Summary
A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.
Abstract
Homogeneização por espancamento talão é uma maneira rápida e eficiente para liberar DNA, RNA, proteínas e metabólitos de células de levedura de brotamento, que são notoriamente difíceis de romper. Aqui descrevemos o uso de um homogeneizador de moinho de esferas para a extracção de proteínas nos buffers optimizados para manter as funções, interações e modificações pós-traducionais das proteínas. As células em crescimento logarítmica que expressam a proteína de interesse é cultivada num meio de crescimento líquido de escolha. Os meios de cultura podem ser suplementados com os reagentes para induzir a expressão de proteína a partir de promotores inductíveis (por exemplo galactose), sincronizar estágio do ciclo celular (por exemplo, nocodazol), ou inibir a função do proteassoma (por exemplo, MG132). As células são então sedimentadas e ressuspensas num tampão adequado contendo a protease e / ou inibidores de fosfatase e seja processado imediatamente ou congelado em azoto líquido para posterior utilização. A homogeneização é realizada por seis ciclos de 20 seg bead-batimento (5,5 m / seg), cada um seguido por um minuto de incubação sobre gelo. O homogenato resultante foi clarificado por centrifugação e as pequenas partículas podem ser removidas por filtração. O extracto celular total foi afastada resultante (WCE) é precipitado utilizando 20% de TCA para análise directa de proteínas totais por SDS-PAGE seguido por Western blotting. Os extractos são também adequados para a purificação por afinidade de proteínas específicas, a detecção de modificações pós-tradução, ou a análise de proteínas de co-purificação. Como é o caso para a maioria dos protocolos de purificação de proteínas, algumas enzimas e proteínas podem exigir condições únicas ou composições de tampão para a sua purificação, e outros podem ser instáveis ou insolúveis sob as condições indicadas. Neste último caso, o protocolo apresentado pode proporcionar um ponto de partida útil para determinar empiricamente a melhor estratégia talão batimento para a extracção e purificação de proteínas. Mostramos a extração e purificação de um epitopo-marcado SUMO E3 ligase, Siz1, um ciclo celularregulada proteína que se torna tanto sumoylated e fosforilada, bem como uma subunidade de ubiquitina ligase SUMO-alvo, Slx5.
Introduction
O incrível poder de fermento genética é lendária, mas a preparação e análise de proteínas nativas da levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, é muitas vezes repleta de problemas. O último é devido ao considerável resistência mecânica e elasticidade da parede da célula de levedura 1. Diferentes meios têm sido descritos para a ruptura das células de levedura para obter extracto de proteína de célula inteira 2-6 enzimática, química, mecânica e baseada pressão. Estas técnicas variam muito na sua eficácia para produzir extractos de proteínas nativas de células representativas, que podem ser utilizados para análises posteriores ou de passos de purificação. Por exemplo, a parede celular de levedura podem ser removidas com enzimas líticas (por exemplo, Zymolyase) e esferoblastos resultantes podem ser rompidas por cisalhamento, detergentes, ou lise osmótica para libertar proteínas. Esta abordagem tem sido utilizada com sucesso como o ponto de partida para muitos fraccionamentos subcelulares mas requer longas incubaçõesque não são compatíveis com a estabilidade de algumas proteínas 7.
Os reagentes de lise de levedura farmacêuticas (tais como detergentes) para a extracção química de proteínas de células de levedura estão disponíveis comercialmente, mas a eficácia destes reagentes na extracção da proteína e do seu efeito na subsequente caracterização bioquímica de proteínas não é sempre claro 8. Os homogeneizadores de alta pressão, muitas vezes referida como prensas Francesa, quebrar eficazmente células de levedura por primeiro submetendo-os a alta pressão e, em seguida, extrudindo-los através de uma pequena abertura de uma célula de pressão. Esta técnica produz extractos de elevada qualidade, mas o equipamento é muito caro e pode não ser adequado para pequenas quantidades de amostras de células ou múltiplos 9. Por conseguinte, a ruptura mecânica das células de levedura num moinho de esferas é frequentemente o método de escolha para a preparação de proteínas de levedura nativas 10. Esta técnica envolve a ruptura mecânica da parede celular da levedura com ácido-waverter esferas de vidro, que podem ser realizados com uma grande variedade de agitadores, moinhos de vortexers ou grânulo. Nomeadamente, este método pode ser usado para processar simultaneamente múltiplas amostras pequenas (1 ml de células ou menos). Muitas contas diferentes ou talão moinho matrizes rompimento já estão disponíveis comercialmente para interromper qualquer tipo de tipo de célula em tubos de 2 ml. Considerando as outras técnicas e equipamentos, um moinho de esferas tem a vantagem adicional de que a ruptura das células de levedura ocorre muito rapidamente, o que ajuda a preservar a modificações pós-translacionais, tais como sumoilação, especialmente quando são utilizados os tampões apropriados com protease e / ou inibidores de proteassoma e a temperatura é controlada de extractos.
