Summary
La preparazione di estratti cellulari di lievito di alta qualità è un primo passo necessario per l'analisi delle singole proteine o intere proteomi. Qui si descrive un protocollo veloce, efficiente, e affidabile omogeneizzazione per le cellule di lievito in erba che è stato ottimizzato per preservare le funzioni della proteina, interazioni e modificazioni post-traduzionali.
Abstract
Omogeneizzazione di battitura tallone è un modo veloce ed efficace per liberare il DNA, RNA, proteine e metaboliti da cellule di lievito in erba, che sono notoriamente difficile da interrompere. Qui si descrive l'uso di un mulino omogeneizzatore tallone per l'estrazione delle proteine nei buffer ottimizzati per mantenere le funzioni, interazioni e modificazioni post-traduzionali di proteine. Cellule in crescita logaritmica che esprimono la proteina di interesse sono coltivate in un mezzo di crescita liquide di scelta. I terreni di coltura possono essere completate con i reagenti per indurre l'espressione della proteina da promotori inducibili (ad esempio galattosio), sincronizzare fase del ciclo cellulare (ad es nocodazole), o inibire la funzione del proteasoma (es. MG132). Le cellule sono poi pellettato e risospese in un tampone adatto contenente proteasi e / o inibitori di fosfatasi e siano evase immediatamente o congelati in azoto liquido per uso successivo. Omogeneizzazione si ottiene sei cicli di 20 sec bead-battito (5,5 m / sec), ciascuno seguito di un minuto incubazione in ghiaccio. L'omogenato risultante è eliminato per centrifugazione e piccole particelle può essere rimosso per filtrazione. L'estratto cellulare e dovute eliminato (WCE) viene precipitato con 20% TCA per l'analisi diretta delle proteine totali mediante SDS-PAGE e Western blotting. Estratti sono adatti per affinità purificazione di proteine specifiche, la rilevazione di modificazioni post-traduzionali, o l'analisi delle proteine co-purificazione anche. Come è il caso per la maggior parte dei protocolli di purificazione delle proteine, alcuni enzimi e proteine possono richiedere condizioni uniche o composizioni tampone per la loro purificazione e altri possono essere instabili o insolubili nelle condizioni sopra indicate. In quest'ultimo caso, il protocollo presentato può fornire un punto di partenza utile per determinare empiricamente la migliore strategia tallone-battitura per estrazione e purificazione di proteine. Mostriamo l'estrazione e purificazione di un epitopo-tag SUMO E3 ligasi, SIZ1, un ciclo cellulareregolato proteina che diventa sia sumoylated e fosforilato, nonché un SUMO-mirata ubiquitina ligasi subunità, Slx5.
Introduction
L'incredibile potenza di lievito genetica è leggendaria, ma la preparazione e l'analisi delle proteine native di lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, è spesso pieno di problemi. Quest'ultimo è dovuto al notevole resistenza meccanica e di elasticità della cellula di lievito parete 1. Mezzi diversi sono stati descritti per la enzimatica, chimiche, meccaniche, e la pressione a base di disgregazione di cellule di lievito avere estratto proteico cellula intera 2-6. Queste tecniche variano ampiamente nella loro efficacia di cedere, estratti di proteine native cellula-rappresentative che possono essere utilizzati per le successive analisi o fasi di purificazione. Ad esempio, la parete cellulare del lievito può essere rimosso con enzimi litici (es. zymolyase) e risultanti spheroblasts possono essere disturbate da taglio, detergenti, o lisi osmotica per rilasciare proteine. Questo approccio è stato impiegato con successo come punto di partenza per molte frazionamenti subcellulari ma richiede lunghe fasi di incubazioneche non sono compatibili con la stabilità di alcune proteine 7.
