النهائي من 3X YEP / 6٪ سكر اللبن. - قياس OD 600 من ثقافة يسببها وأجهزة الطرد المركزي Δ150-200 OD 600 وحدة من الخلايا لمدة 5 دقائق عند 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
- Resuspend الخلية بيليه مع 1 مل من الجليد الباردة PBS 1X 1X مع البروتيني كوكتيل المانع ونقل إلى 2 مل المسمار أنبوب الغطاء.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 1 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. طاف صب.
- المفاجئة تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل، تليها تحلل فوري الخلية أو تخزين في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
> 2. تجانس خلايا الخميرة واستخراج البروتينات
- إلى الخلية بيليه المجمدة من الخطوة السابقة، إضافة 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي حمض غسلها و 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الجليد الباردة (وصفة في الجدول 1 أو استخدام العازلة تحلل الخلية من خيار).
- ماصة صعودا وهبوطا لفترة وجيزة. غير مطلوب ل resuspend تماما بيليه الخلية. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات.
ملاحظة: قد يكون خفض نهاية غيض ماصة قبالة قبل pipetting صعودا وهبوطا. - في 4 درجات مئوية، ووضع أنبوب (s) مع الخلايا في مطحنة حبة، والتوازن، وقفل، وتشغيل الجهاز وفقا للتعليمات الشركة الصانعة.
- تشغيل الخافق حبة تحتوي على أنبوب (ق) لمدة 20 ثانية في 5.5 متر / ثانية، ثم ضع على الجليد ذائب لمدة 1 دقيقة. كرر 6X في المجموع.
- مسح البروتينات المستخرجة بواسطة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. اختياري: إزالة الجسيمات الصغيرة بواسطة الطرد المركزي من خلال مرشح SPINX.
- تحضير عينة من كل خلية هxtract (WCE) لتأكيد وجود هذا البروتين من الفائدة عن طريق البقعة الغربية:
- إضافة WCE المقابلة مع 2 OD 600 وحدة من الخلايا (على سبيل المثال 5 ميكرولتر من استخراج تطهيرها إذا كانت تحصد 200 OD 600 وحدة من الخلايا) إلى 800 ميكرولتر حمض الخليك ثلاثي الكلور 20٪ (TCA). دوامة لخلط.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 2.5 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. صب وطاف، ولكن كن حريصا على الإبقاء على بيليه.
- إضافة 800 ميكرولتر من 2٪ TCA لبيليه ودوامة الأنبوب، تليها الطرد المركزي لمدة 2.5 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. صب وطاف، ولكن كن حريصا على الإبقاء على بيليه.
- إضافة 100 ميكرولتر من عينة العازلة TCA (وصفة في الجدول رقم 1)، دوامة بحل بيليه. ملاحظة: إذا أصبح عينة العازلة الحمضية (يتحول إلى اللون الأصفر) بعد بالإضافة إلى بيليه، إضافة aliquots من Δ10 تريس قاعدة ميكرولتر [1M] حتى تكون العينة الأزرق مرة أخرى.
- احتضان في ° C بلوك 100 حرارة لمدة 2-5 دقيقة.
- دوامة AGعين بحل تماما إذا بقايا بيليه لا تزال موجودة. الكريات بواسطة هذه الطريقة هي إعداد المعروف أن من الصعب حل تماما. قد يستغرق Δ10 دقيقة من vortexing للتذوب تماما الكريات.
- عينة تخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- المفاجئة تجميد aliquots من المتبقية WCE تطهيرها في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
3. تنقية البروتينات من دفعة الخليط خلية الخميرة
ملاحظة: تم تحسين هذا الأسلوب تنقية لتنقية البروتينات 6xHIS الموسومة على التعاون 2 + راتنج تقارب المعدن.
- موازنة الراتنج
- لعينة من WCE تطهيرها أعدت من Δ20 OD-40 600 وحدة من الخلايا، إضافة 50-100 ميكرولتر من الراتنج التقارب إلى أنبوب microcentrifuge. البروتينات المستخرجة من الخلايا التي لم تعبر عن البروتين المطلوب أو الراتنج غير محددة، مثل أميلوز، ويمكن استخدامها لمكافحةو للربط غير محددة.