Este protocolo centra-se na extração rápida, eficaz e confiável de proteínas endógenas e sobre-expressos em condições suaves com o objetivo final de preservar a função da proteína, interações e modificações pós-traducionais. O meio de crescimento, tampão de lise celularAs composições e configurações de moinho de esferas são optimizados para manter as interacções proteicas e modificações pós-traducionais tais como sumoilação e ubiquitinação.
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Protocol
Purificação de proteínas 6xHis-tagged expressos em células de levedura sob condições nativas brotamento
1. O crescimento de células de levedura e a indução da expressão de proteina
(Modificado a partir de 2)
OPCIONAL: Use logaritmicamente crescentes culturas de levedura que expressam a proteína de interesse, em vez das culturas induzidas galactose descritos abaixo.
- Transformar células de uma estirpe de levedura + Gal com um plasmídeo que codifica uma proteína indutivel galactose de escolha 6xHis-tag. Por exemplo, veja a lista dos reagentes.
- Inocular os transformantes em 5 ml de meio selectivo apropriado (por exemplo, DP-uracilo), contendo 2% de sacarose. Incubar a 30 ° CO / N, rotação.
- Diluir O / N a cultura de modo a que a densidade óptica a 600 nm mede 0,3 (DO600 = 0,3) em 33 ml de meio selectivo com 2% de sacarose. Crescer a 30 ° C, com agitação (Δ150 rpm).
- Quando a cultura atingiu OD 600 = 0,8-1.5, Induzir a expressão da proteína pretendida por adição de 17 ml de YEP 3x com 6% de galactose (Receita na Tabela 1), para uma concentração final de 1x YEP com 2% de galactose. Volume de cultura total agora é de 50 ml. Incubar, agitação, a 30 ° C durante uma hora adicional de 5-6.
Nota: o volume de cultura pode ser variada. No passo 1.3, diluído em dois terços do volume final pretendido. No passo 1.4, adicionar um terço do volume final de 3x YEP / 6% de galactose. - Medir a DO600 da cultura induzida e centrifugar Δ150-200 OD de 600 unidades de células durante 5 min a 5000 rpm a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento de células com 1 ml de gelo frio 1x com PBS 1x cocktail inibidor de protease e transferir para um tubo de tampa 2 ml parafuso.
- Centrifugar as células durante 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante.
- Encaixe sedimento celular congelamento em azoto líquido, seguido de imediato de lise celular ou de armazenamento a -80 ° C até à sua utilização.
- Para a célula de sedimento congelado a partir do passo anterior, adiciona-se 200 ul de contas de vidro lavadas com ácido e 500 ul de tampão de lise gelado (receita na Tabela 1, ou usar tampão de escolha de lise celular).
- Resumidamente pipeta cima e para baixo. Não é necessário para ressuspender completamente o sedimento celular. Manter os tubos em gelo em todos os momentos.
Nota: O fim da ponteira pode ser cortada antes de pipetagem cima e para baixo. - A 4 ° C, colocar o tubo (s) com as células para o moinho de bolas, equilíbrio, bloqueio e executar a máquina como por instruções do fabricante.
- Executar o batedor de talão contendo o tubo (s) de 20 segundos a 5,5 m / seg, e depois colocar em gelo lamacento durante 1 min. Repita 6x no total.
- Limpar as proteínas extraídas através de centrifugação durante 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPCIONAL: remover pequenas partículas por centrifugação através de um filtro Esfinge.
- Prepara-se uma amostra de toda a célula eXtract (WCE) para confirmar a presença da proteína de interesse por meio de Western Blot:
- Adicionar WCE correspondente com 2 600 unidades de OD de células (por exemplo, 5 mL do extracto limpo se 200 OD de 600 unidades de células foram colhidas) a 800 ul de 20% de ácido tricloroacético (TCA). Vortex para misturar.
