Summary
Framställningen av hög cellernas kvalitet jästextrakt är ett nödvändigt första steg i analysen av enskilda proteiner eller hela proteom. Här beskriver vi en snabb, effektiv och tillförlitlig homogenisering protokoll för spirande jästceller som har optimerats för att bevara proteinet fungerar, interaktioner och post-translationella modifieringar.
Abstract
Homogenisering av pärla stryk är ett snabbt och effektivt sätt att frigöra DNA, RNA, proteiner och metaboliter från knoppande jäst celler, som är notoriskt svåra att störa. Här beskriver vi användandet av en kulkvarn homogenisator för utvinning av proteiner i buffertar optimerade för att upprätthålla de funktioner, interaktioner och post-translationella modifieringar av proteiner. Logaritmiskt växande celler som uttrycker proteinet av intresse odlas i ett flytande odlingsmedium av valet. De tillväxtmedier kan kompletteras med reagens för att inducera proteinexpression från inducerbara promotorer (t.ex. galaktos), synkronisera steget cellcykeln (t.ex. nokodazol), eller inhiberar proteasomfunktion (t.ex. MG132). Cellerna pelleteras sedan och återsuspenderas i en lämplig buffert innehållande proteas och / eller hämmare fosfatas och är antingen bearbetas omedelbart eller frystes i flytande kväve för senare användning. Homogenisering åstadkommes genom sex cykler av 20 sek bead-stryk (5,5 m / s), var och en följd av en minuters inkubation på is. Det resulterande homogenatet rensas genom centrifugering och små partiklar kan avlägsnas genom filtrering. Den resulterande rensas helcellextrakt (WCE) fälls ut med 20% TCA för direkt analys av totala proteinerna genom SDS-PAGE följt av Western blotting. Extrakt är också lämpliga för affinitetsrening av specifika proteiner, detektion av post-translationella modifieringar, eller analys av co-rening av proteiner. Som är fallet för de flesta protokoll proteinreningstekniker kan vissa enzymer och proteiner kräver unika förhållanden eller kompositioner buffert för deras rening och andra kan vara instabil eller olöslig under angivna villkor. I det senare fallet kan det protokoll som presenteras ger en bra utgångspunkt för att empiriskt bestämma den bästa bead-stryk strategi för protein extraktion och rening. Vi visar extraktion och rening av en epitop-märkt SUMO E3-ligas, Siz1, en cellcykelreglerat protein som blir både sumoylated och phosphorylated, samt en SUMO-riktad ubiquitin ligas subenhet, Slx5.
Introduction
Den enorma kraften i jäst genetik är legendarisk, men förberedelserna och analysen av naturliga proteiner från knoppande jäst, Saccharomyces cerevisiae, är ofta förenat med problem. Det senare beror på att avsevärd mekanisk styrka och elasticitet av jästcellväggen 1. Följande sätt har beskrivits för den enzymatiska, kemiska, mekaniska, och tryck-baserade söndring av jästceller för att erhålla hel-cell proteinextrakt 2-6. Dessa tekniker varierar mycket i sin effektivitet för att ge cell-representativa, infödda proteinextrakten som kan användas för senare analyser eller reningssteg. Exempelvis kan jästcellväggen tas bort med lytiska enzymer (t.ex. zymolyas) och resulterande spheroblasts kan störas genom skjuvning, detergenter, eller osmotisk lys för att frigöra proteiner. Denna strategi har framgångsrikt använts som utgångspunkt för många subcellulära fraktioneringar men det kräver långa inkubationersom inte är förenliga med stabiliteten hos vissa proteiner 7.