- غسل الراتنج 5X مع 1 مل من غسل العازلة: عكس من أعلى إلى الإفراط في أسفل حتى يتم معلق الراتنج، ثم تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. نضح طاف.
ملاحظة: إذا كان أداء استخراج وتنقية في نفس اليوم، موازنة الراتنج يمكن أن يؤديها قبل الاستخراج.
- تجليد البروتين لتنقية تقارب
- إضافة 100-200 ميكرولتر من المحللة تطهيرها (Δ20 OD-40 600 وحدة) إلى 50-100 ميكرولتر الخرز غسلها، وجلب الحجم الإجمالي إلى 1 مل مع العازلة تحلل.
- احتضان مع الإيماءة أو الهزاز في 4 درجات مئوية لمدة 2-5 ساعة.
- تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
- إذا رغبت في ذلك، توفر عينة من طاف المتبقية لتحليلها لاحقا من البروتينات غير منضم. TCA تترسب على النحو المفصل أعلاه لWCE (الخطوة 2.6).
- غسل الراتنج مع بروتينات محددة 5X مع 1 مل من غسل العازلة، تليها تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في4 ° C. الاحتفاظ بعينات الباردة خلال يغسل.
- شطف من البروتينات ملزمة
- إضافة 150 ميكرولتر العازلة شطف إلى الراتنج، nutate عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية وحفظ طاف في أنبوب جديد. اختياري: كرر 2X وelutions بركة.
- تحضير عينة مزال لطخة غربية: ل25 ميكرولتر من البروتينات مزال، إضافة 25 ميكرولتر 2X ليثيوم دوديسيل كبريتات (LDS) عينة العازلة مع 2 ميكرولتر β-المركابتويثانول (BME)، واحتضان في درجة مئوية كتلة الحرارة 100 لمدة 2 دقيقة.
ملاحظة: يمكن أيضا معيار 2X Laemmli العازلة عينة يمكن استخدامها. - المفاجئة تجميد الزائدة بروتين مزال في النيتروجين السائل.
اختياري: قطاع المتبقية البروتينات من راتنج مع حجم مساو من 2X العازلة عينة LDS عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة البروتينات LDS-مزال إلى أنبوب جديد، ثم إضافة 2 ميكرولتر BME إلى البروتينات مزال، وليس على الراتنج. هذا النظام هو لمنع إزالة أي الأيونات أو الأجسام المضادة التي هي conjugaتيد لالخرز. - عينات في مخزن -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- لطخة غربية والتحقيق مع الأجسام المضادة المناسبة لتصور البروتينات.
- تحميل 10-20 ميكرولتر (Δ1-3 OD 600 وحدة) لكل عينة و3-10 ميكرولتر من سلم البروتين في هلام SDS-PAGE في الاختيار. المواد الهلامية تستخدم بشكل روتيني لهذا البروتوكول وتشمل 4-12٪ مكرر تريس و 8٪ تريس، جليكاين.
- تشغيل هلام في 200 V لمدة 50 دقيقة.
- نقل البروتينات من الهلام إلى غشاء PVDF عن طريق التحويل شبه الجافة في 19 فولت لمدة 20-30 دقيقة (وصفة في الجدول 1).
- غشاء كتلة في 4٪ milk/1x تريس مخزنة المالحة توين (TBST) لمدة 1 ساعة على RT أو O / N عند 4 ° C (وصفة في الجدول 1).
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية للبروتين حاتمة الموسومة من الفائدة في 4٪ milk/1x TBST لمدة 1-3 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجة مئوية.
- غسل غشاء 3X لمدة 5 دقائق مع كل TBST 1X.
- احتضان الغشاء مع المناسبةالبيروكسيداز الفجل الثانوية (HRP)، مترافق الضد لمدة 1-3 ساعة على RT.
- غسل غشاء 3X لمدة 15 دقيقة في كل من كمية كبيرة من TBST 1X.
- تغطي الغشاء مع الركيزة ECL والتفاف ساران في التفاف.