- Centrifugar durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante, mas tenha cuidado para manter o sedimento.
- Adicionar 800 uL de TCA a 2%, a pelete e o tubo de vórtice, seguido por centrifugação durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante, mas tenha cuidado para manter o sedimento.
- Adicionar 100 ul de tampão de amostra de TCA (Receita na Tabela 1), vortex para dissolver o sedimento. Nota: Se o tampão de amostra torna-se ácido (fica amarelo) após a adição ao sedimento, adicione alíquotas de Δ10 mL de Tris base de [1M] até que a amostra é azul novamente.
- Incubar em um bloco de calor de 100 ° C por 2-5 min.
- Vortex again para dissolver totalmente se restos de pellet ainda estão presentes. Peletes preparados por este método são notoriamente difíceis de dissolver totalmente. Pode levar Δ10 min de vortex para dissolver completamente peletes.
- Amostra Armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
- Encaixe congelar alíquotas do restante WCE apuradas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
3. Purificação de Proteínas de lote homogenatos celulares de leveduras
Nota: Este método de purificação foi optimizado para a purificação de proteínas 6xHis-tag em Co 2 + resina de afinidade com metal.
- Equilíbrio resina
- Para uma amostra de WCE preparadas a partir Δ20 sacudiu-40 OD de 600 unidades de células, adiciona 50-100 ul de resina de afinidade para um tubo de microcentrífuga. As proteínas extraídas a partir de células que não expressam a proteína desejada ou uma resina não específica, tais como amilose, pode ser usado como controles para a ligação inespecífica.
- Lavar a resina 5x com 1 ml de tampão de lavagem: invertido topo-a-fundo para que a resina é suspensa de novo, e depois girar durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante.
Nota: se efectuar a extracção e purificação, no mesmo dia, o equilíbrio da resina pode ser realizada antes da extracção.
- Binding Protein Purificação por Afinidade
- Adicionar 100-200 ul de ligado clarificado (Δ20 OD-40 600 unidades) para 50-100 ul de pérolas lavadas, e perfazer um volume total de 1 ml com tampão de lise.
- Incubar com nutation ou balanço a 4 ° C por 2-5 horas.
- Girar durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C.
- Se desejado, guardar uma amostra do sobrenadante para análise posterior remanescente de proteínas não ligadas. TCA precipitam como descrito acima para o WCE (passo 2.6).
- Lavar a resina com proteínas ligadas 5x com 1 ml de tampão de lavagem, seguido por uma centrifugação durante 1 min a 5000 rpm a4 ° C. Manter as amostras frio durante as lavagens.
- A eluição das proteínas ligadas
- Adicionar 150 ul de tampão de eluição à resina, nutar a 4 ° C durante 5 min, centrifugação durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C e guardar o sobrenadante num novo tubo. OPCIONAL: Repita 2x e eluições piscina.
- Prepare a amostra eluída por Western Blot: Para 25 mL de proteínas eluídas, adicionar 25 ul de dodecil-sulfato de lítio 2x (LDS) com tampão de amostra de 2 ul β-mercaptoetanol (BME) e incubar em ° C num bloco de aquecimento 100 por 2 min.
Nota: O tampão de amostra de Laemmli 2X padrão também podem ser usadas. - Tire o excesso de proteína eluída congelamento em nitrogênio líquido.
OPCIONAL: tiras restantes proteínas a partir da resina com um volume igual de 2x tampão de amostra de LDS a 65 ° C durante 5 minutos, remover as proteínas LDS-eluídas para um novo tubo, em seguida, adicionar 2 mL de BME para as proteínas eluídas, e não para a resina. Esta ordem é para impedir a remoção de quaisquer iões ou anticorpos que são Conjugated às pérolas. - Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização.
- Western Blot e de sonda com anticorpos adequados para visualizar as proteínas.
- Carregar 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 unidades) de cada amostra e 3-10 uL de uma escada de proteína num gel de SDS-PAGE de escolha. Géis rotineiramente utilizados para este protocolo incluem 4-12% de Bis-Tris e 8% de Tris-Glicina.
- Executar gel a 200 V durante 50 min.
- Transferir as proteínas do gel para uma membrana de PVDF de transferência semi-seco, a 19 V durante 20-30 minutos (a receita na Tabela 1).