Reagenti di lisi del lievito di proprietà (come i detersivi) per l'estrazione chimica delle proteine di cellule di lievito sono disponibili in commercio, ma l'efficacia di questi reagenti in estrazione di proteine e il loro effetto sulla successiva caratterizzazione biochimica delle proteine non è sempre chiara 8. Omogeneizzatori ad alta pressione, spesso definito come presse francesi, effettivamente rompere le cellule di lievito per primo sottoponendoli ad alta pressione e poi l'estrusione attraverso una piccola apertura in una cella di pressione. Questa tecnica produce estratti di alta qualità, ma l'attrezzatura è molto costosa e può non essere adatto per piccole quantità di cellule o di campioni multipli 9. Pertanto, distruzione meccanica delle cellule di lievito in un mulino a sfere è spesso il metodo di scelta per native lievito preparazioni proteiche 10. Questa tecnica comporta distruzione meccanica della parete cellulare del lievito con acido-wagettare perle di vetro, che possono essere condotti con una varietà di agitatori, vortex o mulini tallone. In particolare, questo metodo può essere utilizzato per elaborare simultaneamente più piccoli campioni (1 ml di cellule o meno). Molti perline diversi o perline mill matrici disagi sono ora disponibili in commercio per distruggere quasi ogni tipo di tipo di cellule in 2 ml provette. Considerando le altre tecniche ed apparecchiature, un mulino branello ha il vantaggio aggiunto che la rottura delle cellule di lievito verifica molto veloce, che aiuta a preservare modificazioni post-traduzionali, come sumoylation, specialmente quando i buffer appropriati con proteasi e / o inibitori del proteasoma sono utilizzati e la temperatura di estratti è controllata.
Questo protocollo si concentra sul veloce, efficace, affidabile e di estrazione di proteine endogene e over-espressa in condizioni di dolci con il fine ultimo di preservare la funzione delle proteine, interazioni e modificazioni post-traduzionali. Mezzi di crescita, buffer di lisi cellularecomposizioni e le impostazioni mulino tallone sono ottimizzati per mantenere interazioni proteina e modificazioni post-traduzionali, come sumoylation e ubiquitylation.
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Protocol
Purificazione di proteine 6xHis-tagged espressi in cellule di lievito in erba in condizioni native
1. La crescita di cellule di lievito e l'induzione di proteine Espressione
(Modificato da 2)
OPTIONAL: utilizzare logaritmicamente crescenti colture di lievito esprimenti proteina di interesse, invece delle culture galattosio indotte descritte di seguito.
- Trasformare cellule di un ceppo Gal + lievito con un plasmide codificante una proteina di galattosio-inducibile di scelta 6xHis-tag. Ad esempio, vedere elenco reagenti.
- Inoculare trasformanti in 5 ml di appropriati mezzi selettivi (ad esempio, SD-uracile) contenente 2% di saccarosio. Incubare a 30 ° CO / N, rotante.
- Diluire coltura O / N in modo che la densità ottica a 600 nm misura 0,3 (OD 600 = 0.3) in 33 ml di terreno selettivo con il 2% di saccarosio. Crescere a 30 ° C, agitando (Δ150 rpm).
- Quando la coltura ha raggiunto OD 600 = 0.8-1.5, Indurre l'espressione della proteina desiderata aggiungendo 17 ml di 3x YEP con 6% di galattosio (Ricetta in tabella 1), per una concentrazione finale di 1x YEP con 2% di galattosio. Volume di cultura totale ora è 50 ml. Incubare, agitazione, a 30 ° C per altre 5-6 ore.
Nota: il volume di coltura può essere variata. Nel passo 1.3, diluito in due terzi del volume finale desiderato. Nel passo 1.4, aggiungere un terzo del volume finale di 3x YEP / 6% galattosio. - Misurare il diametro esterno 600 della coltura indotta e centrifugare Δ150-200 OD 600 unità di cellule per 5 min a 5000 rpm a 4 ° C.
- Risospendere il pellet di cellule con 1 ml di ghiacciata PBS 1x 1x con inibitore della proteasi cocktail e trasferimento ad un 2 ml tappo a vite del tubo.