Proprietary jäst lysisreagens (t.ex. rengöringsmedel) för kemisk extraktion av proteiner i jästceller finns kommersiellt tillgängliga, men effekten av dessa reagens i proteinextraktion och deras effekt på efterföljande biokemisk karakterisering av proteiner är inte alltid klart 8. Högtryckshomogenisatorer, ofta kallad franska pressar, bryter effektivt jästceller genom att först utsätta dem för högt tryck och sedan extrudering dem genom en liten öppning i en tryckcell. Denna teknik producerar högkvalitativa extrakt men utrustningen är mycket dyr och kanske inte passar för små mängder av celler eller flera prov 9. Därför är mekanisk sönderdelning av jästceller i en kulkvarn ofta metoden för inhemska preparat jästprotein 10. Denna teknik innebär mekanisk sönderdelning av jästcellväggen med syra-waskjul glaspärlor, vilket kan ske med en rad olika shakers, vortexers eller pärla kvarnar. Notably, kan denna metod användas för att samtidigt bearbeta flera mindre prover (1 ml celler eller mindre). Många olika pärlor eller kulkvam matriser störningar är nu kommersiellt tillgängliga att störa nästan alla typer av celltyp i 2 ml rör. Med tanke på de andra tekniker och utrustning, har en kulkvarn den ytterligare fördelen att söndringen av jästceller sker mycket snabbt, vilket bidrar till att bevara posttranslationella modifieringar såsom sumoylation, speciellt när tillämpliga buffertar med proteas och / eller proteasome inhibitors utnyttjas och temperaturen av extrakt styrs.
Detta protokoll är inriktat på den snabba, effektiva, och tillförlitlig extraktion av endogena och överuttryckt proteiner under försiktig betingelser med det slutliga målet att bevara proteiners funktion, interaktioner, och posttranslationella modifieringar. Tillväxtmedia, cell-lys buffertkompositioner och bead inställningar kvarn är optimerade för att upprätthålla proteininteraktioner och posttranslationella modifikationer såsom sumoylation och ubiquitylation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Rening av 6xHis-taggade proteiner som uttrycks i spirande jästceller under naturliga förhållanden
Ett. Tillväxt av jästceller och induktion av Protein Expression
(Modifierad från 2)
EXTRA: Använd logaritmiskt växande jästkulturer uttrycker proteinet av intresse i stället för galaktos-inducerade kulturer som beskrivs nedan.
- Transform celler av en Gal + jäststam med en plasmid som kodar en galaktos-inducerbar 6xHis-märkt protein av valet. Till exempel, se reagenser listan.
- Ympa transformanter i 5 ml av lämpliga selektiva medier (t.ex. SD-uracil) innehållande 2% sackaros. Inkubera vid 30 ° CO / N, roterande.
- Späd O / N-kulturen så att den optiska densiteten vid 600 nm mäter 0,3 (OD 600 = 0,3) i 33 ml selektivt medium med 2% sackaros. Väx vid 30 ° C, skaka (Δ150 rpm).
- När kulturen har nått OD 600 = 0,8-1,5, Inducera uttryck av det önskade proteinet genom tillsats av 17 ml av 3x YEP med 6% galaktos (Recept i tabell 1), för en slutlig koncentration på 1x YEP med 2% galaktos. Total kultur volym är nu 50 ml. Inkubera, skaka, vid 30 ° C under ytterligare 5-6 timmar.
Obs: odlingsvolymen kan varieras. I steg 1.3, utspädd i två tredjedelar av den önskade slutliga volymen. I steg 1.4, tillsätt en tredjedel den slutliga volymen 3x YEP / 6% galaktos. - Mät OD 600 av den inducerade kulturen och centrifugera Δ150-200 OD 600 enheter av cellerna under 5 min vid 5000 rpm vid 4 ° C.
- Resuspendera cellpelleten med 1 ml iskall 1 x PBS med 1x proteasinhibitorcocktail och överför till en 2 ml provrör med skruvlock.
- Centrifugera cellerna under 1 min vid 15000 rpm vid 4 ° C. Dekantera supernatanten.
- Snap pellet frysa cell i flytande kväve, följt av omedelbar cellys eller lagring vid -80 ° C fram till användning.
- Till den frysta cellpelleten från det tidigare steget, tillsätt 200 pl av syratvättade glaspärlor och 500 | il iskall lyseringsbuffert (Recept i tabell 1 eller använd buffert cellys av val).
- Kortfattat pipettera upp och ner. Det krävs inte att helt resuspendera cellpelleten. Håll rören på is hela tiden.
Anmärkning: I slutet av pipettspetsen kan skäras av innan pipettering upp och ned. - Vid 4 ° C, placera röret (er) med cellerna in i pärlkvarn, balans, lås, och köra maskinen enligt tillverkarens instruktioner.
- Kör vulsten vispen innehållande röret (rören) under 20 sek vid 5,5 m / sekund, sedan placera på slaskig is under 1 min. Upprepa 6x totalt.
