Summary
La préparation d'extraits de levure de haute qualité est une première étape nécessaire à l'analyse des protéines individuelles ou protéomes entiers. Nous décrivons ici un protocole d'homogénéisation rapide, efficace et fiable pour les cellules de levure en herbe qui a été optimisé afin de préserver les fonctions des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles.
Abstract
Homogénéisation en battant perle est un moyen rapide et efficace pour libérer l'ADN, l'ARN, les protéines et les métabolites à partir de cellules de levure en herbe, qui sont notoirement difficiles à perturber. Nous décrivons ici l'utilisation d'un homogénéiseur broyeur à billes pour l'extraction des protéines dans des tampons optimisés pour maintenir les fonctions, les interactions et les modifications post-traductionnelles des protéines. Cellules en croissance logarithmique exprimant la protéine d'intérêt sont cultivées dans un milieu de croissance liquide de choix. Les milieux de culture peuvent être complétées par des réactifs pour induire l'expression de la protéine à partir de promoteurs inductibles (par exemple le galactose), synchroniser stade du cycle cellulaire (par exemple le nocodazole), ou d'inhiber la fonction du protéasome (par exemple MG132). Les cellules sont ensuite culot et remises en suspension dans un tampon approprié contenant la protéase et / ou inhibiteurs de phosphatases et soient traités immédiatement ou congelés dans l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. L'homogénéisation est réalisée par six cycles de 20 sec bead-battement (5,5 m / s), chacun suivi d'une incubation d'une minute sur la glace. L'homogénat obtenu est clarifié par centrifugation et les petites particules peut être éliminé par filtration. L'extrait de cellules entières dégagé résultant (WCE) est précipité en utilisant 20% de TCA pour l'analyse directe des protéines totales par SDS-PAGE suivie par Western blot. Extraits sont également appropriés pour la purification par affinité de protéines spécifiques, la détection des modifications post-traductionnelles, ou l'analyse de protéines co-purification. Comme c'est le cas pour la plupart des protocoles de purification des protéines, des enzymes et des protéines peuvent exiger des conditions particulières ou des compositions de tampons pour leur purification et d'autres peuvent être instables ou insoluble dans les conditions indiquées. Dans ce dernier cas, le protocole présenté peut fournir un point de départ utile pour déterminer empiriquement la meilleure stratégie de perles battre pour l'extraction et purification des protéines. Nous montrons l'extraction et la purification d'un épitope étiqueté SUMO E3 ligase, SIZ1, un cycle cellulaireréglage protéine qui devient à la fois sumoylée et phosphorylé, ainsi que d'une sous-unité de l'ubiquitine ligase SUMO ciblée, Slx5.
Introduction
La puissance impressionnante de levure génétique est légendaire, mais la préparation et l'analyse des protéines natives de levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, est souvent source de nombreux problèmes. Celle-ci est due à la résistance mécanique importante et l'élasticité de la paroi une cellule de levure. Différents moyens ont été décrits pour la perturbation des cellules de levure pour obtenir un extrait de protéines de cellules entières 2-6 enzymatique, chimique, mécanique, et basée sur la pression. Ces techniques varient considérablement dans leur efficacité à produire des extraits de protéines de cellules représentatives, indigènes qui peuvent être utilisés pour des analyses ultérieures ou des étapes de purification. Par exemple, la paroi cellulaire de la levure peut être retiré avec des enzymes lytiques (par exemple zymolyase) et sphéroblastes résultant peut être perturbé par cisaillement, des détergents, ou lyse osmotique pour libérer des protéines. Cette approche a été utilisée avec succès comme point de départ pour de nombreux fractionnements subcellulaires mais il exige de longues incubationsqui ne sont pas compatibles avec la stabilité de certaines protéines 7.