- Centrifugare le cellule per 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante.
- Snap freeze pellet di cellule in azoto liquido, seguita da lisi immediato cella o stoccaggio a -80 ° C fino all'utilizzo.
- Alla cella pellet congelato dal passaggio precedente, aggiungere 200 ml di perline di vetro lavata con acido e 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciato (Ricetta nella Tabella 1 o utilizzare tampone di lisi cellulare di scelta).
- Brevemente pipetta su e giù. Non è richiesto per risospendere completamente il pellet cellulare. Tenere i tubi in ghiaccio in ogni momento.
Nota: La fine del puntale può essere tagliato prima di pipettare su e giù. - A 4 ° C, posto il tubo (s) con le cellule nel mulino tallone, l'equilibrio, la serratura, ed eseguire la macchina secondo le indicazioni del produttore.
- Esegui il battitore tallone contenente il tubo (s) per 20 sec a 5,5 m / sec, quindi immettere sul ghiaccio fangosa per 1 min. Ripetere 6x in totale.
- Cancellare le proteine estratte mediante centrifugazione per 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPTIONAL: rimuovere piccole particelle mediante centrifugazione attraverso un filtro Spinx.
- Preparare un campione di cellula intera eXtract (WCE) per confermare la presenza della proteina di interesse mediante Western Blot:
- Aggiungere WCE corrispondente con 2 OD 600 unità di cellule (ad esempio 5 ml di estratto eliminato se OD 200 600 unità di cellule sono state raccolte) a 800 microlitri di acido tricloroacetico al 20% (TCA). Vortex per mescolare.
- Centrifugare per 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante, ma attenzione a conservare il pellet.
- Aggiungere 800 ml di 2% TCA al pellet vortice e il tubo, seguita da centrifugazione per 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante, ma attenzione a conservare il pellet.
- Aggiungere 100 ml di TCA Sample Buffer (ricetta in tabella 1), vortice di sciogliere pellet. Nota: Se il tampone diventa acido (diventa giallo) dopo l'aggiunta al pellet, aggiungere aliquote di Δ10 microlitri di base Tris [1M] fino a quando il campione è di nuovo blu.
- Incubare in un blocco di calore 100 ° C per 2-5 min.
- Vortice again per sciogliere completamente se resti di pellet sono ancora presenti. Pellets preparati da questo metodo sono notoriamente difficili da sciogliere completamente. Si può prendere Δ10 min di vortex per sciogliere completamente pellet.
- Campione Conservare a -80 ° C fino a nuovo uso.
- Snap congelare aliquote di rimanere WCE eliminato in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino a nuovo uso.
3. Purificazione Batch di proteine da lievito omogenati cellulari
Nota: Questo metodo di purificazione è stato ottimizzato per la purificazione di proteine 6xHis-targhetta su Co 2 + metallo resina di affinità.
- Resina Equilibration
- Per un campione di WCE eliminato preparato da Δ20-40 OD 600 unità di cellule, aggiungere 50-100 ml di resina di affinità in una provetta da microcentrifuga. Proteine estratte da cellule che non esprimono la proteina desiderata o una resina non specifico, come amilosio, possono essere utilizzati come controllos per il legame non specifico.
- Lavare resina 5x con 1 ml di tampone di lavaggio: capovolgere top-over-basso fino a quando la resina viene risospeso, e poi girare per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirare il surnatante.
Nota: se si esegue l'estrazione e purificazione nello stesso giorno, equilibramento resina può essere eseguita prima dell'estrazione.
- Binding Protein per Affinity Purification
- Aggiungere 100-200 ml di lisato eliminato (Δ20-40 OD 600 unità) di 50-100 microlitri perline lavati, e portare il volume totale di 1 ml di tampone di lisi.
- Incubare con nutazione o dondolo a 4 ° C per 2-5 ore.
- Spin per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C.