- Rensa de extraherade proteinerna genom centrifugering under 15 min vid 15000 rpm vid 4 ° C. EXTRA: ta bort små partiklar genom centrifugering genom en Spinx filter.
- Bered ett prov på hela cellen eXtract (WCE) för att bekräfta närvaron av proteinet av intresse genom Western Blöt:
- Lägg WCE motsvarande med två OD 600 enheter av celler (t.ex. 5 | il av rensas extrakt om 200 OD 600 enheter av celler skördades) till 800 | il 20% triklorättiksyra (TCA). Vortex att blanda.
- Centrifugera under 2,5 min vid 15000 rpm vid 4 ° C. Dekantera supernatanten, men var noga med att behålla pellets.
- Tillsätt 800 | il 2% TCA till pelleten och vortex röret, följt av centrifugering under 2,5 min vid 15000 rpm vid 4 ° C. Dekantera supernatanten, men var noga med att behålla pellets.
- Lägg 100 pl TCA provbuffert (Recept i tabell 1), virvel för att lösa upp pelleten. Obs: Om provet bufferten blir sur (blir gult) efter tillsats till pelleten, lägga portioner av Δ10 il Trisbas [1M] tills provet är blå igen.
- Inkubera i en 100 ° C värmeblock under 2-5 min.
- Vortex again till fullo lösa om rester av pellet som fortfarande finns kvar. Pellets framställda enligt denna metod är notoriskt svåra att fullständigt lösas upp. Det kan ta Δ10 min av virvling för att fullständigt lösa pellets.
- Store provet vid -80 ° C fram till användning.
- Snap frysa alikvoter av kvarvarande rensas WCE i flytande kväve och förvara vid -80 ° C fram till användning.
Tre. Batch Rening av proteiner från Homogenat jästcell
Obs: Denna reningsmetod var optimerad för rening av 6xHis-märkta proteiner på Co 2 + metall affinitetsharts.
- Harts Ekvilibrering
- För ett urval av rensas WCE framställd från Δ20-40 OD 600 enheter av celler, tillsätt 50-100 il affinitetsharts till ett mikrocentrifugrör. Proteiner extraherade från celler som inte uttrycker det önskade proteinet eller en ospecifik harts, såsom amylos, kan användas som kontrolls för icke-specifik bindning.
- Tvätta harts 5x med 1 ml tvättbuffert: invert top-over-botten tills harts suspenderas, och sedan snurra i 1 minut vid 5000 rpm vid 4 ° C. Aspirera supematanten.
OBS: Om du utför extraktion och rening på samma dag, kan harts jämvikt utföras före extraktion.
- Proteinbindningen för Affinitetsrening
- Lägg 100-200 il klarnat lysat (Δ20-40 OD 600 enheter) till 50-100 il tvättade pärlor, och att den totala volymen till 1 ml med lyseringsbuffert.
- Inkubera med nickning eller skakning vid 4 ° C i 2-5 timmar.
- Snurra under 1 min vid 5000 rpm vid 4 ° C.
- Om så önskas, spara ett prov av den återstående supernatanten för efterföljande analys av obundna proteiner. TCA fälla enligt ovan för WCE (steg 2,6).
- Tvätta hartset med bundna proteiner 5x med 1 ml tvättbuffert, följt av en spin under 1 min vid 5000 rpm vid4 ° C. Håll prover kallt under tvättar.
- Eluering av bundna proteiner
- Tillsätt 150 | il elueringsbuffert till harts, vicka vid 4 ° C under 5 min, spinn under 1 min vid 5000 rpm vid 4 ° C och spara supernatanten i ett nytt rör. EXTRA: Upprepa 2x och elueringar pool.
- Förbered eluerade provet för Western blöt: Till 25 pl av eluerade proteinerna, tillsätt 25 | il 2x litium-dodecylsulfat (LDS) provbuffert med 2 | il β-merkaptoetanol (BME) och inkubera i ett 100 ° C värmeblock under 2 min.
Obs: Standard 2X Laemmli prov buffert kan även användas. - Snap frysa överskott eluerade proteinet i flytande kväve.
EXTRA: band kvarvarande proteiner från harts med en lika stor volym av 2x LDS prov buffert vid 65 ° C i 5 minuter, ta bort LDS-eluerade proteinerna till ett nytt rör, tillsätt sedan 2 pl BME till de eluerade proteinerna, inte plasten. Denna order är att förhindra att avlägsna eventuella joner eller antikroppar som är Conjugated till pärlorna. - Förvara proverna vid -80 ° C fram till användning.