- فضح غشاء لفيلم وتطوير لتصور البروتينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائجنا ممثل تكشف عن أن بروتوكول استخراج حبة الضرب والبروتين وصف مفيد لإعداد استنساخه من البروتينات لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب (تلخيصها في الجدول رقم 2). SDS-PAGE تليها تلطيخ Coomassie من WCEs تبين أن مجموعة واسعة من البروتينات (~ 12 ل> 250 كيلو دالتون) ويمكن استخراج بتكاثر من خلايا الخميرة (الشكل 1A). نطاقات منفصلة على مجموعة من الأوزان الجزيئية تدل على ارتفاع مقتطفات البروتين الجودة. ويمكن التأكد من نوعية مقتطفات عن طريق ويسترن النشاف للبروتينات حاتمة الموسومة محددة. أظهرت هو نتيجة ممثل لالجالاكتوز-بإفراط (overexpressed)، V5 الموسومة السومو يغاز Siz1 الذي يهاجر في Δ120kDa (1B الشكل). عموما، فإن البروتينات المتدهورة جزئيا تشغيل كأجزاء متعددة تحت الوزن المتوقع، ولكن لوحظ هنا فقط بروتين كامل طول. بالإضافة إلى ذلك، عالية الجزيئية adducts الوزن من بروتين معينقد يشير التعديلات بعد متعدية. على سبيل المثال، وتبين لنا الجلاكتوز-بإفراط (overexpressed) sumoylated Siz1Δ440 وكامل طول Siz1 (الشكل 1C والشكل 1D). ويمكن أيضا أن التعديلات يجب الحفاظ على التطور الطبيعي أعرب Siz1 (الشكل 1E).
ونحن نقدم ممثل النتائج أن اثنين من البروتينات التخصيب النووي، Slx5 وSiz1Δ440، وتنقيته بنجاح من WCEs لدينا (أرقام 2A، 2B، و2C). والجدير بالذكر أن نظهر أن بروتين 6xHIS الموسومة (الشكل 2A؛ Slx5) يمكن أن يكون تقارب تنقيته من WCEs دينا على حد سواء في ظل الظروف المحلية وتغيير طبيعة. في المقابل، Slx5-GST (الشكل 2B) وSiz1Δ440-HA (الشكل 2C) تفتقر إلى حاتمة 6xHIS ولكن في ظل الظروف المحلية لا تزال تتفاعل مع الراتنج معدن تقارب بطريقة حساسة إميدازول. ونقترح أن Siz1، وإلى حد أقل SLX5، قادرين على ربط الراتنج معدن تقارب عبر البريد التنسيق المعادن مجالهم RING. في حين، على حد علمنا، لم يتم إبلاغ هذه الظاهرة وجه الخصوص، وقد وصفت حالة مماثلة في أي بكتيريا الكوليرا الوحيدات B يربط ني 2 + تقارب راتنج بطريقة بوساطة مخلفاتها الحامض الاميني الطبيعي 11. الأهم من ذلك، تشير هذه الملاحظة أن البروتينات في WCE هي، على الأقل في جزء منه، مطوية أصلا.
خاصة لدراسة وظيفة البروتين من المهم أن تبين أن بروتين المجمعات لا تزال سليمة في مقتطفات خلية كاملة. وتكشف البيانات أن ممثلنا Siz1Δ440، Slx5، وPgk1 (بروتين عصاري خلوي التي هي بمثابة تحكم التحميل) كانت موجودة في WCEs. تمت تنقية Siz1Δ440 من هذه المقتطفات يعتمد على القدرة الكامنة لربط الراتنجات تقارب المعدن (قارن الشكل 2C). عندما Slx5 وSiz1 وشاركت في المعبر عنها في خلايا الخميرة، وزادت Slx5 المستويات في eluates،أثار احتمال أن تكون Slx5 قد تتفاعل مع Siz1 (الشكل 3).