Propriétaires réactifs de lyse de levure (tels que les détergents) pour l'extraction chimique des protéines de cellules de levure sont disponibles dans le commerce, mais l'efficacité de ces réactifs dans l'extraction des protéines et de leurs effets sur la caractérisation biochimique ultérieure des protéines n'est pas toujours clair 8. Homogénéisateurs haute pression, souvent appelés presses françaises, briser efficacement les cellules de levure d'abord en les soumettant à une pression élevée, puis les extruder à travers une petite ouverture dans une cellule de pression. Cette technique produit des extraits de haute qualité, mais le matériel est très coûteux et peut ne pas convenir pour de petites quantités de cellules ou de plusieurs échantillons 9. Par conséquent, une rupture mécanique des cellules de levure dans un broyeur à billes est souvent la méthode de choix pour les préparations de protéines de levure indigène 10. Cette technique implique la rupture mécanique de la paroi cellulaire de la levure avec de l'acide-wajeter des perles de verre, qui peut être réalisé avec une variété de shakers, vortexeurs ou broyeurs à billes. Notamment, cette méthode peut être utilisée pour traiter simultanément plusieurs échantillons plus petits (1 ml de cellules ou moins). De nombreuses perles différentes matrices de perles ou de perturbation de l'usine sont maintenant disponibles commercialement pour perturber presque n'importe quel genre de type de cellule en tubes de 2 ml. Compte tenu des autres techniques et de l'équipement, un broyeur à billes a l'avantage supplémentaire que la perturbation des cellules de levure se produit très rapidement, ce qui contribue à préserver modifications post-traductionnelles telles que la sumoylation, surtout quand les tampons appropriés avec la protéase et / ou inhibiteurs du protéasome sont utilisés et la température d'extraits est contrôlée.
Ce protocole porte sur l'extraction rapide, efficace et fiable de protéines endogènes et surexprimé dans des conditions douces avec l'objectif ultime de préserver la fonction des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles. Les milieux de culture, tampons de lyse cellulairecompositions et les paramètres de broyeur à billes sont optimisés pour maintenir les interactions entre protéines et des modifications post-traductionnelles telles que la sumoylation et l'ubiquitination.
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Protocol
Purification des protéines marquée à la 6XHis exprimés dans les cellules de levure en herbe dans des conditions natives
1. La croissance des cellules de levure et l'induction de l'expression des protéines
(Modification de 2)
OPTION: Utilisez croissance logarithmique des cultures de levures exprimant la protéine d'intérêt à la place des cultures galactose induits décrits ci-dessous.
- Transformer des cellules d'une souche de levure Gal + avec un plasmide codant pour un inductible par le galactose 6xHIS protéine marquée de choix. Par exemple, voir la liste des réactifs.
- Inoculer transformants dans 5 ml de milieux sélectifs appropriés (p. ex SD-uracile) contenant 2% de saccharose. Incuber à 30 ° CO / N, tournant.
- Diluer O / N culture de telle sorte que la densité optique à 600 nm mesure 0,3 (DO600 = 0,3) dans 33 ml de milieu sélectif avec 2% de saccharose. Croître à 30 ° C, agitation (Δ150 rpm).
- Lorsque la culture a atteint DO600 = 0,8-1,5, Induire l'expression de la protéine désirée par l'addition de 17 ml de YEP 3x avec 6% de galactose (recette dans le tableau 1), pour une concentration finale de 1 x YEP avec 2% de galactose. Volume de culture totale est maintenant de 50 ml. Incuber, secouer, à 30 ° C pour un 5-6 heures supplémentaires.
Remarque: le volume de culture peut être modifiée. Dans l'étape 1.3, dilué dans les deux tiers du volume final désiré. Dans l'étape 1.4, ajouter un tiers le volume final de 3x YEP / 6% de galactose. - Mesurer la DO 600 de la culture induite et centrifuger Δ150-200 OD 600 unités de cellules pendant 5 min à 5000 rpm à 4 ° C.
- Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml glacée 1x PBS avec 1x protéase cocktail d'inhibiteur et le transfert dans un tube à bouchon à vis 2 ml.
- Centrifuger les cellules pendant 1 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant.