- Bloco de membrana em 4% milk/1x tampão salino Tris-Tween (TBST), durante 1 hora à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C (a receita na Tabela 1).
- Incubar a membrana com anticorpo primário à proteína marcadas com epítopo de interesse em 4% milk/1x TBST durante 1-3 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C.
- Lave membrana 3x por 5 minutos cada com TBST 1x.
- Incubar a membrana com adequadaperoxidase de rábano secundário (HRP) conjugado anticorpo durante 1-3 horas à temperatura ambiente.
- Lavar membrana 3x durante 15 minutos cada uma em um grande volume de TBST 1x.
- Cubra membrana com substrato ECL e embrulhe em papel filme.
- Expor membrana para filmar e desenvolver a visualizar proteínas.
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Representative Results
Os resultados representativos revelam que o protocolo de extracção de grânulo proteína-batimento e descrita é útil para a preparação de proteínas reprodutíveis para uma variedade de aplicações a jusante (resumidos na Tabela 2). SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie de WCEs mostrar que uma grande variedade de proteínas (12 a> ~ 250 kDa) podem ser reprodutivelmente extraído de células de levedura (Figura 1A). Bandas discretas ao longo de um intervalo de pesos moleculares são indicativos de extractos de proteína de alta qualidade. A qualidade dos extractos pode ser confirmada por western blotting de proteínas marcadas com epítopo específicos. É mostrado um resultado representativo para a galactose sobreexpressa, V5-tag SUMO ligase Siz1 que migra em Δ120kDa (Figura 1B). Geralmente, as proteínas parcialmente degradadas seria executado como vários fragmentos abaixo do peso esperado, mas aqui só proteína de comprimento total é observado. Adicionalmente, os adutos de peso molecular elevado de uma proteína dadapode indicar modificações pós-traducionais. Por exemplo, vamos mostrar-galactose overexpressed sumoylated Siz1Δ440 e comprimento total Siz1 (Figura 1C e Figura 1D). As modificações podem também ser conservadas em endogenamente expressa Siz1 (Figura 1E).
Fornecemos resultados representativos que duas proteínas enriquecidas nucleares, e Slx5 Siz1Δ440, foram purificados com sucesso das nossas WCEs (Figuras 2A, 2B e 2C). Notavelmente, mostra-se que uma proteína 6xHis-tag (Figura 2A; Slx5) podem ser de afinidade purificada a partir de nossos WCEs tanto em condições nativas e desnaturantes. Em contraste, Slx5-GST (figura 2B) e Siz1Δ440-HA (Figura 2C) possuem um epitopo 6xHis mas sob condições nativas ainda interagir com a resina de afinidade de metal-imidazole de forma sensível. Propomos que Siz1, e, em menor medida, SLX5, são capazes de se ligar à resina metal afinidade através da sua coordenação de metal-domínio ANEL. Enquanto que, para o nosso conhecimento, este fenómeno particular não foi ainda relatado, uma situação semelhante foi descrito em que a subunidade B da toxina da cólera liga de Ni 2 + resina de afinidade de um modo mediado pelos seus resíduos de histidina singulares 11. Mais importante, esta observação sugere que as proteínas no WCE são, pelo menos em parte, de forma nativa dobrada.
Especialmente para o estudo da função da proteína que é importante demonstrar que a complexos de proteínas permanecem intactas em extractos de células inteiras. Os dados representativos mostram que Siz1Δ440, Slx5 e PGK1 (uma proteína citosólica, que serve como um controlo de carga) estavam presentes em WCEs. Siz1Δ440 foi purificado a partir destes extractos com base na sua capacidade inerente para se ligar com as resinas de afinidade de metal (comparar com a figura 2C). Quando Slx5 Siz1 e foram co-expressos em células de levedura, Slx5 níveis nos eluatos foram aumentadas,levantando a possibilidade de que possam interagir com Slx5 Siz1 (Figura 3).