الشكل 1. جود البروتينات سليمة وsumoylated في الخميرة المحللة الخلية بعد الاستخراج. ما لم ينص على خلاف ذلك أعدت مقتطفات خلية كاملة كما هو موضح في هذا البروتوكول. تم فصل العينات بواسطة SDS-PAGE وبعد النشاف الغربية جرى التحقيق مع الأجسام المضادة إما إلى HA، V5، أو العلامات حاتمة MYC. يتم تصنيف سلالات الخميرة في الجدول 3. WB: لطخة ويسترن. (A) وكانت عينات من الممثل WCE TCA-عجلت (من يوك 2514 (مسربين على اليسار) ويوك 2592 (مسربين على اليمين)، (Δ0.2 OD / لين)) تصور من قبل تلطيخ مع هلام وصمة عار ( انظر قسم المواد). (B) لين 1 & 2: الخليط من الخميرة سلالة يوك يوك 2510 و2512 المحتوية على سكر اللبن Siz1-V5/6xHIS-بإفراط (overexpressed). لاحظ عدم وجود شظايا البروتين المتدهورة جزئيا. لأسباب غير معروفة، وهذا نموذج معين لا تكشف adducts sumoylated عندما بحثها مع الأجسام المضادة لمكافحة V5. ومع ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن sumoylation مع السومو المضادة (المضادة للSmt3) الأجسام المضادة كما هو مبين في الشكل. 1D. (C) لين 3 و 4: الخليط من الخميرة سلالة يوك يوك 2509 2508 والتي تحتوي على سكر اللبن-بإفراط (overexpressed) Siz1Δ440-HA. (D) لين 5 و 6 و 7: تمت تنقية Siz1-V5/6xHIS الجالاكتوز-بإفراط (overexpressed) باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 + معدن الراتنج تقارب، مزال مع 200 ملي إيميدازول، وبحث مع anti-V5 (حارة 5)، ومكافحة Smt3 (حارة 6). لين 7 هو reprobe من حارة 6 مع الأجسام المضادة لمكافحة V5. ويظهر كلا Siz1 وsumoylated Siz1 adducts (Smt3 ن). (E) لين 8: JD52 الخلايا wildtype التي تحتوي على مستويات الذاتية للMYC الموسومة Siz1 (يوك 2397). مسح المحللة أعدت باستخدام العازلة تحلل الثدييات. لين 9: ليأشبع طاف بعد ساعة الحضانة 2 مع anti-V5 الاغاروز. ملاحظة adducts sumoylated من Siz1. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. تنقية أكثر من التي تبديها RING المجال التي تحتوي على البروتينات مع TALON الراتنج تقارب المعادن. أجريت الاستقراء الجالاكتوز، واستخراج البروتين وتنقية كما هو موضح في هذا البروتوكول. تم إجراء تنقية ظل ظروف المحلية وتغيير طبيعة الظروف، والتي تم إضافتها إلى guanidinium هيدروكلوريد العينة إلى 6 M قبل الحضانة مع الراتنج. كان المحللة بالتناوب مع كل من الراتنج السيطرة أميلوز (A) وTALON المعادن الانجذاب الراتنج (T). ومزال البروتينات مع 200 ملي إيميدازول في شطف العازلة. تم فصل العينات بواسطة SDS-PAGE ونشف الغربية(WB) مع الأجسام المضادة إلى العلامة حاتمة المناسبة. تمت تنقية A) الجالاكتوز التي يسببها Slx5-V5/6xHIS (يوك 2096) مع الراتنج TALON في ظل الظروف المحلية وتغيير طبيعة كلا B) الجالاكتوز التي يسببها Slx5-GST (يوك 2071) كان صفيت مع الراتنج TALON في الأم، ولكن ليس تغيير طبيعة الظروف. ويفترض، يتفاعل تنسيق نطاق حلقة معدنية مع الراتنج TALON عندما مطوية بشكل صحيح. ج) وتنقيته الجالاكتوز التي يسببها Siz1Δ440-HA (يوك 2353) أيضا مع الراتنج TALON في الأم، ولكن ليس تغيير طبيعة الظروف. هذه البروتينات لا تحتوي على الكلمات 6xHIS، ولكن لا تحتوي على كل مجال RING، التي تنسق بشكل طبيعي الزنك 2 + الأيونات، وربما تمنح القدرة على ربط جوهريا TALON الراتنج الانجذاب المعدنية عندما مطوية بشكل صحيح. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل (3). شارك في تنقية البروتينات من الإفراط في الإعراب عنها بشأن TALON الراتنج تقارب المعادن.
