Summary
Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.
Abstract
Boncuk dayak ile homojenizasyon bozmaya herkesin bildiği zor tomurcuklanan maya hücreleri, DNA, RNA, protein, ve metabolitleri serbest bırakmak için hızlı ve etkili bir yoldur. Burada, işlevleri, etkileşimleri ve proteinlerinin post-translasyonel modifikasyonlar korumak için optimize tamponlar içine proteinlerin çıkarılması için bir boncuk değirmeni homojenizatör kullanımını tarif eder. Ilgilenilen proteini ifade logaritmik büyüyen hücreler tercih edilen bir sıvı büyüme ortamında yetiştirilir. Büyüme ortamı uyarılabilir promotörler (örneğin, galaktoz), protein ekspresyonunu başlatmak için tepkin maddeler ile takviye edilebilir, (örneğin, Nokodazol) hücre döngüsü aşaması senkronize ya da (örneğin, MG132) proteazom fonksiyonunu inhibe eder. Hücreler daha sonra, topak haline getirilir ve proteaz ve / veya fosfataz inhibitörleri ihtiva eden uygun bir tampon içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve ya hemen işleme ya da daha sonra kullanılmak için likit nitrojende dondurulmuştur. Homojenizasyon 20 sn bea altı döngüleri gerçekleştirilird-dayak (5.5 m / sn), buz üzerinde bir dakika kuluçka takip her. Elde edilen Homojenat santrifüj ile temizlendi ve küçük parçacık süzme ile kaldırılabilir. Elde edilen temizlenmiş tüm hücre ekstresi (WCE) Western lekeleme takiben SDS-PAGE ile toplam proteinlerin doğrudan analiz için% 20 TCA ile çöktürülür. Özütleri aynı zamanda spesifik protein afinite saflaştırma, post-translasyonel modifikasyonlar, ya da ko-temizleme proteinlerin analizi saptanması için uygundur. Çoğu protein arıtma protokolü için olduğu gibi, bazı enzimler ve proteinler, saflaştırma ve diğerleri için benzersiz koşullar ya da tampon bileşimler belirtilen koşullar altında kararsız veya çözünmez olabilir gerektirebilir. İkinci durumda, sunulan protokol deneysel olarak protein çıkarma ve arıtma için en iyi boncuk-dayak strateji belirlemek için yararlı bir başlangıç noktası sağlayabilir. Biz epitop-etiketli SUMO E3 ligaz, Siz1, bir hücre döngüsü çıkarılması ve saflaştırma göstermekSlx5, sumoylated ve fosforile edilmiş, hem de bir SUMO hedefli bir ubikuitin ligaz alt birimi de olur proteini düzenlenir.
Introduction
Maya genetik üstün gücünü efsanedir, ama tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae, gelen yerli proteinlerin hazırlanması ve analiz genellikle sorunlarla doludur. İkinci önemli bir mekanik dayanımı ve maya hücre duvarı 1 elastisite kaynaklanmaktadır. Farklı vasıtasıyla enzimatik ve kimyasal, mekanik ve basınç tabanlı bütün hücre protein ekstresi 2-6 elde etmek için maya hücrelerinin bozulması için tarif edilmiştir. Bu teknikler, daha sonraki analizler ve arıtma aşamalarında kullanılabilir hücre Örnek, doğal protein özleri elde etmek için bu etkinliği açısından büyük farklılıklar gösterir. Örneğin, maya hücre duvarı litik enzimler (örneğin zymolyase) ve ortaya çıkan spheroblasts ile temizlenebilir makaslama, deterjanlar ya da protein serbest bırakmak için osmotik lizis ile bozulabilmektedir. Bu yaklaşım başarılı birçok hücre içi fraksiyonlar için başlangıç noktası olarak istihdam ama uzun inkubasyon gerektirir edilmiştirbazı proteinlerin 7 istikrarı ile uyumlu değildir.