- Enclencher cellule gel culot dans de l'azote liquide, suivie d'une lyse immédiate des cellules ou du stockage à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.
- Pour le culot de cellules congelées en provenance de l'étape précédente, ajouter 200 ul de billes de verre lavées à l'acide et 500 pi de tampon de lyse glacé (recette dans le tableau 1 ou utiliser un tampon de lyse cellulaire de choix).
- Brièvement pipette de haut en bas. Il n'est pas nécessaire de remettre en suspension entièrement le culot cellulaire. Garder les tubes sur la glace en tout temps.
Note: La fin de la pointe de la pipette peut être coupée avant le pipetage de haut en bas. - À 4 ° C, le lieu le tube (s) avec des cellules dans le broyeur à billes, d'équilibre, de verrouillage, et faire fonctionner la machine selon les instructions du fabricant.
- Exécutez le batteur perles contenant le tube (s) de 20 sec à 5,5 m / sec, puis placer sur la glace fondante pendant 1 min. Répétez 6x au total.
- Effacer les protéines extraites par centrifugation pendant 15 min à 15000 rpm à 4 ° C. OPTION: enlever les petites particules par centrifugation à travers un filtre SpinX.
- Préparer un échantillon de la cellule entière eXTRACT (WCE) pour confirmer la présence de la protéine d'intérêt par Western Blot:
- Ajouter WCE correspondant à 2 OD 600 unités de cellules (par exemple 5 ul d'extrait effacé si 200 OD 600 unités de cellules ont été récoltées) à 800 ul 20% d'acide trichloracétique (TCA). Vortex pour mélanger.
- Centrifuger pendant 2,5 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant, mais attention à conserver le culot.
- Ajouter 800 ul de 2% de TCA à la pastille et le tube vortex, suivie d'une centrifugation pendant 2,5 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant, mais attention à conserver le culot.
- Ajouter 100 ul de TCA tampon d'échantillon (recette dans le tableau 1), vortex pour dissoudre granulés. Remarque: Si la mémoire tampon de l'échantillon devient acide (vire au jaune) après addition de la pastille, ajouter des aliquotes de Δ10 pi de Tris base [1M] jusqu'à ce que l'échantillon est de nouveau bleu.
- Incuber dans un bloc chauffant ° 100 ° C pendant 2-5 min.
- Vortex again de dissoudre complètement si des restes de granulés sont toujours présents. Pastilles préparées par cette méthode sont notoirement difficiles à dissoudre complètement. Il peut prendre Δ10 min de vortex pour dissoudre complètement pellets.
- échantillon de magasin à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Enclenchez geler portions de rester WCE autorisé dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
3. Purification des lots de protéines de cellule de levure homogénats
Note: Cette méthode de purification a été optimisé pour la purification des protéines 6xHIS-clé le Co 2 + résine d'affinité métallique.
- L'équilibrage de la résine
- Pour un échantillon de WCE dégagé préparé à partir Δ20-40 OD 600 unités de cellules, ajouter 50-100 ul de résine d'affinité à un tube à centrifuger. Les protéines extraites des cellules qui n'expriment pas la protéine désirée ou une résine non-spécifique, telles que l'amylose, peuvent être utilisés en tant que commandes pour la liaison non spécifique.
- Lavez résine 5x avec 1 ml de tampon de lavage: inverti haut-over-bas jusqu'à ce que la résine est remis en suspension, puis tourner pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C. Aspirer le surnageant.
Remarque: si vous effectuez l'extraction et la purification, le même jour, l'équilibrage de la résine peut être effectuée avant l'extraction.
- La liaison aux protéines pour la purification par affinité
- Ajouter 100-200 pi de lysat clarifié (Δ20-40 OD 600 unités) à 50-100 ul billes lavées, et porter le volume total de 1 ml avec le tampon de lyse.
- Incuber avec nutation ou bascule à 4 ° C pendant 2-5 heures.
- Faites tourner pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C.
- Si l'on désire mettre un échantillon du surnageant restant pour l'analyse ultérieure des protéines non fixées. TCA précipiter comme détaillé ci-dessus pour la WCE (étape 2.6).