Figura 1. A presença de proteínas intactas e sumoylated no lisado celular de levedura após a extracção. Salvo indicação em contrário, os extractos celulares totais foram preparados como descrito no presente protocolo. As amostras foram separadas por SDS-PAGE e depois transferência de Western foram sondadas com anticorpos, quer ao HA, V5, ou marcadores de epitopo myc. As estirpes de levedura estão compilados na Tabela 3. WB: western blot. (A) As amostras representativas dos WCE TCA-precipitado (YOK de 2514 (duas faixas à esquerda) e YOK 2592 (duas faixas à direita), (Δ0.2 OD / pista)) foram visualizados por coloração com um gel mancha ( consulte a secção de Materiais). (B) A pista 1 e 2: Os homogeneizados de levedura estirpe YOK 2510 e 251 YOK2 contendo Siz1-V5/6xHIS galactose overexpressed. Note-se a ausência de fragmentos de proteína parcialmente degradada. Por razões desconhecidas, esta amostra particular não revela adutos sumoylated quando sondada com um anticorpo anti-V5. No entanto, sumoilação pode ser detectada com um anti SUMO (anti-SMT3) anticorpo como mostrado na FIG. 1D. (C) Pista 3 e 4: homogeneizados de levedura tensão YOK 2508 e 2509 YOK contendo galactose-overexpressed Siz1Δ440-HA. (D) A pista 5, 6 e 7: Siz1-V5/6xHIS galactose overexpressed foi purificado utilizando Co 2 + resina de afinidade de metal, eluída com imidazol 200 mM, e sondadas com anticorpos anti-V5 (pista 5), anti-SMT3 (pista 6). A pista 7 é uma reprobe de pista 6, com o anticorpo anti-V5. e mostra ambas Siz1 e sumoylated Siz1 adutos SMT3 (n). (E) Pista 8: JD52 células de tipo selvagem que contêm níveis endógenos de myc-marcado Siz1 (YOK 2397). Limpa lisado preparado usando um tampão de lise de mamífero. Pista 9: Lysaciar sobrenadante após uma hora de incubação 2 com anti-V5 agarose. Nota adutos sumoylated de Siz1. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Purificação de sobre-expressado domínio RING-contendo proteínas com a resina de afinidade com metal TALON. Indução de galactose, a extracção e purificação de proteínas foram realizadas como descrito no presente protocolo. A purificação foi realizada sob condições nativas e das condições de desnaturação, para os quais foi adicionado cloridrato de guanidina a 6 M à amostra antes da incubação com a resina. Lisado foi rodado tanto com a resina de amilose de controlo (A) e a resina de afinidade com metal TALON (T). As proteínas foram eluídas com imidazolo 200 mM em tampão de eluição. As amostras foram separadas por SDS-PAGE e Western blotted(BM) com um anticorpo para o epitopo marcador apropriado. D) Galactose induzida Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) foi purificado com resina TALON sob ambas as condições nativas e desnaturantes B) Galactose induzida Slx5-GST (YOK 2071) foi purificado com resina TALON no estado nativo, mas não condições de desnaturação. Presumivelmente, o metal de coordenação domínio ANEL interage com resina TALON quando devidamente dobrada. C) Galactose induzida Siz1Δ440-HA (YOK 2353) também foi purificado com resina TALON no estado nativo, mas não condições de desnaturação. Estas proteínas não contêm marcas 6xHis, mas cada um contém um domínio RING, que, naturalmente, coordena Zn 2 + e íons podem conferir a capacidade de se ligar intrinsecamente TALON resina de afinidade do metal quando devidamente dobrado. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Co-purificação de proteínas sobre-expressas em TALON resina de afinidade do metal.