وأعرب عن Slx5-GST وSiz1Δ440-HA في حد ذاتها أو في تركيبة (+ / -) في JD52 الخلايا (سلالات YOKs 2353، 2402، 2224 على التوالي). تم استخراج البروتينات كما هو موضح (WCE) وكانت nutated لست] مع TALON المعادن الانجذاب الراتنج (انظر الشكل 2). ومزال البروتينات من راتنج مع 200 ملي إيميدازول في شطف العازلة (شطافة) والمعد في LDS عينة العازلة. تم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE وبعد النشاف الغربية جرى التحقيق مع الأجسام المضادة إلى العلامة HA أو علامة GST حسب الاقتضاء. تأكيد المساواة التحميل من البروتينات مع PGK كعنصر تحكم التحميل. لاحظ أن Slx5 تنقية تتعزز في ظل وجود Siz1Δ440. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
| حل | مكونات | تعليقات |
|---|---|---|
| 3X YEP | 30 ز خلاصة الخميرة 60 ز ببتون في 700 مل من DDH 2 O | مزج المكونات والأوتوكلاف لتعقيم. إضافة عامل تصفية اللبن المعقم إلى 6٪ إلى مأخوذة فرد من 3X YEP عندما تصبح جاهزة للاستخدام |
| عينة العازلة TCA | 15٪ الجلسرين 80 ملي تريس قاعدة (غير pH'd) 3.5٪ SDS برموفينول الأزرق "إلى الذوق." يصل حجم إلى 25 مل مع DDH 2 O | قبل الاستخدام: إضافة 40 ميكرولتر من β-المركابتويثانول (BME) إلى 1 مل TCA عينة العازلة |
| غسل العازلة | 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.3 200 ملي مول كلوريد الصوديوم 1٪ تريتون X-100 20 ملي إيميدازول | إميدازول تستخدم لني 2 + 2 + أو التعاون المعادن تنقية تقارب فقط |
| تحلل العازلة | 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.3 200 ملي مول كلوريد الصوديوم 1٪ تريتون X-100 10 ملي إيميدازول 1X البروتيني كوكتيل المانع إضافة البروتيني كوكتيل المانع فورا قبل الاستخدام. إميدازول تستخدم لني 2 + 2 + أو التعاون المعادن تنقية تقارب فقط. اختياري: 25 ملي N-ethylmaleimide (السيستين مثبط البروتياز، للحفاظ على sumoylation)، 1 ملم orthovanadate الصوديوم (بروتين تيروزين المانع الفوسفاتيز)، و / أو مثبطات الأنزيم البروتيني تحدد تجريبيا الأخرى على أساس منطقة معينة من الدراسة | |
| شطف العازلة | 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.3 200 ملي مول كلوريد الصوديوم 200 ملي إيميدازول | إميدازول تستخدم للتنافس على مواقع الربط الحامض الاميني في ني 2 + 2 + أو التعاون المعادن تنقية تقارب فقط. ويمكن استخدام طرق أخرى لشطف للراتنجات تقارب مختلفة. |
| شبه العازلة نقل الجاف (10X) | في 1 لتر من DDH 2 O: 58 ز ز 29.3 تريس جليكاين 18.75 مل 20٪ SDS | لجعل 1X نصف جاف نقل المخزن المؤقت: مزيج 100 مل 10X العازلة نصف نقل الجاف مع 200 مليلتر ميثانول و 700 مل [ده 2 السراج |
| تريس مخزنة المالحة (TBS، 10X) | 50 مل 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 150 مل 5 M كلوريد الصوديوم 300 مل [ده 2 O | لجعل 1X TBST، خلط 100 مل 10X TBS مع 900 مل [ده 2 O وإضافة 1 مل من توين-20 |
الجدول 1. حلول والمخازن.
| تطبيق | كمية من الخلايا | الخطوات المقبلة |
|---|---|---|
| تحلل الخلية | 150-200 المواد المستنفدة للأوزون المقطوع الخلية بيليه | حبة الضرب كما هو موضح في الخطوة 2 |
| لطخة غربية من WCE | 2 المواد المستنفدة للأوزون الخلايا هي lysed أعدت | تحضير لطخة غربية عن طريق الترسيب TCA كما هو موضح في الخطوة 2.6. Δ0.3 حدات OD (Δ15 ميكرولتر) نفد على هلام |
| تقارب تنقية و / أو المنسدلة | 30 المواد المستنفدة للأوزون الخلايا هي lysed | مأزق، أزل، وإعداد البروتينات كما هو موضح في الخطوات 3.2 و 3.3 |
| حوالي 1-2 المواد المستنفدة للأوزون (إذا أعد كما في الخطوة 3.3) | لطخة غربية كما هو موضح في الخطوة 3.4 |
الجدول 2. ملخص من التطبيقات لهذا البروتوكول.