- Lavez résine avec protéines liées 5x avec 1 ml de tampon de lavage, suivi d'une vrille pendant 1 min à 5000 rpm à4 ° C. Conserver les échantillons froid pendant lavages.
- L'élution des protéines liées
- Ajouter 150 ul de tampon d'élution de la résine, nutation à 4 ° C pendant 5 min, rotation pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C et conserver le surnageant dans un nouveau tube. OPTION: Répéter 2x et élutions de la piscine.
- Préparer échantillon élué pour le Western Blot: Pour 25 pi de protéines éluées, ajouter 25 ul 2x dodécylsulfate de lithium (LDS) de tampon d'échantillon avec 2 pi β-mercaptoéthanol (BME) et incuber dans une ° C bloc 100 de la chaleur pendant 2 min.
Remarque: le tampon d'échantillon Laemmli 2X standard peut également être utilisé. - Enclenchez gel excès de protéine éluée dans l'azote liquide.
OPTION: protéines restantes bande de résine avec un volume égal de tampon d'échantillon LDS 2x à 65 ° C pendant 5 min, retirer les protéines LDS-élues dans un nouveau tube, puis ajouter 2 BME ul aux protéines éluées, pas à la résine. Cet ordre est d'empêcher le retrait de tous les ions ou des anticorps qui sont ConjugaTED pour les perles. - Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Western Blot et la sonde avec des anticorps appropriés pour visualiser les protéines.
- Chargez 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 unités) de chaque échantillon et 3-10 ul d'une échelle de protéines dans un gel SDS-PAGE de choix. Gels couramment utilisés pour ce protocole comprennent 4-12% Bis-Tris et 8% Tris-Glycine.
- Exécuter gel à 200 V pendant 50 min.
- Le transfert des protéines à partir de gel sur une membrane de PVDF par transfert semi-sec à 19 V pendant 20 à 30 min (recette dans le tableau 1).
- membrane de bloc dans 4% milk/1x solution saline tamponnée au Tris-Tween (TBST) pendant 1 heure à température ambiante ou O / N à 4 ° C (recette dans le tableau 1).
- Incuber la membrane avec l'anticorps primaire de la protéine à marquage épitopique d'intérêt à 4% milk/1x TBST pour 1-3 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C.
- Lavez membrane 3x pendant 5 min chacun avec TBST 1x.
- Incuber avec membrane appropriéeperoxydase de raifort secondaire (HRP) anticorps conjugué pendant 1-3 heures à température ambiante.
- Lavez membrane 3x pendant 15 min chacun dans un grand volume d'TBST 1x.
- Couvrir avec membrane substrat ECL et l'envelopper dans une pellicule transparente.
- Exposer la membrane de filmer et de développer de visualiser des protéines.
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Representative Results
Nos résultats représentatifs révèlent que le protocole d'extraction de perles coups et protéine décrite est utile pour la préparation reproductible de protéines pour une variété d'applications en aval (résumées dans le tableau 2). SDS-PAGE suivie d'une coloration de Coomassie de ACEE montrent qu'une large gamme de protéines (~ 12 à> 250 kDa) peut être reproductible extrait des cellules de levure (figure 1A). Bandes discrètes sur une gamme de poids moléculaires sont révélateurs d'extraits de protéines de haute qualité. La qualité des extraits peut être confirmée par western blot des protéines épitope tag spécifiques. Montré est un résultat représentatif de la galactose-surexprimée, V5-étiqueté SUMO ligase SIZ1 qui migre à Δ120kDa (figure 1B). En général, les protéines partiellement dégradées courraient que de multiples fragments ci-dessous le poids attendu, mais ici seulement protéine complète est observée. En outre, les adduits de haut poids moléculaire d'une protéine donnéepeut indiquer les modifications post-traductionnelles. Par exemple, nous montrons galactose-surexprimée longueur Siz1Δ440 et plein sumoylée SIZ1 (figure 1C et figure 1D). Des modifications peuvent aussi être conservées sur endogène exprimé SIZ1 (figure 1E).