Maya hücreleri proteinlerin kimyasal çıkarılması için tescilli maya lizis reaktifler (deterjanlar gibi), ticari olarak mevcuttur, ancak bu protein ekstraksiyon reaktifleri ve proteinlerin sonraki biyokimyasal karakterizasyonu üzerindeki etkisinin etkinliğini her 8 açık değildir. Genellikle Fransız presler olarak adlandırılan yüksek basınç homojenizatör, etkili ilk yüksek basınç onlara tabi ve daha sonra bir basınç hücre küçük bir açıklıktan onları ekstrüzyon tarafından maya hücreleri kırmak. Bu teknik, yüksek kaliteli özler üretir ama ekipman çok pahalı ve hücreleri veya birden fazla numune 9 küçük miktarlarda için uygun olmayabilir. Bu nedenle, bir boncuk değirmeni içinde maya hücrelerinin mekanik bozulması genellikle yerli maya protein preparatları 10 için tercih edilen bir yöntemdir. Bu teknik, asit-wa ile maya hücre duvarının mekanik bozulması içerirShakers, vortexers veya boncuk fabrikaları çeşitli yapılabilir cam boncuk, döken. Özellikle, bu yöntem, aynı zamanda, birden fazla küçük numuneleri (hücre ya da daha az, 1 ml) işlemek için kullanılabilir. Birçok farklı boncuklar ya da boncuk değirmeni bozulması matris hemen 2 ml tüpler içinde hücre tipi, hemen hemen her türlü bozmak için ticari olarak temin edilebilir. Diğer teknikler ve donanım göz önüne alındığında, bir boncuk değirmeni proteaz ve / veya proteazom inhibitörleri ile, uygun tamponlar kullanılmaktadır, özellikle maya hücrelerinin bozulması gibi sumoilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlar korumaya yardımcı olan, çok hızlı oluşur avantajına sahiptir ve özleri sıcaklığı kontrol edilir.
Bu protokol protein fonksiyonu, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için nihai hedefi ile yumuşak koşullarda endojen ve aşırı dile getirilen proteinlerin, hızlı, etkili ve güvenilir çıkarma odaklanır. Büyüme ortamı, hücre parçalama tamponukompozisyonlar, ve boncuk değirmen ayarları protein etkileşimleri ve bu sumoilasyon ve ubiquitylation gibi translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Doğal koşullar altında tomurcuklanma maya hücrelerinde ifade 6xHis-etiketli proteinlerin saflaştırılması
1. Protein İfade Maya Hücreleri ve İndüksiyon Büyüme
(2 Modifiye)
İSTEĞE BAĞLI: İlgi yerine aşağıda tarif edilen galaktoz ile indüklenen kültürlerin proteini ifade logaritmik olarak artan maya kültürleri kullanın.
- Bir plazmid kodlama bir galaktoz-indüklenebilir tercih protein 6xHis-etiketli bir Gal + maya suşu hücreleri dönüştürmek. Örneğin, reaktif listesine bakın.
- % 2 sukroz içeren uygun seçici medya 5 ml (örneğin SD-urasil) in transformantlar aşılamak. 30 ° CO / N, dönen inkübe edin.
- 600 nm'de optik yoğunluk% 2 sukroz ile seçici ortam 33 ml 0.3 (= 0.3 OD 600) ölçer, böylece O / N kültür seyreltilir. (Δ150 rpm) sallayarak, 30 ° C de büyür.
- Kültür OD = 600 0.8 eriştiğinde-1.5,% 2 galaktoz ile 1x YEP bir son konsantrasyon için,% 6 galaktoz (Tablo 1 'de tarifi) ile 3 kez YEP 17 ml ilave edilerek istenen proteinin ekspresyonunu. Toplam kültür hacmi şimdi 50 ml. Inkübe, ek bir 5-6 saat için 30 ° C'de, sallayarak.
Not: kültür hacmi değiştirilebilir. Arzu edilen nihai hacim üçte ikisi içine adım 1.3, seyreltik olarak. Adım 1.4, 3x YEP / 6% galaktoz üçte biri son hacim ekleyin. - 4 ° C'de 5,000 rpm'de 5 dakika boyunca uyandırılan kültürü ve santrifüj hücre Δ150-200 OD 600 birimlerinin OD 600 ölçün
- 1x proteaz inhibitörü kokteyli ve 2 ml'lik vidalı somunlu bir tüpe transfer 1 ml buz gibi soğuk PBS ile süspanse 1x hücre pelletini.
- 4 de 15.000 rpm'de 1 dakika santrifüj hücreleri ° C Durusu süpernatant.
- -80 Hemen hücre parçalama veya depolama ° C daha sonra kullanmak kadar takip, sıvı nitrojen içinde dondurularak hücre pelet çekin.
- Bir önceki adımda dondurulmuş hücre pelletini için, asitle yıkanmış cam boncuk ve 200 ul buz gibi soğuk lizis tamponu ile 500 ul (Tablo 1 ya da tercih edilen hücre parçalama tamponu kullanımda tarifi) ekleyin.
- Kısaca ve aşağı yukarı pipetle. Bu, tam olarak hücre pelletini için gerekli değildir. Her zaman buz üzerinde tüpler tutun.