| اسم | الوراثي أو الرئيسي سلالة ذات الصلة | البلازميد (ق) أو الإدراج كاسيت | مرجع |
|---|---|---|---|
| يوك 2062 | ماتا ura3-52-HIS3 Δ200 leu2-3، 112 trp1-Δ63 lys2-801 | Dohmen وآخرون، 1995 | |
| يوك 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629، OpenBiosystems الخميرة GST جمع YSC4515-202484078) | هذه الدراسة |
| يوك 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6 TOPO (BOK 390) | هذه الدراسة |
| يوك 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629، OpenBiosystems الخميرة جمع GST YSC4515-202484078)؛ pRS425 (BOK 343) | هذه الدراسة |
| يوك 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | هذه الدراسة |
| يوك 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (الموسومة التطور الطبيعي) | هذه الدراسة |
| يوك 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629، OpenBiosystems الخميرة جمع GST YSC4515-202484078)؛ pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | هذه الدراسة |
| يوك 2501 | MHY3765، ألفا نوع التزاوج، ura3-52، lys2-801، trp1-Δ63، HIS3-Δ200، leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3؛ ubc6Δ :: TRP1؛ MAT-alpha2Δ :: kanMX | شيه وآخرون.، 2010 |
| يوك 2508 | ubc4Δ :: HIS3؛ ubc6Δ :: TRP1 MAT-alpha2Δ :: kanMX (يوك 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | هذه الدراسة |
| يوك 2509 | ubc4Δ :: HIS3؛ ubc6Δ :: TRP1؛ MAT-alpha2Δ :: kanMX (يوك 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629، OpenBiosystems الخميرة جمع GST YSC4515-202484078)؛ pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | هذه الدراسة |
| يوك 2510 | ubc4Δ :: HIS3؛ ubc6Δ :: TRP1؛ MAT-alpha2Δ :: kanMX (يوك +2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (BOK 898)؛ pRS425 (BOK 343) | هذه الدراسة |
| يوك 2512 | ubc4Δ :: HIS3؛ ubc6Δ :: TRP1؛ MAT-alpha2Δ :: kanMX (يوك 2501) | Slx5 البروتين A (BOK 762)؛ pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (BOK 898) | هذه الدراسة |
| يوك 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (يوك 2397) | msn5Δ :: هيغروميسين | هذه الدراسة |
| يوك 2592 | msn5Δ :: هيغروميسين في JD52 (يوك 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | هذه الدراسة |
| يوك 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (BOK 898) | هذه الدراسة |
الجدول 3. سلالات الخميرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويركز هذا البروتوكول على إعداد سليمة، والأم، وتعديلها بعد translationally البروتينات من خلايا الخميرة في مهدها لتطبيقات أسفل تيار. قبل محاولة هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لتحديد ما إذا كان البروتين من الفائدة يمكن أن يتم الكشف عن البروتين بسهولة في مقتطفات أعدت في ظل ظروف تغيير طبيعة 12. إذا الأجسام المضادة ليست متاحة أنه قد يكون من المفيد أن حاتمة العلامة بروتين من الفائدة بحيث يمكن الكشف عن هذا البروتين الانصهار على البقع الغربية. في هذا البروتوكول، ونحن الموسومة SIZ1 مع HA، 6xHIS-V5، أو العلامات حاتمة MYC وسمحت لنا هذه الاستراتيجية إلى تحديد واضح للبروتين وأشكاله sumoylated على البقع الغربية (الشكل 1). كان لدينا أقل نجاح الكشف عن GFP الموسومة البروتينات، ربما بسبب ارتفاع تقارب الأجسام المضادة المقاومة للGFP يصعب الحصول عليها (لا تظهر البيانات). وثمة مسألة هامة أخرى على مستوى التعبير