- Se desiderato, salvare un campione del surnatante rimanente per la successiva analisi delle proteine non legate. TCA precipitano come sopra per la WCE (passo 2,6).
- Lavare resina con proteine legate 5x con 1 ml di tampone di lavaggio, seguiti da una centrifuga per 1 min a 5.000 giri al4 ° C. Conservare i campioni a freddo durante i lavaggi.
- Eluizione di proteine legate
- Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione della resina, nutate a 4 ° C per 5 min, centrifugare per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C e salvare il surnatante in una nuova provetta. OPTIONAL: repeat 2X e eluizioni piscina.
- Preparare campione eluito per Western Blot: A 25 ml di proteine eluite, aggiungere 25 ml di litio 2x dodecil solfato (LDS) tampone campione con 2 ml β-mercaptoetanolo (BME) e incubare in un blocco di calore ° C 100 per 2 min.
Nota: 2X tampone campione Laemmli standard può anche essere usato. - Snap freeze eccesso di proteine eluite in azoto liquido.
OPTIONAL: strip rimanenti proteine da resina con un volume uguale di tampone campione 2x LDS a 65 ° C per 5 min, rimuovono le proteine LDS-eluite in una nuova provetta, quindi aggiungere 2 microlitri BME alle proteine eluite, non alla resina. Questo scopo è quello di impedire la rimozione di eventuali ioni o anticorpi Conjugated ai talloni. - Conservare i campioni a -80 ° C fino a nuovo uso.
- Western Blot e sonda con anticorpi adeguati per visualizzare le proteine.
- Caricare 10-20 microlitri (Δ1-3 OD 600 unità) di ciascun campione e 3-10 microlitri di una scala proteina in un gel SDS-PAGE di scelta. Gel ordinariamente utilizzato questo protocollo sono 4-12% Bis-Tris e l'8% Tris-Glycine.
- Esegui gel a 200 V per 50 min.
- Trasferire le proteine da gel a una membrana PVDF mediante trasferimento a semi-secco a 19 V per 20-30 min (ricetta nella Tabella 1).
- Membrana Block nel 4% milk/1x soluzione salina tamponata Tris-Tween (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C (ricetta nella Tabella 1).
- Incubare la membrana con l'anticorpo primario alla proteina-tag epitopo di interesse 4% milk/1x TBST per 1-3 ore a RT o O / N a 4 ° C.
- Lavare membrana 3x per 5 minuti ciascuno con TBST 1x.
- Incubare la membrana con adeguatasecondario perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpo per 1-3 ore a temperatura ambiente.
- Lavare membrana 3x per 15 minuti ciascuno in un grande volume di TBST 1x.
- Coprire membrana con substrato ECL e avvolgere in pellicola trasparente.
- Esporre membrana al cinema e lo sviluppo di visualizzare le proteine.
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Representative Results
Nostri risultati rappresentativi rivelano che il protocollo di estrazione del tallone-battitura e proteina descritta è utile per la preparazione riproducibile di proteine per una varietà di applicazioni a valle (riassunti nella tabella 2). SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie di WCEs mostrano che una vasta gamma di proteine (~ 12 a> 250 kDa) può essere riproducibile estratto da cellule di lievito (Figura 1A). Bande discrete su una gamma di pesi molecolari sono indicativi di estratti proteici di alta qualità. La qualità di estratti può essere confermata mediante western blotting per proteine epitopo-tag specifici. Indicato è un risultato rappresentativo per il galattosio-overexpressed, V5-tag SUMO ligasi SIZ1 che migra a Δ120kDa (Figura 1B). In generale, le proteine parzialmente degradate correvano come frammenti multipli sotto il peso previsto, ma si osserva qui solo proteine lunghezza. Inoltre, l'alta addotti peso molecolare di una data proteinapossono indicare modificazioni post-traduzionali. Per esempio, mostriamo galattosio-iperespresso sumoylated lunghezza Siz1Δ440 e pieno SIZ1 (Figura 1C e 1D Fig.). Le modifiche possono anche essere conservati in modo endogeno espresso SIZ1 (Figura 1E).