Not: pipet sonu ve aşağı yukarı pipetleme önce kesilebilir. - 4 ° C, yer boncuk değirmeni, denge, kilit, ve başına üreticinin talimatlarına olarak makine çalıştırmak içine hücreleri ile tüp (ler).
- 5.5 az 20 saniye boyunca tüp (ler) içeren boncuk çırpıcı m / sn, daha sonra 1 dakika sulu buz üzerinde yer çalıştırın. Toplam 6x tekrarlayın.
- 4 ile 15,000 rpm'de 15 dakika için santrifüjleme ile ekstre protein Temizle ° C İSTEĞE BAĞLI: Bir SPINX filtreden santrifüj küçük partiküller kaldırın.
- Bütün hücre e bir örnek hazırlamaWestern Blot tarafından ilgi protein varlığını doğrulamak için (BOA) Çkartlacak:
- 800 ul% 20 trikloroasetik asit (TCA) ile hücrelerin 2 OD 600 birim (temizlenir özü örneğin 5 ul hücre 200 OD 600 tane hasat edildi varsa) karşılık gelen WCE ekleyin. Karıştırmak için Vortex.
- 4 ° C'de 15,000 rpm'de 2.5 dakika boyunca santrifüje Süpernatant Durusu, ancak pelet korumak için dikkatli olun.
- 4 ile 15,000 rpm'de 2.5 dakika süreyle santrifüj takip pelet ve vorteks tüp% 2 TCA 800 ul ° C'de ekleme Süpernatant Durusu, ancak pelet korumak için dikkatli olun.
- TCA Örnek Tampon 100 ul (Tablo 1'de Tarif), pelet çözmek için vorteks ekleyin. Not: örnek tampon pelet ek sonra (sarıya döner) asidik hale gelirse, Δ10 ul Tris baz hacimde ekleyin [1M] örnek yine mavi olana kadar.
- 2-5 dakika boyunca 100 ° C ısıya blok inkübe edin.
- Vortex agpelet kalıntıları hala mevcut olup olmadığını ain tamamen çözmek için. Bu yöntemle hazırlanan granüller tam olarak çözünmesi için bilindiği gibi zordur. Bu tamamen pelet çözmek için vorteks bir Δ10 dakika sürebilir.
- -80 Mağaza örnek ° C daha sonra kullanmak kadar.
- Daha sonra kullanmak kadar -80 sıvı azot ve mağaza kalan temizlenmiş BOA ° C alikotları dondurma oturtun.
3. Maya Hücre homojenatlar gelen Proteinlerin Toplu Arıtma
Not: Bu saflaştırma yöntemi Co 2 + metal afinite reçinesi üzerinde 6xHis-etiketli proteinlerin saflaştırılması için optimize edilmiştir.
- Reçine Dengeleme
- Hücrelerin Δ20-40 OD 600 birim hazırlanan temizlenir WCE bir örnek, bir mikrosantrifüj tüpüne afinite reçinesi 50-100 ul ekleyin. , Arzu edilen bir proteini ya da amiloz olarak spesifik olmayan bir reçine, ifade etmedi hücrelerinden ekstre proteinleri kontrol olarak kullanılabilirSpesifik olmayan bağlanma için n.
- Yıkama tamponu 1 ml ile 5x reçine yıkayın: üst-over-alt ters reçine bekletilir ve sonra 4 az 5000 rpm'de 1 dakika dönmeye kadar ° C Süpernatant aspire.
Not: Aynı gün ekstraksiyon ve saflaştırma yerine eğer reçine dengeleme ekstraksiyon öncesinde yapılabilir.
- Afinite saflaştırma için Protein Bağlanma
- 50-100 ul yıkanmış boncuk temizlenir lizat 100-200 ul (Δ20-40 OD 600 adet) ekleyin ve lizis tamponu ile 1 ml toplam hacmi getirmek.
- 2-5 saat 4 de nütasyon veya sallanan ° C ile inkübe edin.
- 4 ° C'de 5000 rpm'de 1 dakika için Spin
- Eğer arzu edilirse, bağlanmamış proteinin bir sonraki analiz için kalan süpernatant bir örnek kaydedin. TCA BOA (adım 2.6) için yukarıda ayrıntılı olarak hızlandırabilir.
- Az 5000 rpm'de 1 dakika için bir spin ardından yıkama tamponu 1 ml 5x bağlı proteinler, reçine yıkayın4 ° C Yıkar esnasında numuneler soğuk tutun.