عن بروتين من الفائدة. مستويات الفرديةالبروتينات تختلف على نطاق واسع في خلايا الخميرة في مهدها 4 وبعض البروتينات يجب أن تكون بإفراط (overexpressed) بحيث يمكن الكشف و / أو تنقيته. تتوفر ناقلات الجالاكتوز محرض للتعبير رفيع المستوى من الجين الخميرة من الفائدة 2. في حالة Siz1، تمكنا من الكشف عن كامل طول أو البروتين اقتطاع عندما أعرب من ORFS صبغويا الموسومة أو عندما أعرب تحت سيطرة قوي محرض PROMOTOR الجالاكتوز من البلازميد (الشكل 1). استخدام truncations قد تكون مفيدة في هيكل / تحليلات وظيفة أو عندما جزيء كامل طول من الصعب التعبير عن أو غير مستقر. بينما من overexpression الجالاكتوز التي يسببها يعزز كشف عن البروتين وتنقية، لديها حدود واضحة عند دراسة مدى ملاءمة الفسيولوجية للدورة الخلية التعديلات بعد متعدية محددة المحتملة والتفاعلات. على سبيل المثال، sumoylation من Siz1 هو الأكثر انتشارا في G2 / M مرحلة من مراحل دورة الخلية، والتعديلات أو تفاعلاتقد يكون هذا البروتين بإفراط (overexpressed) إلى تأكيد من الوسائل التجريبية الأخرى. أخيرا، إضافة البروتيني محددة، الفوسفاتيز، و / أو مثبطات proteasome واعتبار مهم لنجاح هذا البروتوكول. عموما، يتم الحصول على أفضل النتائج من خلال إضافة هذه المثبطات قبل أن يتم تجميد الخلايا وإلى استخراج وتخفيف مخازن. إضافة EDTA، خالب أيون الفلز الحاضر في بعض الأحيان في الكوكتيلات مثبط البروتياز، ليس من المستحسن لأنها قد تتداخل مع اللاحقة تنقية تقارب المعدن.
مقتطفات البروتين التي حصلت عليها حبة الضرب هي مناسبة كذلك بدء المواد اللازمة لتنقية البروتينات الفردية. على وجه التحديد، وتبين لنا أن Slx5 بإفراط (overexpressed) تحمل علامة تقارب 6xHIS يمكن تنقيته من WCEs باستخدام راتنج تقارب المعدنية (الشكل 2A). للحفاظ على التعديلات بعد متعدية والحد من تدهور البروتين، وغالبا ما تنقية البروتينات 6xHIS الموسومة تحت ظروف تغيير طبيعة5. ومع ذلك، هناك مزايا واضحة المرتبطة تنقية البروتينات في ظل ظروف الأصلي. على سبيل المثال، هذه البروتينات قد شارك في تنقية مع الشركاء ملزمة أو يمكن أن تستخدم في لاحقة في فحوصات المختبر 13،14. في حالة Siz1 وSlx5 قررنا مصادفة أن كلا من البروتينات تظهر تقارب جوهري لراتنج تقارب المعدن، مستقلة عن العلامة 6xHIS، واقترحت هذه الملاحظة لنا أن كلا من البروتينات المفترض تأكيد الأصلي. للأسف، النشاط للطي والبيولوجية المناسبة من البروتينات المنقى لابد من تحديدها على أساس كل حالة على حدة. تحقيقا لهذه الغاية، ووضع الألفة وحاتمة به إما في محطة الأمينية أو كربوكسي، قد تؤثر بشكل كبير على النشاط أو استقرار البروتين الانصهار واعتبار مهم في التخطيط لاستراتيجية تنقية البروتين.
وسيركز العمل في المستقبل على كيفية تعزيز التعديلات بعد متعدية خلال تنقية، لامتحانالتنوير القائل من خلال استخدام البروتيني سلالات نقص الخميرة، مثبطات الأنزيم البروتيني مختلفة، أو به الألفة والمودة الأخرى. نتوقع أن هذا البروتوكول في شكلها الحالي أو العازلة الأمثل قابلة للتطبيق لاستخراج وتنقية ودراسة لاحقة للتحجيم من العديد من البروتينات الخميرة في مهدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونحن نشكر جميع أعضاء المختبر Kerscher لدعمهم. نشكر كافة Hochstrasser للخميرة سلالة MHY3765. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة 1051970 (إلى OK) ومعهد هوارد هيوز الطبي الجامعية منحة السفر ومونرو علماء برنامج منح (لES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al.
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