- Western Blöt och sond med lämpliga antikroppar för att visualisera proteinerna.
- Ladda 10-20 il (Δ1-3 OD 600 enheter) av varje prov och 3-10 | il av ett protein stege i en SDS-PAGE-gel av valet. Geler rutinmässigt används för detta protokoll inkluderar 4-12% Bis-Tris och 8% Tris-glycin.
- Kör gelen vid 200 V under 50 min.
- Överför proteiner från gel till ett PVDF-membran genom halvtorr överföring vid 19 V under 20 till 30 minuter (recept i tabell 1).
- Block membran i 4% milk/1x Tris-buffrad saltlösning-Tween (TBST) under 1 h vid RT eller O / N vid 4 ° C (recept i tabell 1).
- Inkubera membran med primär antikropp till epitopmärkt protein av intresse i 4% milk/1x TBST under 1-3 timmar vid rumstemperatur eller O / N vid 4 ° C.
- Tvätta membran 3x för 5 minuter vardera med 1x TBST.
- Inkubera membran med lämpligsekundära pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad antikropp för 1-3 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta membran 3x i 15 min vardera i en stor volym av 1x TBST.
- Täck membranet med ECL substrat och linda in i saran wrap.
- Exponera membranet till film och utvecklas för att visualisera proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra representativa resultat visar att den beskrivna vulsten-stryk och proteinextraktion protokoll är användbar för reproducerbar framställning av proteiner för en mängd olika tillämpningar i efterföljande led (sammanfattade i tabell 2). SDS-PAGE följt av Coomassie-färgning av WCEs visar att ett brett spektrum av proteiner (~ 12 till> 250 kDa) reproducerbart kan extraheras från jästceller (Figur 1A). Diskreta band över ett område av molekylvikter är tecken på hög extrakt kvalitet protein. Kvaliteten av extrakt kan bekräftas genom western blotting för specifika epitop-märkta proteiner. Visas är ett representativt resultat för galaktos-overexpressed, V5-märkta SUMO ligas Siz1 som vandrar på Δ120kDa (Figur 1B). Generellt skulle delvis nedbrutna proteiner köras som flera fragment under den förväntade vikten, men här bara fullängdsprotein observeras. Dessutom högmolekylära addukter av ett givet proteinkan tyda på post-translationella modifieringar. Till exempel visar vi galaktos-overexpressed sumoylated Siz1Δ440 och fullängds Siz1 (Figur 1C och figur 1D). Ändringar kan också konserveras på endogent uttryckta Siz1 (figur 1E).
Vi tillhandahålla representativa resultat som två nukleära anrikade proteiner, Slx5 och Siz1Δ440, framgångsrikt renades från våra WCEs (figurerna 2A, 2B och 2C). Notably, visar vi att en 6xHis-märkt protein (figur 2A; Slx5) kan vara affinitetsrenade från våra WCEs både under nativa och denaturerande betingelser. Däremot Slx5-GST (Figur 2B) och Siz1Δ440-HA (figur 2C) saknar en 6xHis epitop men under naturliga förhållanden fortfarande interagera med metall-affinitetsharts i en imidazol-känsligt sätt. Vi föreslår att Siz1, och i mindre utsträckning SLX5, kan binda metall-affinitetsharts via deras metall-koordinerande RING domän. Samtidigt, till vår kunskap, har detta fenomen ännu inte rapporterats, har en liknande situation har beskrivits där kolera toxin B-subenhet binder Ni 2 + affinitetsharts på ett sätt som medieras av dess naturliga histidinrester 11. Huvudsakligen föreslår denna observation att proteiner i WCE är, åtminstone delvis, nativt viks.
Speciellt för studier av proteiners funktion är det viktigt att visa att proteinkomplex förblir intakta i helcellextrakt. Vår representativa uppgifter visar att Siz1Δ440, Slx5 och Pgk1 (en cytosolprotein som fungerar som en belastning kontroll) var närvarande i WCEs. Siz1Δ440 renades från dessa extrakt baserat på dess inneboende förmåga att binda till metall affinitetshartser (jämför med figur 2C). När Slx5 och Siz1 samuttrycktes i jästceller, var Slx5 nivåer i eluaten ökat,lyfta möjligheten att Slx5 kan interagera med Siz1 (figur 3).