- Bağlı proteinler elüsyon
- 4 de, reçineye nutate 150 ul yıkama tamponu ekleyin ° C 5 dakika, 4 az 5000 rpm'de 1 dakika için sıkma ° C ve yeni bir tüp süpernatant kaydedin. İSTEĞE BAĞLI: 2x ve havuz elutions tekrarlayın.
- Western blot yıkandı, örnek hazırlayın: yıkandı, protein 25 ul, 25 ul 2x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tampon maddesi eklemek 2 ul β-merkaptoetanol (BME) ve 2 dakika boyunca 100 ° C ısıya blok inkübe edin.
Not: Standart 2X Laemmli numune tamponu da kullanılabilir. - Sıvı nitrojen içinde dondurularak aşırı yıkandı, protein çekin.
İSTEĞE BAĞLI: 65 2x LDS numune tamponu eşit hacmi ile reçineden şerit kalan proteinler ° C de 5 dakika süre ile, yeni bir tüpe LDS-yıkandı, proteinlerin uzaklaştırılması, daha sonra değil, reçine, yıkandı, proteinlere 2 ul BME ekleyin. Bu sipariş conjuga herhangi bir iyon ya da antikor kaldırılmasını önlemek içinboncuk Ted. - -80 ° C daha sonra kullanmak kadar mağaza örnekleri.
- Uygun antikorlar ile Western Blot ve prob proteinleri görselleştirmek için.
- Her bir numune, 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 birim) ve tercih edilen bir SDS-PAGE jeli bulunan bir protein merdivenin 3-10 ul yerleştirin. Bu protokol için rutin olarak kullanılan jeller,% 4-12 Bis-Tris ve% 8 Tris-Glisin içerir.
- 50 dakika 200 V jel çalıştırın.
- 20-30 dakika (Tablo 1'de tarifi) için 19 V yarı-kuru transferi ile jel bir PVDF membran proteinleri aktarın.
- % 4 milk/1x Tris Blok membran 4 ° C (Tablo 1 'de tarif) oda ısısında veya O / N, 1 saat boyunca tuzlu su ara-(TBST) tamponlu.
- 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında O / N az 1-3 saat boyunca 4% milk/1x TBST ilgi epitop etiketli protein birincil antikor ile inkübe membran
- 5 dakika 1x TBST ile her biri için 3x membran yıkayın.
- Uygun ile membran inkübeİkinci yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge edilmiş, oda sıcaklığında 1-3 saat boyunca bir antikor.
- 1x TBST büyük bir hacim içinde 15 dakika her biri için 3x membran yıkayın.
- Saran wrap ECL substrat ve şal ile membran kapak.
- Film membran Açığa ve protein görselleştirmek için gelişir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim temsili sonuçlar tanımlanan boncuk dayak ve protein çıkarma protokolü alt uygulamalar (Tablo 2 içinde özetlenmektedir) çeşitli proteinlerin tekrarlanabilir hazırlanması için yararlı olduğunu ortaya koymaktadır. KKE Coomassie boyama takiben SDS-PAGE protein (~ 12> 250 kDa), geniş bir yelpazede tekrarlanabilir maya hücreleri (Şekil 1 A) elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Moleküler ağırlık aralığı üzerinde farklı bantlar yüksek kaliteli protein ekstreleri göstergesidir. Özler kaliteli batı özel bir epitopa-etiketli proteinleri için blot ile teyit edilebilir. Gösterilen Δ120kDa (Şekil 1B) de göç galaktoz-aşırı ekspresyona uğramış, V5-etiketli SUMO ligaz Siz1 için temsili bir sonucudur. Genel olarak, kısmen bozulmuş proteinler beklenen ağırlığı altında birden fazla parçaları gibi çalışır, ama burada sadece tam uzunlukta protein görülmektedir. Belirli bir protein Buna ek olarak, yüksek molekül ağırlıklı aduktlarpost-translasyonel modifikasyonlar gösterebilir. Örneğin, galaktoz-aşırı ekspresyona uğramış sumoylated Siz1Δ440 ve tam boy Siz1 (Şekil 1C ve Şekil 1D) gösterir. Değişiklikler aynı zamanda endojen ifade Siz1 (Şekil 1E) üzerinde muhafaza edilebilir.