Nous fournissons des résultats représentatifs que deux protéines enrichies nucléaires, Slx5 et Siz1Δ440, ont été purifiés succès de nos ACEE (Figures 2A, 2B et 2C). Notamment, nous montrons que la protéine marquée à la 6XHis (figure 2A; Slx5) peut être purifiée par affinité de nos ACEE fois dans des conditions natives et de dénaturation. En revanche, Slx5-GST (figure 2B) et Siz1Δ440-HA (figure 2C) manquent un épitope 6xHIS mais dans des conditions natives interagir encore avec la résine d'affinité métal d'une manière imidazole-sensible. Nous proposons que SIZ1, et dans une moindre mesure SLX5, sont capables de lier la résine métallique affinité via leur domaine RING métal de coordination. Alors que, à notre connaissance, ce phénomène particulier n'a pas encore été signalés, une situation similaire a été décrit dans lequel la toxine cholérique sous-unité B se lie Ni 2 + résine d'affinité d'une manière médiatisée par ses résidus histidine naturelles 11. Surtout, cette observation suggère que les protéines de la WCE sont, au moins en partie, nativement pliés.
Surtout pour l'étude de la fonction des protéines, il est important de montrer que les complexes protéiques restent intacts dans les extraits de cellules entières. Nos données représentatives révèlent que Siz1Δ440, Slx5 et PGK1 (une protéine cytosolique qui sert de témoin de charge) étaient présents dans ACEE. Siz1Δ440 a été purifiée à partir de ces extraits sur la base de sa capacité inhérente de se lier à des résines d'affinité métalliques (comparer la figure 2C). Quand Slx5 et SIZ1 ont été co-exprimé dans les cellules de levure, Slx5 niveaux dans les éluats ont été augmentés,soulevant la possibilité que Slx5 peut interagir avec SIZ1 (Figure 3).
Figure 1. Présence de protéines intactes et sumoylée en lysat de cellules de levure après l'extraction. Sauf ont été préparés extraits de cellules entières indication contraire, comme décrit dans ce protocole. Les échantillons ont été séparées par SDS-PAGE et Western blot après ont été sondés avec des anticorps soit à la HA, V5, ou balises épitope myc. Les souches de levure sont rassemblés dans le tableau 3. WB: western blot. (A) Des échantillons représentatifs de WCE TCA-précipité (YÖK de 2514 (deux voies sur la gauche) et YOK 2592 (deux voies sur la droite), (Δ0.2 OD / voie)) ont été visualisées par coloration avec un gel tache ( voir la section sur les matières). (B) Lane 1 & 2: homogénats de la souche de levure YOK 2510 et YOK 2512 Siz1-V5/6xHIS galactose-surexprimés contenant. Notez l'absence de fragments de protéines partiellement dégradées. Pour des raisons inconnues, cet échantillon ne révèle pas adduits sumoylée lorsque sondé avec un anticorps anti-V5. Cependant, sumoylation peut être détecté avec un anti SUMO (anti-SMT3) anticorps comme indiqué dans la Fig. 1D. (C) Lane 3 & 4: broyats de souche de levure YOK 2508 et 2509 YOK contenant du galactose-surexprimée Siz1Δ440-HA. (D) Lane 5, 6 & 7: Siz1-V5/6xHIS galactose-surexprimés a été purifié par Co 2 + résine d'affinité métal, élue avec 200 mM imidazole, et sondé avec anti-V5 (piste 5), anti-SMT3 (voie 6). Lane 7 est un Reprobe de la piste 6 avec l'anticorps anti-V5. et montre à la fois SIZ1 et sumoylée SIZ1 adduits (SMT3 n). (E) Lane 8: JD52 cellules de type sauvage contenant des niveaux endogènes de myc-étiqueté SIZ1 (YÖK 2397). Lysat clarifié préparé en utilisant un tampon de lyse de mammifère. Lane 9: Lyassouvir surnageant après une heure d'incubation avec 2 anti-V5 agarose. Notez adduits sumoylée de SIZ1. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Purification de surexprimée RING-domaine contenant des protéines avec TALON résine d'affinité métal. Induction au galactose, extraction et purification des protéines ont été réalisées comme décrit dans le présent protocole. La purification a été réalisée dans des conditions natives et des conditions dénaturantes, pour lequel le chlorhydrate de guanidine a été ajouté à l'échantillon à 6 M avant l'incubation avec de la résine. Lysat a été tourné avec la résine et de contrôle amylose (A) et Talon Métal résine d'affinité (T). Les protéines ont été élues avec 200 mM imidazole dans le tampon d'élution. Les échantillons ont été séparées par SDS-PAGE et Western effacés(WB) avec un anticorps dirigé contre l'étiquette de l'épitope approprié. A) galactose induite Slx5-V5/6xHIS (YÖK 2096) a été purifiée avec de la résine TALON sous deux conditions natives et la dénaturation B) galactose induite Slx5-GST (YÖK 2071) était purifiée avec de la résine Talon native, mais pas des conditions de dénaturation. Vraisemblablement, le domaine RING coordination métallique interagit avec de la résine TALON quand bien plié. C) galactose induite Siz1Δ440-HA (YÖK 2353) a également été purifié avec de la résine TALON en natif, mais pas des conditions de dénaturation. Ces protéines ne contiennent pas de balises 6xHis, mais chacune ne contienne un domaine RING, qui coordonne naturellement des ions Zn 2 + et peut conférer la capacité de se lier intrinsèquement TALON résine d'affinité métal lorsqu'il est correctement plié. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Co-purification de protéines surexprimées Talon résine d'affinité métal.
Slx5-TPS et Siz1Δ440-HA ont été exprimées par eux-mêmes ou en combinaison (+ / -) dans JD52 cellules (souches yoks 2353, 2402, 2224 respectivement). Les protéines ont été extraites comme décrit (WCE) et les lysats ont été nutation avec TALON métal Affinity résine (voir Figure 2). Les protéines ont été élues de la résine avec 200 mM imidazole dans le tampon d'élution (Eluat) et préparés dans un tampon échantillon LDS. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE et Western blot après ont été sondés avec un anticorps dirigé contre l'étiquette HA ou le tag TPS, le cas échéant. Une charge égale de protéines est confirmée par PGK comme un contrôle de chargement. Notez que Slx5 purification est renforcée en présence de Siz1Δ440. Cliquez ici pour agrandir l'image .
| Solution | Composants | Commentaires |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g d'extrait de levure 60 g de peptone dans 700 ml de trou DDH 2 O | Mélanger les ingrédients et stériliser à l'autoclave pour stériliser. Ajouter le filtre galactose stérilisé à 6% de portions individuelles de 3x YEP prête à l'emploi |
| TCA tampon d'échantillon | 15% de glycérol 80 mM Tris Base (non-pH'd) 3,5% SDS bromophénol bleu "au goût." Amener le volume à 25 ml avec le trou DDH 2 O | Avant d'utiliser: ajouter 40 ul de β-mercaptoéthanol (BME) à 1 ml TCA tampon d'échantillon |
| Tampon de lavage | HEPES 50 mM pH 7,3 NaCl 200 mM, 1% de Triton X-100 20 mM imidazole | Imidazole utilisé pour Ni 2 + ou Co 2 + purification d'affinité de métal seulement |
| tampon de lyse | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% de Triton X-100 10 mM imidazole 1x inhibiteur de la protéase cocktail Ajouter inhibiteur de la protéase cocktail immédiatement avant utilisation. Imidazole utilisé pour Ni 2 + ou Co 2 + purification d'affinité métal seulement. OPTION: 25 mM de N-éthylmaléimide (inhibiteur de la protéase de la cystéine, de préserver sumoylation), 1 mM d'orthovanadate de sodium (inhibiteur de la tyrosine phosphatase de protéine), et / ou d'autres inhibiteurs de la protéase déterminées empiriquement en fonction de la zone spécifique de l'étude | |
| tampon d'élution | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 200 mM imidazole | Imidazole utilisé pour concourir pour les sites de liaison histidine en Ni 2 + ou Co 2 + purification d'affinité de métal seulement. D'autres méthodes d'élution peuvent être utilisés pour les résines d'affinité différents. |
| Semi tampon de transfert à sec (10x) | Dans 1 L de trou DDH 2 O: 58 g 29,3 g Tris Glycine 18,75 ml 20% SDS | Pour faire 1x Semi tampon de transfert sec: mélanger 100 ml 10x tampon de transfert sec Semi avec 200 ml de méthanol et 700 ml trou DDH 2 Os |
| Tris Buffered Saline (TBS, 10x) | 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 150 ml de NaCl 5 M 300 ml trou DDH 2 O | Pour faire 1x TBST, mélanger 100 ml 10x TBS avec 900 ml trou DDH 2 O et ajouter 1 ml de Tween-20 |
Tableau 1. Solutions et tampons.