Figur 1. Närvaro av intakta och sumoylated proteiner i jäst cellysatet efter extraktion. Om inget annat anges helcellextrakt framställdes såsom beskrivs i detta protokoll. Prover separerades genom SDS-PAGE och efter Western-blotting sonderades med antikroppar till antingen HA, V5, eller myc-epitop-taggar. Jäststammar är sammanställda i tabell 3. WB: western blot. (A) Representativa prover av TCA-utfälld WCE (från YOK 2514 (två körfält till vänster) och YOK 2592 (två körfält till höger), (Δ0.2 OD / bana)) visualiserades genom färgning med en gel fläck ( se Material avsnittet). (B) Spår 1 & 2: homogenat av jäststam YOK 2510 och YOK 2512 innehåller galaktos-överuttryckta Siz1-V5/6xHIS. Notera frånvaron av delvis försämrad proteinfragment. Av okänd anledning, inte avslöja detta prov inte sumoylated addukter när sonderade med en anti-V5-antikropp. Emellertid kan sumoylation detekteras med en anti SUMO (anti-Smt3)-antikropp såsom visas i fig.. 1D. (C) Lane 3 & 4: homogenat av jäststam YOK 2508 och YOK 2509 innehållande galaktos-överuttryckta Siz1Δ440-HA. (D) Lane 5, 6 & 7: galaktos-överuttryckta Siz1-V5/6xHIS renades med användning av Co 2 + metall affinitetsharts, eluerades med 200 mM imidazol, och sonderades med anti-V5 (spår 5), anti-Smt3 (spår 6). Bana 7 är en reprobe av spår 6 med anti-V5-antikropp. och visar både Siz1 och sumoylated Siz1 addukter (Smt3 n). (E) Spår 8: JD52 vildtyp celler innehållande endogena nivåer av myc-märkt Siz1 (YOK 2397). Klarnat lysat framställdes med användning av en däggdjurs-lysbuffert. Spår 9: Lysate supernatanten efter en 2 timmars inkubering med anti-V5 agaros. Obs sumoylated addukter av Siz1. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Rening av överuttryckt RING-domän innehållande proteiner med TALON Metal Affinity harts. Galaktos induktion, proteinextraktion och rening utfördes såsom beskrivs i detta protokoll. Rening utfördes under nativa förhållanden och denaturerande betingelser, för vilka guanidiniumhydroklorid sattes till provet för att 6 M före inkubering med harts. Lysate roterades med både amylos kontroll harts (A) och TALON Metal Affinity-harts (T). Proteiner eluerades med 200 mM imidazol i elueringsbuffert. Prover separerades medelst SDS-PAGE och Western blottades(WB) med en antikropp till den lämpliga epitopmarkör. A) Galaktos-inducerad Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) renades med TALON-harts under både nativa och denaturerande betingelser B) Galaktos-inducerad Slx5-GST (YOK 2071) var renas med TALON harts i nativ, men inte denatureringsbetingelser. Förmodligen samverkar metallen samordna RING domän med TALON harts vid rätt vikt. C) galaktos-inducerad Siz1Δ440-HA (YOK 2353) också renades med TALON harts i native, men inte denatureringsbetingelser. Dessa proteiner innehåller inte 6xHis taggar, men varje gör innehåller en ring domän, vilket naturligtvis koordinerar Zn 2 +-joner och kan ge möjlighet att i sig binda TALON Metal affinitetsharts när korrekt vikt. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Samtidig rening av over-uttryckta proteinerna på TALON Metal affinitetsharts.
Slx5-GST och Siz1Δ440-HA uttrycktes av sig själva eller i kombination (+ / -) av JD52 celler (stammarna YOKs 2353, 2402, 2224 respektive). Proteiner extraherades såsom beskrivits (WCE) och lysat nickas med TALON Metal Affinity-harts (se figur 2). Proteiner eluerades från hartset med 200 mM imidazol i elueringsbuffert (eluat) och framställd i LDS provbuffert. Proteiner separerades genom SDS-PAGE och efter Western-blotting sonderades med en antikropp mot HA-markören eller GST-märket. Lika laddning av proteiner bekräftas med PGK som en laddningskontroll. Observera att Slx5 rening förstärks i närvaro av Siz1Δ440. Klicka här för att se större bild .