İki nükleer zenginleştirilmiş proteinler Slx5 ve Siz1Δ440, başarıyla KKE (Şekiller 2A, 2B ve 2C) antılmıştır olduğu için temsili sonuçlar sağlar. Yerli ve denatüre edici koşullar altında KKE saflaştırılmış afinite olabilir, özellikle de, bir 6xHis-etiketli protein (Slx5 Şekil 2A) olduğunu göstermektedir. Bunun aksine, Slx5-GST (Şekil 2B) ve Siz1Δ440-HA (Şekil 2C) 6xHis epitopu sahip olmayan, ancak yine de doğal koşullar altında, bir imidazol-duyarlı bir şekilde metal afinite reçinesi ile etkileşime girer. Biz Siz1 teklif, ve daha az oranda SLX5, onların metal koordinasyon HALKA etki yoluyla metal afinite reçine bağlamak edebiliyoruz. , Bildiğimiz kadarıyla, bu özel olay henüz rapor edilmemiş olsa da, benzer bir durum kolera toksin B alt ünitesi Ni 2 doğal histidin kalıntıları 11 aracılık bir şekilde + yakınlık reçine bağlar hangi tarif edilmiştir. En önemlisi, bu gözlem eksiltmekte proteinler, en azından kısmen, doğal olarak katlanmış olduğunu göstermektedir.
Özellikle, protein fonksiyonunun çalışması için protein kompleksleri bütün hücre ekstreleri, bozulmamış olarak kalan olduğunu göstermek için önemlidir. Bizim temsilcisi veri Siz1Δ440, Slx5 ve PGK1 (bir yükleme kontrol olarak hizmet veren bir sitozolik protein) KKE mevcut olduğunu ortaya koymaktadır. Siz1Δ440 metal yakınlık reçineler (Şekil 2C karşılaştırın) bağlamak için olan doğal yeteneğini esas bu ekstreler saflaştırılmıştır. Slx5 ve Siz1 maya hücrelerinde birlikte ifade edildiğinde, Eluatlar içinde Slx5 düzeyleri artmış,Slx5 Siz1 (Şekil 3) ile etkileşime girebilir olasılığını yükselterek.
Şekil 1. Çıkarma sonra maya hücre lizat içinde sağlam ve sumoylated proteinlerin varlığı. Bu protokol açıklandığı gibi aksi belirtilmedikçe tüm hücre ekstreleri hazırlanmıştır sürece. Numuneler, HA, V5 veya myc epitop etiketleri ya da antikorlar ile problandı, SDS-PAGE ve Western blotting sonra ayrıldı. Maya suşları, Tablo 3'te derlenmiştir. WB: western blot. (A) TCA-çöktürülmüş depolama kullanın (YÖK 2.514 (soldaki iki şerit) ve YÖK 2.592 (sağda iki şerit), (Δ0.2 OD / şerit) itibaren) Temsilcisi örnekleri bir jel leke ile boyanarak görüntülendi ( ) Malzeme bölümüne bakın. (B) Lane 1 ve 2: maya suşu YOK 2510 ile YÖK 251 homojenatlarında2 içeren galaktoz-aşırı ekspresyona uğramış Siz1-V5/6xHIS. Kısmen bozulmuş protein parçalarının olmadığına dikkat edin. Bir anti-V5 antikoru ile probed, bilinmeyen nedenlerden dolayı, bu özel örnek sumoylated adducts açıklamaz. Bununla birlikte, sumoilasyon Şekil l'de gösterilen gibi bir anti SUMO (anti-Smt3) antikoru ile tespit edilebilir. 1D. (C) Lane 3 ve 4: galaktoz-aşırı ekspresyona uğramış Siz1Δ440-HA içeren maya suşu YÖK 2.508 ve YÖK 2509 homojenatlarında. (D) Şerit 5, 6 ve 7: galaktoz aşırı ekspresyona Siz1-V5/6xHIS CO2 kullanılarak saflaştırılmıştır + metal afinite 200 mM imidazol ile çekilmiştir reçine, ve anti-V5 (şerit 5), anti-Smt3 (şerit ile problandı 6). Şerit 7, anti-V5 antikor ile şerit 6 bir reprobe olup. ve her ikisi de Siz1 ve sumoylated Siz1 aduktlar (Smt3 N) gösterir. (E) Lane 8: myc etiketli Siz1 (YÖK 2.397) endojen düzeyleri içeren JD52 wild tip hücreler. Temizlenmiş, bir memeli lizis tamponu kullanılarak hazırlandı lizat. Şerit 9: LyAnti-V5 agaroz ile 2 saat inkübasyondan sonra, süpernatant doyur. Siz1 bir sumoylated yaklaşımlarının unutmayın. Büyük resim görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Saflaştırılması aşırı dile getirilen TALON Metal Affinity reçine ile proteinleri içeren HALKA alan. Bu protokol açıklandığı gibi Galaktoz indüksiyon, protein ekstraksiyon ve saflaştırma yapıldı. Arıtma guanidinyum hidroklorür reçine ile inkübasyondan önce, 6 M numuneye ilave edildi için, doğal koşullar ve denatüre edici