| Demande | Quantité de cellules | Prochaines étapes |
|---|---|---|
| lyse cellulaire | 150-200 ODS récolté culot cellulaire | Perle battre comme décrit dans l'étape 2 |
| Western Blot de WCE | 2 DO de cellules lysées préparés | Préparez-vous à Western blot par précipitation au TCA comme décrit dans l'étape 2.6. Δ0.3 unités de DO (Δ15 ul) courent sur du gel |
| Purification par affinité et / ou déroulant | 30 DO de cellules lysées | Bind, sont élues, et préparer des protéines comme décrit dans les étapes 3.2 et 3.3 |
| Environ 1-2 ODS (s'il est préparé comme dans l'étape 3.3) | Western blot comme décrit dans l'étape 3.4 |
Tableau 2. Résumé des demandes pour ce protocole.
| Nom | Génotype pertinent ou Strain Parent | Le plasmide (s) ou d'insertion de la cassette | Référence |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATa ura3-52 his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ63 lys2-801 | Dohmen et al. 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems levure TPS collection YSC4515-202484078) | cette étude |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | cette étude |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-TPS-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems levure perception de la TPS YSC4515-202484078); pRS425 (BOK 343) | cette étude |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | cette étude |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogène tagué) | cette étude |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems levure perception de la TPS YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | cette étude |
| YOK 2501 | MHY3765, alpha type sexuel, ura3-52, lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX | Xie et al. 2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: kanMX (YÖK 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | cette étude |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YÖK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems levure perception de la TPS YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | cette étude |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YÖK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898); pRS425 (BOK 343) | cette étude |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YÖK 2501) | Slx5-protéine A (BOK 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | cette étude |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YÖK 2397) | msn5Δ :: Phygromycine | cette étude |
| YOK 2592 | msn5Δ :: Phygromycine dans JD52 (YÖK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | cette étude |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | cette étude |
Tableau 3. Les souches de levure.