Forniamo risultati rappresentativi che due proteine arricchiti nucleari, Slx5 e Siz1Δ440, sono stati purificati con successo dai nostri WCEs (figure 2A, 2B e 2C). In particolare, si dimostra che una proteina 6xHis-tagged (Figura 2A; Slx5) può essere affinità purificato dai nostri WCEs sia in condizioni native e denaturanti. In contrasto, Slx5-GST (Figura 2B) e Siz1Δ440-HA (Figura 2C) mancano di un epitopo 6xHis ma in condizioni native ancora interagiscono con la resina metallo-affinità in maniera imidazolo-sensibile. Proponiamo che SIZ1, e in misura minore SLX5, sono in grado di legare la resina metallo-affinità con il loro metal-coordinamento dominio ANELLO. Mentre, a nostra conoscenza, questo particolare fenomeno non è ancora stata riportata, una situazione simile è stato descritto in cui il colera subunità B della tossina si lega Ni 2 + resina di affinità in modo mediato dai suoi residui di istidina naturali 11. Importante, questa osservazione suggerisce che le proteine nel WCE sono, almeno in parte, nativamente piegati.
Specialmente per lo studio della funzione della proteina è importante mostrare che i complessi proteici rimangono intatti in estratti di cellule intere. I nostri dati rappresentativi rivelano che Siz1Δ440, Slx5, e PGK1 (una proteina citoplasmatica che funge da controllo del carico) erano presenti in WCEs. Siz1Δ440 stato purificato da questi estratti in base alla sua intrinseca capacità di legarsi alle resine di affinità metallici (confrontare Figura 2C). Quando Slx5 e SIZ1 sono stati co-espressi in cellule di lievito, Slx5 livelli negli eluati sono stati aumentati,sollevando la possibilità che Slx5 possono interagire con SIZ1 (Figura 3).
Figura 1. Presenza di proteine intatte e sumoylated nel lisato cellulare del lievito dopo estrazione. Salvo estratti cellulari totali altrimenti specificato sono stati preparati come descritto in questo protocollo. I campioni sono stati separati mediante SDS-PAGE e Western blotting dopo sono stati sondati con anticorpi sia al HA, V5, o epitopi myc. Ceppi di lievito sono compilate nella tabella 3. WB: Western Blot. (A) i campioni rappresentativi di WCE TCA-decantato (da YOK 2514 (due corsie a sinistra) e YOK 2592 (due corsie a destra), (Δ0.2 OD / corsia)) sono stati visualizzati mediante colorazione con un gel macchia ( vedere la sezione Materiali). (B) Corsia 1 & 2: omogenati di ceppo di lievito YOK 2510 e YOK 2512 contenenti Siz1-V5/6xHIS galattosio-sovraespressione. Notare l'assenza di frammenti proteici parzialmente degradata. Per ragioni sconosciute, questo particolare campione non rivela addotti sumoylated quando sondato con un anticorpo anti-V5. Tuttavia, sumolazione può essere rilevato con un anti SUMO (anti-SMT3) anticorpo come mostrato in fig. 1D. (C) Corsia 3 & 4: omogenati di ceppo di lievito YOK 2508 e YOK 2509 contenenti galattosio-iperespresso Siz1Δ440-HA. (D) Corsia 5, 6 e 7: Siz1-V5/6xHIS galattosio-sovraespressione è stato purificato utilizzando Co 2 + metallo resina di affinità, eluita con 200 mM imidazolo, e sondato con anti-V5 (corsia 5), anti-SMT3 (corsia 6). Corsia 7 è una reprobe di corsia 6 con l'anticorpo anti-V5. e mostra sia SIZ1 e sumoylated SIZ1 addotti (SMT3 n). (E) Corsia 8: JD52 tipo selvatico cellule contenenti i livelli endogeni di myc-tag SIZ1 (YOK 2397). Azzerato lisato preparato utilizzando un tampone di lisi dei mammiferi. Corsia 9: Lysaziare surnatante dopo una incubazione di 2 ore con l'anti-V5 agarosio. Nota addotti sumoylated di SIZ1. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Purificazione di over-espressa RING-dominio contenente proteine con TALON metallo resina di affinità. Induzione galattosio, estrazione e purificazione di proteine sono state eseguite come descritto in questo protocollo. La purificazione è stata eseguita in condizioni native e condizioni di denaturazione, per cui guanidinio cloridrato è stato aggiunto al campione di 6 M prima dell'incubazione con resina. Lisato è stato ruotato con sia resina controllo amilosio (A) e resina TALON metallo Affinity (T). Le proteine sono state eluite con 200 mM di imidazolo in tampone di eluizione. I campioni sono stati separati mediante SDS-PAGE e occidentale tamponate(WB) con un anticorpo per l'epitopo appropriata. A) galattosio indotta Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) è stato purificato con resina TALON sia in condizioni native e denaturanti B) galattosio indotta Slx5-GST (YOK 2071) è stato purificato con resina TALON in nativo, ma non denaturazione condizioni. Presumibilmente, il coordinamento dominio anello di metallo interagisce con resina TALON se correttamente piegato. C) galattosio indotta Siz1Δ440-HA (YOK 2353) è stato purificato con resina TALON in nativo, ma non denaturazione condizioni. Queste proteine non contengono tag 6xHis, ma ciascuno contiene un dominio di anello, che coordina naturalmente Zn 2 + ioni e possono conferire la capacità di legare intrinsecamente TALON metallo resina di affinità se correttamente piegato. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Co-purificazione di proteine over-espresso su TALON metallo resina di affinità.
Slx5-GST e Siz1Δ440-HA sono stati espressi da soli o in combinazione (+ / -) in JD52 cellule (ceppi yoks 2353, 2402, 2224, rispettivamente). Le proteine sono state estratte come descritto (WCE) e lisati sono stati nutated con TALON metallo resina di affinità (vedi Figura 2). Le proteine sono state eluite dalla resina con 200 mM di imidazolo in tampone di eluizione (Eluato) e preparate in tampone campione LDS. Proteine sono state separate mediante SDS-PAGE e Western blotting dopo sono stati sondati con un anticorpo al tag HA o il tag GST come appropriato. Pari carico di proteine è confermata con PGK come controllo di caricamento. Si noti che Slx5 purificazione è rafforzata in presenza di Siz1Δ440. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
| Soluzione | Componenti | Commenti |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g Estratto di lievito 60 g Peptone in 700 ml di DDH 2 O | Mescolare gli ingredienti e sterilizzare in autoclave per la sterilizzazione. Aggiungi filtro galattosio sterilizzata al 6% per le singole aliquote di 3x YEP quando è pronto per l'uso |
| TCA Sample Buffer | 15% glicerolo 80 mM Tris Base (non-pH'd) 3,5% SDS bromofenolo blu "di gusto". Portare il volume a 25 ml con DDH 2 O | Prima dell'uso: aggiungere 40 ml di β-mercaptoetanolo (BME) a 1 ml TCA Sample Buffer |
| Tampone di lavaggio | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 20 mM imidazolo | Imidazolo utilizzato per Ni 2 + o Co 2 + solo metallo affinità purificazione |
| Lysis Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 10 mM imidazolo 1x cocktail inibitore di proteasi Aggiungere cocktail inibitore di proteasi immediatamente prima dell'uso. Imidazolo utilizzato per Ni 2 + solo o Co 2 + metallo affinità purificazione. OPTIONAL: 25 mm N-ethylmaleimide (inibitore della proteasi cisteina, per preservare sumoylation), 1 mM sodio ortovanadato (inibitore della proteina tirosina fosfatasi), e / o di altri inibitori della proteasi empiricamente determinato sulla base di specifica area di studio | |
| Tampone di eluizione | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 200 mM imidazolo | Imidazolo utilizzato per competere per i siti di legame istidina + o Co 2 + solo metallo purificazione di affinità in Ni 2. Altri metodi di eluizione possono essere utilizzati per le resine di affinità differenti. |
| Semi buffer di trasferimento a secco (10x) | In 1 L di DDH 2 O: 58 g Tris 29.3 g Glicina 18,75 ml 20% SDS | Per rendere 1x semi secco del buffer di trasferimento: mescolare 100 ml 10x Semi buffer di trasferimento a secco con 200 ml di metanolo e 700 ml di DDH 2 O |
| Tris Buffered Saline (TBS, 10x) | 50 ml di 1 M Tris-HCl, pH 8,0 150 ml 5 M NaCl 300 ml DDH 2 O | Per rendere 1x TBST, mescolare 100 ml 10x TBS con 900 ml di DDH 2 O e aggiungere 1 ml di Tween-20 |
Tabella 1. Soluzioni e tamponi.