koşullar altında uygulandı. Lizat iki amiloz kontrol reçine (A) ve TALON Metal İlgi reçinesi (T) ile çalkalandı. Proteinler elüsyon tamponu içinde 200 mM imidazol ile elüt edilmiştir. Numuneler, SDS-PAGE ile ayrılmış ve Batı kurulanmıştır(DB), uygun bir epitop etiketi için bir antikor ile a.) Galaktoz indüklenen Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) B) galaktoz kaynaklı Slx5-GST (YOK 2071) idi yerli ve denatüre edici koşullar altında TALON reçine ile saflaştırılmıştır yerli olarak TALON reçine ile arıtılmış, ama koşullar denatüre değil. Doğru katlandığında Muhtemelen, metal koordine HALKA etki alanı TALON reçine ile etkileşime girer. C) Galaktoz bağlı Siz1Δ440-HA (YÖK 2.353) da yerli de TALON reçine ile arıtılmış, ama şartlar denatüre değildi. Bu proteinler 6xHis etiketleri içermez, ancak her doğal Zn 2 + iyonları koordine ve doğru katlandığında özünde TALON Metal Affinity reçine bağlama yeteneği görüşmek olabilir HALKA etki alanı, içermiyor. Büyük resim görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. TALON Metal İlgi reçinesi üzerinde aşırı ifade edilen proteinlerin Co-saflaştırılması.
JD52 hücreleri (suşları YOKs 2.353 2402, 2.224 sırasıyla) (+ / -) Slx5-GST ve Siz1Δ440-HA kendileri tarafından ya da bir arada ifade edildi. Proteinler olarak tarif ekstre edildi (WCE) ve lizatları TALON Metal İlgi reçinesi (bakınız Şekil 2) ile nutated edildi. Proteinler elüsyon tamponu (sıyırma maddesi) 200 mM imidazol ile reçineden yıkandı ve LDS numune tamponu içinde hazırlanmıştır. Proteinlerin SDS-PAGE ile ayrılmış ve Western lekeleme sonra HA tag veya uygun olarak GST künyesi için bir antikor ile problandı. Proteinlerin Eşit yükleme bir yükleme kontrol olarak PGK ile onaylanır. Slx5 arıtma Siz1Δ440 varlığında gelişmiş olduğunu unutmayın. Büyük resim görmek için buraya tıklayın .
| Çözüm | Bileşenleri | Yorumlar |
|---|---|---|
| 3x YEP | GKD 2 O 700 ml içinde 30 g maya hülasası 60 g Pepton | Malzemeyi karıştırın ve sterilize etmek için otoklav. Zaman kullanıma hazır 3x YEP tek tek hacimde% 6 filtre sterilize galaktoz ekle |
| TCA Örnek Tampon | % 15 gliserol 80 mM Tris Bankası (non-pH'd) 3.5% SDS bromofenol mavi "tat." Hacmi GKD 2 O ile 25 ml getirmek | Önce kullanın: 1 ml TCA Örnek Tampon için β-mercaptoethanol 40 ul (BME) ekleyin |
| Yıkama tamponu | 50 mM HEPES pH 7.3, 200 mM NaCI% 1 Triton X-100, 20 mM imidazol | İmidazol Ni 2 için kullanılan veya Co + 2 + metal afinite saflaştırma yalnızca |
| Lizis Tampon | 50 mM HEPES pH 7.3, 200 mM NaCI% 1 Triton X-100, 10 mM imidazol 1x proteaz inhibitörü kokteyl Kullanımdan hemen önce, proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. İmidazol + veya Co 2 + metal afinite saflaştırma Ni 2 için kullanılır. İSTEĞE BAĞLI: 25 mM N-etilmaleimid (sistein proteaz inhibitörü, sumoilasyon korumak için), 1 mM sodyum orthovanadate (protein tirozin fosfataz inhibitörü) ve / veya çalışma belirli bir alana dayalı diğer ampirik olarak tespit proteaz inhibitörleri | |
| Seyreltme Tampon | 50 mM HEPES pH 7.3, 200 mM NaCI 200 mM imidazol | İmidazol + veya Co 2 + metal afinite saflaştırma Ni 2 histidin bağlanma bölgeleri için rekabet etmek için kullanılır. Elüsyon için diğer yöntemler farklı afinite reçineleri kullanılabilir. |
| Yarı Kuru Transferi Buffer (10x) | 58 g Tris 29.3 g Glisin 18.75 ml% 20 SDS: GKD 2 O 1 L | Karışım 200 ml Metanol ve 700 ml GKD 2 Os ile 100 ml 10x Yarı Kuru Transferi Tampon: 1x Yarı Kuru Transferi Tampon yapmak için |
| Tris (TBS, 10x) Tuzlu Tamponlu | 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0, 150 ml 5 M NaCI, 300 ml GKD 2 O | 1x TBST yapmak için, 900 ml GKD 2 O ile 100 ml 10x TBS karıştırın ve TWEEN-20 1 ml |
Tablo 1. Çözümler ve Tamponlar.