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Discussion
Ce protocole met l'accent sur la préparation du intact, indigène, et modifications post-traductionnelles des protéines à partir de cellules de levure en herbe pour les applications en aval. Avant de tenter ce protocole, il est essentiel de déterminer si la protéine d'intérêt peut être facilement détectée dans des extraits protéiques préparés dans des conditions dénaturantes 12. Si des anticorps polyclonaux sont pas disponibles, il peut être avantageux d'épitope tag la protéine d'intérêt de sorte que la protéine de fusion peut être détectée sur Western blot. Dans le présent protocole, nous avons marqué SIZ1 avec le HA, 6xHIS-V5, ou des étiquettes d'épitope myc et cette stratégie nous a permis d'identifier clairement la protéine et ses formes sumoylée sur Western blot (Figure 1). Nous avons eu détecter GFP protéines marquées moins de succès, peut-être parce que de haute affinité des anticorps anti-GFP sont difficiles à obtenir (données non présentées). Une autre question essentielle concerne le niveau d'expression de la protéine d'intérêt. Les niveaux de personneprotéines varient largement dans les cellules de levure en herbe 4 et certaines protéines doivent être surexprimé afin qu'ils puissent être détectés et / ou purifiés. Vecteurs inductible par le galactose sont disponibles pour l'expression à haut niveau du gène de levure d'intérêt 2. Dans le cas de SIZ1, nous avons pu détecter la longueur ou de la protéine tronquée lorsqu'elle est exprimée à partir ORF des chromosomes marqués ou lorsqu'elle est exprimée sous le contrôle du promoteur fort galactose inductible d'un plasmide (figure 1). L'utilisation de troncatures peuvent être utiles dans / analyses de structure ou de fonction lorsque la molécule de longueur totale est difficile d'exprimer ou instable. Alors que la surexpression galactose induite améliore la détection et purification des protéines, il a des limites évidentes lorsque l'on étudie la pertinence physiologique de cycle cellulaire et les interactions potentielles modifications post-traductionnelles spécifiques. Par exemple, sumoylation de SIZ1 est le plus répandu au G2 / M stade du cycle cellulaire, et des modifications ou des interactions dela protéine surexprimée peut être confirmée par d'autres moyens expérimentaux. Enfin, l'ajout d'une protéase spécifique, la phosphatase et / ou inhibiteurs du protéasome est un facteur important pour le succès de ce protocole. En général, les meilleurs résultats sont obtenus en ajoutant ces inhibiteurs avant que les cellules sont congelées et dans l'extraction et la dilution des tampons. L'ajout d'EDTA, un chélateur d'ions métalliques parfois présents dans les cocktails d'inhibiteurs de la protéase, n'est pas souhaitable car elle peut interférer avec purifications d'affinité des métaux postérieurs.
Des extraits protéiques obtenus par perle de battre sont bien adaptés comme matière première pour la purification des protéines individuelles. Plus précisément, nous montrons que Slx5 surexprimés portant une étiquette d'affinité 6xHIS peuvent être purifiés à partir ACEE utilisant une résine d'affinité métallique (figure 2A). Pour conserver les modifications post-traductionnelles et de réduire la dégradation des protéines, les protéines marquée à la 6XHis sont souvent purifiés dans des conditions dénaturantes5. Cependant, il ya des avantages distincts associés à la purification des protéines dans des conditions natives. Par exemple, ces protéines peuvent co-purifient avec les partenaires de liaison ou peuvent être utilisés dans la suite des essais in vitro 13,14. Dans le cas de SIZ1 et Slx5 nous par hasard déterminé que les deux protéines présentent une affinité intrinsèque de la résine d'affinité métallique, indépendante de la balise 6xHIS, et cette observation nous a suggéré que les deux protéines supposées confirmations indigènes. Malheureusement, l'activité de pliage et biologique appropriée de protéines purifiées doit être déterminée au cas par cas à cas. À cette fin, la mise en place d'affinité et épitope balises soit à l'extrémité amino ou carboxy, peut grandement affecter l'activité ou la stabilité de la protéine de fusion et est un facteur important dans la planification d'une stratégie de purification des protéines.
Les travaux à venir se concentrera sur la façon d'améliorer modifications post-traductionnelles au cours de purification, pour examenple par l'utilisation de souches déficientes en protéases de levure, des inhibiteurs de protéases différentes, ou d'autres marqueurs d'affinité. Nous prévoyons que ce protocole dans sa forme actuelle ou tampon optimisé est applicable pour l'extraction, la purification et après étude évolutive de nombreuses protéines de levure en herbe.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions tous les membres du laboratoire Kerscher pour leur soutien. Nous remercions Mark Hochstrasser pour la souche de levure MHY3765. Ce travail a été soutenu par la NSF subvention 1051970 (OK) et Hughes Medical Institute cycle de subvention de voyage Howard et Monroe Scholars Programme de subventions (pour ES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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