Slx5-GST e Siz1Δ440-HA, foram expressos, isoladamente ou em combinação (+ / -) em células JD52 YOKs (estirpes 2353, 2402, 2224, respectivamente). As proteínas foram extraídas como descrito (WCE) e os lisados foram nutada com resina de afinidade com metal TALON (ver Figura 2). As proteínas foram eluídas a partir da resina com imidazol 200 mM no tampão de eluição (eluato) e preparados em tampão de amostra de LDS. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e depois transferência de Western foram sondadas com um anticorpo contra o marcador de HA ou o tag de GST, conforme apropriado. Iguais carga de proteínas é confirmado com PGK como um controlo de carregamento. Note-se que Slx5 purificação é reforçada na presença de Siz1Δ440. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
| Solução | Componentes | Comentários |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g de extracto de levedura 60 g de peptona, em 700 ml de ddH2O | Misture os ingredientes e autoclave para esterilizar. Adicionar filtro esterilizado de galactose a 6%, a alíquotas individuais de 3x YEP quando pronto para uso |
| Tampão de Amostra TCA | 15% de glicerol 80 mM Tris Base (não pH'd) 3,5% SDS bromofenol azul "a gosto". Levar o volume a 25 ml com ddH2O | Antes de usar: adicionar 40 ul de β-mercaptoetanol (BME) a 1 ml de tampão de amostra TCA |
| Tampão de Lavagem | 50 mM de HEPES pH 7,3, 200 mM de NaCl, X-100 mM de imidazol 1% Triton 20 | Imidazol usado para Ni 2 + e Co 2 + apenas afinidade de metal purificação |
| Tampão de Lise | 50 mM de HEPES pH 7,3, 200 mM de NaCl, 1% de Triton X-100 a 10 mM, imidazol 1x cocktail inibidor de protease Adicionar cocktail de inibidores de protease imediatamente antes da utilização. Imidazol usado apenas + ou Co 2 + de metal afinidade purificação para Ni 2. OPCIONAL: 25 mM de N-etilmaleimida (inibidor de protease de cisteína, para preservar sumoilação), 1 mM de ortovanadato de sódio (inibidor da proteína tirosina fosfatase), e / ou outros inibidores da protease determinados empiricamente com base na área específica de estudo | |
| Tampão de eluição | 50 mM de HEPES pH 7,3 mM de NaCl, 200 mM de imidazol 200 | Imidazol usado para competir por sítios de ligação histidina + ou Co 2 + apenas afinidade de metal purificação em Ni 2. Outros métodos de eluição podem ser utilizados para as resinas de afinidade diferentes. |
| Semi buffer de transferência seco (10x) | Em 1 L de ddH2O: 58 g de Tris 29,3 g Glicina 18,75 ml de SDS a 20% | Para fazer 1x Semi Dry Transferência de buffer: misture 100 ml 10x Semi buffer de transferência seco com 200 ml de metanol e 700 ml DDH 2 Os |
| Tris Buffered Saline (TBS, 10x) | 50 ml 1 M de Tris-HCl, pH 8,0 150 mL de 5 M de NaCl 300 mL ddH2O | Para fazer 1x TBST, misture 100 ml TBS 10x com 900 ml DDH 2 O e adicionar 1 ml de Tween-20 |
Tabela 1. Soluções e tampões.
| Aplicação | Quantidade de células | Próximos Passos |
|---|---|---|
| Lise Celular | 150-200 overdose de colhida pellet celular | Grânulo bater como descrito no passo 2 |
| Western Blot de WCE | 2 overdoses de células lisadas preparadas | Preparar por Western Blot por precipitação com TCA, como descrito na etapa 2.6. Δ0.3 unidades OD (Δ15 mL) esgotou em gel |
| A purificação por afinidade e / ou pulldown | 30 ODS de células lisadas | Bind, elui-se, e a preparação de proteínas como descrito nas etapas 3.2 e 3.3 |
| Aproximadamente 1-2 ODS (se preparada como no passo 3.3) | Western blot tal como descrito na etapa 3.4 |
Tabela 2. Resumo dos pedidos de presente Protocolo.
| Nome | Genótipo ou Strain Pai relevante | O plasmídeo (s) ou inserção cassete | Referência |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATa ura3-52 his3-Δ200 Ieu2-3, 112 trp1-Δ63 Iys2-801 | Dohmen et ai. De 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Yeast GST coleção YSC4515-202484078) | Neste estudo |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | Neste estudo |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Yeast coleção GST YSC4515-202484078); pRS425 (BOK 343) | Neste estudo |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | Neste estudo |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogenamente marcado) | Neste estudo |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Yeast coleção GST YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | Neste estudo |
| YOK 2501 | MHY3765, alfa tipo de acasalamento, ura3-52, Iys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX | Xie et al., 2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | Neste estudo |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Yeast coleção GST YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | Neste estudo |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898); pRS425 (BOK 343) | Neste estudo |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | Slx5-Proteína A (BOK 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | Neste estudo |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YOK 2397) | msn5Δ :: higromicina | Neste estudo |
| YOK 2592 | msn5Δ :: higromicina em JD52 (YOK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | Neste estudo |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | Neste estudo |
Tabela 3. Cepas de leveduras.