| Applicazione | Quantità di cellule | Passi successivi |
|---|---|---|
| Cell Lysis | 150-200 OD del raccolto pellet | Perlina battendo come descritto al punto 2 |
| Western Blot di WCE | 2 OD di cellule lisate preparati | Preparare per Western Blot per precipitazione TCA come descritto nella fase 2.6. Δ0.3 unità OD (Δ15 ml) si esauriscono in gel |
| Purificazione di affinità e / o Pulldown | 30 OD di cellule lisate | Bind, eluire, e preparare le proteine come descritto ai punti 3.2 e 3.3 |
| Circa 1-2 OD (se preparato come al punto 3.3) | Western blot come descritto al punto 3.4 |
Tabella 2. Riepilogo delle domande di questo protocollo.
| Nome | Genotipo Rilevante o ceppo di origine | Plasmide (s) o l'inserimento cassetta | Riferimento |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | Mata URA3-52 his3-Δ200 LEU2-3, 112 TRP1-Δ63 lys2-801 | Dohmen et al., 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems raccolta GST lievito YSC4515-202.484.078) | questo studio |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | questo studio |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems raccolta lievito GST YSC4515-202.484.078); pRS425 (BOK 343) | questo studio |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | questo studio |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogenamente tag) | questo studio |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems raccolta lievito GST YSC4515-202.484.078); pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | questo studio |
| YOK 2501 | MHY3765, alfa tipo di accoppiamento, URA3-52, lys2-801, TRP1-Δ63, his3-Δ200, LEU2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX | Xie et al., 2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | questo studio |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems raccolta lievito GST YSC4515-202.484.078); pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | questo studio |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898); pRS425 (BOK 343) | questo studio |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | Slx5-proteina A (BOK 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | questo studio |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YOK 2397) | msn5Δ :: igromicina | questo studio |
| YOK 2592 | msn5Δ :: igromicina a JD52 (YOK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | questo studio |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | questo studio |
Tabella 3. I ceppi di lievito.