| Lösning | Komponenter | Kommentarer |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g jästextrakt 60 g pepton i 700 ml ddHaO 2 O | Blanda ingredienserna och autoklav för att sterilisera. Lägg filtersteriliserat galaktos till 6% till enskilda portioner av 3x YEP då klar att användas |
| TCA provbuffert | 15% glycerol 80 mM Tris-bas (ej pH'd) 3,5% SDS bromfenolblått "till smak." Ta volymen till 25 ml med DDH 2 O | Före användning: Tillsätt 40 l av β-merkaptoetanol (BME) till 1 ml TCA Sample Buffer |
| Tvättbuffert | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 20 mM imidazol | Imidazole används för Ni 2 + eller Co 2 + metall affinitetsrening endast |
| Lysis Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 10 mM imidazol 1x proteasinhibitorcocktail Lägg cocktail proteashämmare omedelbart före användning. Imidazole används för Ni 2 + eller Co 2 + metall affmitetsrening bara. EXTRA: 25 mM N-etylmaleimid (cysteinproteas-hämmare, för att bevara sumoylation), 1 mM natriumortovanadat (proteintyrosinfosfatas-hämmare), och / eller andra empiriskt bestämda proteashämmare baserat på visst område i studien | |
| Elueringsbuffert | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 200 mM imidazol | Imidazole brukade tävla om histidin bindningsställen i Ni 2 + eller Co 2 + metall affmitetsrening bara. Andra metoder för eluering kan användas för olika affinitetshartser. |
| Semi Dry Transfer Buffer (10x) | I 1 L av DDH 2 O: 58 g Tris 29,3 g Glycin 18,75 ml 20% SDS | För att göra 1x Semi Dry transferbuffert: blanda 100 ml 10x Semi Dry transferbuffert med 200 ml metanol och 700 ml DDH 2 Os |
| Tris-buffrad saltlösning (TBS, 10x) | 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 150 ml 5 M NaCl 300 ml ddHaO 2 O | För att göra 1x TBST, blanda 100 ml 10x TBS med 900 ml DDH 2 O och tillsätt 1 ml Tween-20 |
Tabell 1. Lösningar och buffertar.
| Tillämpning | Mängd celler | Nästa steg |
|---|---|---|
| Cell Lysis | 150-200 OD skördade cellpelleten | Bead slog som beskrivs i steg 2 |
| Western blöt av WCE | 2 OD av lyserade framställda celler | Förbered för Western blöt av TCA-utfällning som beskrivs i steg 2.6. Δ0.3 OD-enheter (Δ15 pl) slut på gel |
| Affinity Rening och / eller Pulldown | 30 OD av lyserade celler | Bind, eluera och förbereda proteiner som beskrivs i steg 3.2 och 3.3 |
| Cirka 1-2 ODS (om framställd som i steg 3.3) | Western blöt såsom beskrivits i steg 3.4 |
Tabell 2. Sammanfattning av ansökningar om detta protokoll.