| Uygulama | Hücrelerin miktarını | Sonraki Adımlar |
|---|---|---|
| Hücre Lizis | Hasat edilen hücre topağı 150-200 ODS | Adım 2 de tarif edildiği gibi dayak Boncuk |
| BOA bir Western Blot | Lize edilmiş hücreler hazırlanmış 2 ODS | Adım 2.6 'de tarif edilene TCA çöktürme yolu ile Western lekeleme için hazırlayın. Δ0.3 OD birimleri (Δ15 ul) jel üzerinde tükendi |
| Afinite saflaştırma ve / veya Düşürme | Lize edilmiş hücreler 30 ODS | Bind, Zehir ve adımları 3.2 ve 3.3 'te açıklandığı gibi proteinler hazırlamak |
| Yaklaşık 1-2 ODS (adım 3.3 'de olduğu gibi hazırlanmış ise) | Western Blot, adım 3.4 'de tarif |
Tablo 2'de. Bu Protokol başvuruları özeti.
| Ad | İlgili Genotip veya Ana Gerilme | Plazmid (ler) veya Kaset ekleme | Referans |
|---|---|---|---|
| YÖK 2.062 | Mata ura3-52, HIS3-Δ200 leu2-3, 112 TRP1-Δ63 LYS2-801 | Dohmen ve ark. 1995 | |
| YÖK 2.071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Maya GST toplama YSC4515-202.484.078) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.224 | JD52 | GAL1/10-KDV-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Maya GST toplama YSC4515-202.484.078); pRS425 (BOK 343) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdb-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endojen etiketli) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Maya GST toplama YSC4515-202.484.078); pAG425-GAL1-ccdb-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.501 | MHY3765, alfa eşleşme tip, ura3-52, LYS2-801, TRP1-Δ63, HIS3-Δ200, LEU2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: KanMX | Xie et al. 2010 |
| YÖK 2.508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: KanMX (YÖK 2.501) | pAG425-GAL1-ccdb-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: KanMX (YÖK 2.501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Maya GST toplama YSC4515-202.484.078); pAG425-GAL1-ccdb-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: KanMX (YÖK 2.501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (Bok 898); pRS425 (Bok 343) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: KanMX (YÖK 2.501) | Slx5-Protein A (Bok 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (Bok 898) | Bu çalışmada |
| YÖK 2.514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YÖK 2.397) | msn5Δ :: hygromycin | Bu çalışmada |
| YÖK 2.592 | JD52 içinde msn5Δ :: higromisine (YÖK 2.514) | slx5Δ :: kanMX4 | Bu çalışmada |
| YÖK 2.721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | Bu çalışmada |
Tablo 3. Maya Suşlarının.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol sağlam, yerli hazırlanması odaklanır, ve post-translationally aşağı akım uygulamaları için tomurcuklanan maya hücrelerinden protein değiştirilmiş. Bu protokol başlamadan önce, ilgi protein kolayca koşullar 12 denatüre hazırlanan protein özleri tespit edilebilir olmadığını belirlemek için önemlidir. Poliklonal antikorlar, mevcut değil ise bu füzyon proteininin Western lekeleri üzerinde tespit edilebilir, böylece etiket ilgi protein epitopa avantajlı olabilir. Bu protokol, HA, 6xHis-V5 veya myc epitopu etiketleri ile SIZ1 etiketlenmiş ve bu stratejinin bize açıkça Western blot (Şekil 1), protein ve sumoylated formları tanımlamak için izin verdi. Yüksek afiniteli bir anti-GFP antikorları (veriler gösterilmemiştir) elde etmek zor olabilir çünkü, GFP ile işaretlenmiş olan proteinlerin tespiti daha az başarılı olmuştur. Başka bir önemli konu ilgilenilen protein ekspresyon seviyesi ile ilgilidir. Bireysel Seviyeleriproteinler 4 tomurcuklanma maya hücreleri geniş çapta değişebilir ve bunlar, proteinlerin