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Discussion
Questo protocollo si concentra sulla preparazione di intatto, nativo, e post-traduzionali modificato proteine da cellule di lievito in erba per le applicazioni a valle. Prima di tentare questo protocollo, è fondamentale per determinare se la proteina di interesse può essere facilmente rilevata in estratti proteici preparati in condizioni denaturanti 12. Se gli anticorpi policlonali non sono disponibili può essere vantaggioso per tag epitopo della proteina di interesse in modo che la proteina di fusione può essere rilevato in Western blot. Nel presente protocollo, abbiamo scovato SIZ1 con l'HA, 6xHis-V5, o epitopi myc e questa strategia ci ha permesso di identificare chiaramente la proteina e le sue forme sumoylated il Western blot (Figura 1). Abbiamo avuto meno successo di individuare le proteine GFP-tagged, forse perché gli anticorpi anti-GFP ad alta affinità sono difficili da ottenere (dati non riportati). Un altro punto critico riguarda il livello di espressione della proteina di interesse. Livelli di individuoproteine variare ampiamente in cellule di lievito in erba 4 e alcune proteine devono essere sovraespressa in modo che possano essere rilevati e / o purificati. Vettori galattosio-inducibili sono disponibili per l'espressione ad alto livello del gene di interesse lievito 2. Nel caso di SIZ1, siamo stati in grado di rilevare la lunghezza completa o proteina troncata quando espressa da ORF cromosomicamente marcate o se espresso sotto il controllo del forte promotore inducibile da galattosio un plasmide (Figura 1). L'uso di troncamenti può essere utile in struttura analisi / funzione o quando la molecola intera lunghezza è difficile esprimere o instabile. Mentre sovraespressione galattosio indotta migliora il rilevamento e purificazione di proteine, presenta delle limitazioni evidenti quando si studia la rilevanza fisiologica di potenziali ciclo cellulare specifiche modificazioni post-traduzionali e interazioni. Per esempio, sumoilazione di SIZ1 è più prevalente in G2 / M stadio del ciclo cellulare, e modificazioni o interazioni dila proteina overexpressed può essere confermato da altri mezzi sperimentali. Infine, l'aggiunta di proteasi specifico, fosfatasi, e / o inibitori del proteasoma è una considerazione importante per il successo di questo protocollo. Generalmente, i migliori risultati si ottengono aggiungendo questi inibitori prima cellule vengono congelate e nei buffer di estrazione e diluizione. L'aggiunta di EDTA, un chelante di ioni a volte presenti in cocktail inibitore della proteasi di metallo, non è consigliabile in quanto potrebbe interferire con le successive purificazioni affinità metallo.
Estratti proteici ottenuti per bead-battendo sono adatti come materiale di partenza per la purificazione di singole proteine. Specificamente, dimostriamo che Slx5 overexpressed trasportano un marcatore per affinità 6xHis possono essere purificati da WCEs utilizzando una resina di affinità metallica (Figura 2A). Per preservare modificazioni post-traduzionali e ridurre la degradazione delle proteine, proteine 6xHis-tag vengono spesso purificati in condizioni denaturanti5. Tuttavia, ci sono diversi vantaggi associati alla purificazione di proteine in condizioni native. Ad esempio, queste proteine possono co-purificare con partner leganti o possono essere utilizzati in saggi in vitro successiva 13,14. Nel caso di SIZ1 e Slx5 serendipitously abbiamo determinato che entrambe le proteine esibiscono intrinseca affinità per la resina di affinità metallica, indipendente dal tag 6xHis, e questa osservazione ci ha suggerito che entrambe le proteine assunte conferme native. Purtroppo, una corretta attività di piegatura e biologica delle proteine purificate deve essere determinata caso per caso. A tal fine, il collocamento di affinità ei tag epitopo sia a capolinea ammino o carbossi, può influenzare notevolmente l'attività o stabilità della proteina di fusione ed è una considerazione importante nella pianificazione di una strategia di purificazione di proteine.
Il lavoro futuro si concentrerà su come migliorare modificazioni post-traduzionali durante la purificazione, per esameple attraverso l'uso di proteasi deficienti ceppi di lievito, diversi inibitori delle proteasi, o altri tag di affinità. Prevediamo che questo protocollo nella sua forma attuale o tampone ottimizzato è applicabile per l'estrazione, la purificazione e successivo studio scalabile di molte proteine di lievito in erba.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del Kerscher laboratorio per il loro sostegno. Ringraziamo Mark Hochstrasser per ceppo di lievito MHY3765. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere 1051970 (per OK) e un Howard Hughes Medical Institute di laurea concessione Viaggi e Monroe Scholars Program Grant (ad ES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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