| Namn | Relevant genotyp eller moderstam | Plasmid (er) eller Kassett insättning | Referens |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATa ura3-52 his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ63 lys2-801 | Dohmen et al., 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Jäst GST samling YSC4515-202.484.078) | denna studie |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | denna studie |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Jäst GST samling YSC4515-202.484.078), pRS425 (BOK 343) | denna studie |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denna studie |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogent taggade) | denna studie |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Jäst GST kollektion YSC4515-202.484.078), pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denna studie |
| YOK 2501 | MHY3765, alfa parning typ, ura3-52, LYS2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: kanMX | Xie et al., 2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denna studie |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Jäst GST kollektion YSC4515-202.484.078), pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denna studie |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898), pRS425 (BOK 343) | denna studie |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | Slx5-Protein A (BOK 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | denna studie |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YOK 2397) | msn5Δ :: hygromycin | denna studie |
| YOK 2592 | msn5Δ :: hygromycin i JD52 (YOK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | denna studie |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | denna studie |
Tabell 3. Jäststammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är inriktat på framställning av intakt, inföding, och posttranslationellt modifierade proteiner från spirande jästceller för nedströms applikationer. Innan du försöker detta protokoll, är det viktigt att avgöra om proteinet av intresse kan lätt upptäckas i protein extrakt framställda enligt denatureringsbetingelser 12. Om polyklonala antikroppar inte är tillgängliga kan det vara fördelaktigt att epitoppåhänget att proteinet av intresse så att fusionsproteinet kan detekteras på Western blöts. I det nuvarande protokollet, taggade vi SIZ1 med HA, 6xHis-V5, eller myc-taggar epitopen och denna strategi tillät oss att tydligt identifiera proteinet och dess sumoylated former på Western blöts (figur 1). Vi hade mindre framgång detektera GFP-märkta proteiner, möjligen beroende hög affinitet anti-GFP-antikroppar är svåra att erhålla (data ej visade). En annan viktig fråga rör uttrycket nivån av proteinet av intresse. Nivåer av enskildaproteiner varierar kraftigt i spirande jästceller 4 och vissa proteiner måste vara överuttryckt så att de kan detekteras och / eller renas. Galaktos-inducerbara vektorer är tillgängliga för uttryck på hög nivå av jäst-genen av intresse 2. I fallet med Siz1, kunde vi upptäcka den fulla längden eller stympat protein uttryckt från kromosomkodade taggade ORF eller uttryckt under kontroll av den starka inducerbara galaktos promotor från en plasmid (Figur 1). Användningen av stympningar kan vara användbart i struktur / funktion analyser eller när fullängds-molekylen är svårt att uttrycka eller instabil. Medan galaktos-inducerad överuttryck ökar protein detektion och rening, har tydliga begränsningar när man studerar den fysiologiska relevansen av potentiella cellcykelfasspecifika särskilda post-translationella modifieringar och interaktioner. Till exempel är sumoylation av Siz1 vanligast vid G2 / M skede av cellcykeln, och modifieringar eller interaktioner avdet överuttryckta proteinet kan behöva bekräftas av andra experimentella metoder. Slutligen är tillägget av specifikt proteas, fosfatas, och / eller proteasomhämmare en viktig faktor för att lyckas med detta protokoll. Generellt är de bästa resultaten erhålls genom att addera dessa inhibitorer innan cellerna fryses och i utvinning och utspädning buffertar. Tillsatsen av EDTA, en metalljon chelator ibland förekommer i drinkar proteashämmare, är inte tillrådligt eftersom det kan störa efterföljande reningar metall affinitet.
Proteinextrakt erhållna genom bead-slog är väl lämpade som utgångsmaterial för rening av individuella proteiner. Specifikt visar vi att överuttryckta Slx5 bär en 6xHis affinitetsmärkning kan renas från WCEs med användning ett harts metall affinitet (Figur 2A). Att bevara post-translationella modifieringar och minska proteinnedbrytning är 6xHis-märkta proteiner ofta renas enligt denatureringsbetingelserFem. Men det finns distinkta fördelar förknippade med rening av proteiner under nativa betingelser. Till exempel kan dessa proteiner samtidigt rena med bindningspartners eller kan användas i efterföljande in vitro-analyser 13,14. I fallet med Siz1 och Slx5 vi fastställt serendipitously att båda proteinerna uppvisar inre affinitet för metallen affinitetsharts, oberoende av 6XHIS-markeringen, och denna observation föreslog oss att båda proteinerna antas nativa bekräftelser. Tyvärr har korrekt veckning och biologisk aktivitet hos renade proteiner som skall fastställas från fall till fall. För detta ändamål, placeringen av samhörighet och epitopmärkningar vid antingen aminosyra eller karboxiterminus, kan kraftigt påverka aktiviteten eller stabiliteten hos fusionsprotein och är en viktig faktor i planeringen av en strategi protein rening.
Framtida arbete kommer att fokusera på hur man kan förbättra post-translationella modifieringar under rening, för tentamenpel genom användning av proteas saknande jäststammar, olika proteashämmare eller andra taggar affinitet. Vi förutspår att detta protokoll i sin nuvarande eller buffert-optimerade formen är tillämpligt för skalbara extraktion, rening och efterföljande studie av många blivande jästproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i Kerscher labbet för deras stöd. Vi tackar Mark Hochstrasser för Jäststammen MHY3765. Detta arbete stöddes av NSF bevilja 1051970 (till OK) och en Howard Hughes Medical Institute Grundutbildning Resebidrag och Monroe Scholars Program Grant (till ES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al.
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