tespit ve / ya da saflaştırılmış, böylece aşırı ifade edilmesi gerekir. Galaktoz-indüklenebilir vektörleri, ilgili 2 maya geninin yüksek seviyede ifade edilmesi için kullanılabilir. Kromozomal-etiketli ORF ya da ikinci güçlü uyarılabilir galaktoz promotorunun kontrolü altında eksprese edildiği zaman, bir plazmid (Şekil 1). Eksprese edilen zaman Siz1 arasında durumda, tam uzunlukta veya kesik proteinin tespit etmek mümkün Kesikler arasında kullanım / fonksiyon analizleri yapıda yararlı olabilir ya da tam uzunlukta molekülü ifade etmek zor ya da kararsız olduğu. Galaktoz bağlı aşırı protein tespiti ve arıtma artırır iken potansiyel hücre döngüsü özel translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşimleri fizyolojik uygunluğu incelenirken, açıkça sınırlamaları vardır. Örneğin, sumoilasyon Siz1 arasında, hücre döngüsünün G2 / M aşamada en yaygın olan ve modifikasyonlar veya etkileşimleriaşırı ekspresyona uğramış protein diğer deneysel yollarla teyit edilmesi gerekebilir. Son olarak, belirli proteaz, fosfataz ve / veya proteozom inhibitörlerinin eklenmesi Bu protokolün başarısı için önemli bir husustur. Genel olarak, en iyi sonuçları hücrelerin dondurulmuş ve ekstraksiyon ve seyreltme tampon içine önce bu inhibitörlerin eklenmesi ile elde edilir. Bu sonraki metal afinite arındırmalardan engel olabilecek EDTA, proteaz inhibitörü kokteyl bazen mevcut bir metal iyonu şelasyon, yanı sıra tavsiye edilmez.
Boncuk dövülmesi ile elde protein ekstreleri, bireysel proteinlerin saflaştırılması için başlangıç malzemesi olarak uygundur. Özellikle, 6xHis afinite etiketi taşıyan aşırı ekspresyona Slx5 bir metal afinite reçinesi (Şekil 2A) ile KKE saflaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Post-translasyonel modifikasyonlar korumak ve protein degradasyonu önlemek için, 6xHis-etiketli proteinler genellikle denatüre edici koşullar altında saflaştınlır5. Bununla birlikte, doğal koşullar altında proteinin saflaştırılması ile ilgili belirgin avantajları vardır. Örneğin, bu proteinlerin bağlanma ortakları ile birlikte saflaştırmak ya da in vitro deneylerle 13,14 müteakip kullanılabilir. Siz1 ve Slx5 durumunda biz tesadüfen her iki protein de 6xHis etiketi bağımsız metal afinite reçinesi için içsel bir afinite sergileyen ve bu gözlem, her iki protein de yerel teyit kabul bizim için önerilen olduğu belirlenmiştir. Ne yazık ki, saflaştırılmış proteinlerin uygun katlama ve biyolojik aktivite ayrı ayrı bir dava üzerinde belirlenmelidir. Bu amaca yönelik olarak, ya da amino ya da karboksi ucunda afinite ve epitop etiketleri yerleştirilmesi, büyük füzyon proteininin aktivitesini veya stabilitesini etkileyebilecek ve bir protein saflaştırma stratejisi planlanmasında önemli bir husustur olabilir.
Gelecek çalışma sınavı için arıtma sırasında translasyon sonrası modifikasyonlar, geliştirmek için nasıl ele alınacakproteaz eksikliği olan maya suşları, farklı proteaz inhibitörleri ya da diğer afinite etiketleri kullanımı yoluyla ple. Biz mevcut veya tampon optimize edilmiş şeklinde bu protokol birçok tomurcuklanan maya proteinlerin ölçeklenebilir çıkarma, arıtma ve sonraki çalışma için geçerli olduğunu tahmin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz onların destek için Kerscher laboratuar tüm üyeleri teşekkür ederiz. Biz maya suşu MHY3765 Mark Hochstrasser teşekkür ederim. Bu çalışma, NSF hibe 1051970 (OK) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Seyahat hibe ve Monroe Alimler Programı Hibe (ES) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al.
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