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Discussion
Este protocolo centra-se na preparação de intacta, nativo, e as proteínas modificada após a tradução a partir de células de levedura de brotamento para aplicações a jusante. Antes de efectuar este protocolo, é crítico para determinar se a proteína de interesse pode ser facilmente detectado em extractos proteicos preparados sob condições de desnaturação 12. Se os anticorpos policlonais não estão disponíveis, pode ser vantajoso para epitopos marcação da proteína de interesse de modo a que a proteína de fusão pode ser detectada em transferências de Western. No presente protocolo, marcado SIZ1 com o HA, 6xHis-V5, ou marcadores de epitopo myc e esta estratégia nos permitiu identificar claramente as proteínas e suas formas sumoylated em Western blot (Figura 1). Tivemos sucesso menos detectar proteínas GFP, possivelmente porque os anticorpos anti-GFP de afinidade elevada são difíceis de obter (dados não mostrados). Outra questão diz respeito ao nível crítico da proteína de interesse expressão. Níveis de indivíduoproteínas variam amplamente em células de levedura de brotamento 4 e algumas proteínas têm de ser sobre-expressa de forma que pode ser detectada e / ou purificada. Vector galactose induzíveis estão disponíveis para a expressão de nível elevado do gene de interesse de levedura 2. No caso de Siz1, fomos capazes de detectar a proteína de comprimento completo ou truncada, quando expresso a partir de ORF cromossomicamente marcados ou, quando expressa sob o controlo do forte promotor induzível de galactose a partir de um plasmídeo (Figura 1). O uso de truncamentos podem ser úteis em análises de estrutura / função, ou quando a molécula de comprimento completo é difícil de expressar ou instável. Embora a superexpressão induzida por galactose aumenta a detecção e purificação de proteínas, tem limitações evidentes quando se estuda a relevância fisiológica de potenciais específicos do ciclo celular, as modificações pós-traducionais e interacções. Por exemplo, sumoilação de Siz1 é mais prevalente na fase do ciclo celular G2 / M, e de modificações ou de interacçõesa proteína sobreexpressa podem ter de ser confirmadas por outros meios experimentais. Finalmente, a adição de protease específica, fosfatase e / ou inibidores de proteassoma é uma consideração importante para o sucesso deste protocolo. Geralmente, os melhores resultados são obtidos pela adição destes inibidores antes de as células são congeladas e em tampões de extracção e diluição. A adição de EDTA, um quelante de íon metálico, por vezes presente em coquetéis inibidores da protease, não é aconselhável, pois pode interferir com posteriores purificações afinidade metal.
Extractos proteicos obtidos por talão batendo são adequados como material de partida para a purificação de proteínas individuais. Especificamente, mostra-se que Slx5 overexpressed transportam um marcador de afinidade 6xHis pode ser purificada a partir WCEs utilizando uma resina de afinidade com metal (Figura 2A). Para preservar a modificações pós-traducionais e reduzir a degradação de proteínas, proteínas 6xHis-tagged são frequentemente purificado sob condições desnaturantes5. No entanto, existem vantagens associadas com a purificação de proteínas sob condições nativas. Por exemplo, estas proteínas podem co-purificam com os parceiros de ligação ou podem ser utilizados em ensaios in vitro subsequente 13,14. No caso de Siz1 e Slx5 nós serendipitously determinado que ambas as proteínas exibem afinidade intrínseca para a resina de afinidade com metal, independentemente da marca do 6xHis, e esta observação sugeriu-nos que ambas as proteínas nativas assumido confirmações. Infelizmente, a actividade biológica correcta dobragem e de proteínas purificadas tem que ser determinada caso a caso. Para este fim, a colocação de etiquetas de afinidade e em cada epitopo no terminal amino ou carboxi, pode afectar significativamente a actividade ou a estabilidade da proteína de fusão e é uma consideração importante no planeamento de uma estratégia de purificação de proteínas.
O trabalho futuro vai se concentrar em como melhorar a modificações pós-traducionais durante a purificação, para exameplo, através da utilização de estirpes deficientes em protease de levedura, inibidores de protease diferentes, ou outras marcas de afinidade. Prevemos que este protocolo em sua forma atual ou tampão otimizado é aplicável para o estudo de extração, purificação e posterior escalável de muitas proteínas de leveduras de brotamento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros do laboratório Kerscher pelo seu apoio. Agradecemos Mark Hochstrasser para o fermento tensão MHY3765. Este trabalho foi financiado pela NSF 1051970 (para OK) e um Howard Hughes Medical Institute Graduação viagem concessão e Monroe Scholars Programa Grant (para ES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
