Summary
Utarbeidelse av høy kvalitet gjær celle ekstrakter er et nødvendig første skritt i analysen av enkelte proteiner eller hele proteom. Her beskriver vi en rask, effektiv og pålitelig homogenisering protokoll for spirende gjærceller som er optimalisert for å bevare proteinet fungerer, samspill, og posttranslasjonelle modifikasjoner.
Abstract
Homogenisering av perle juling er en rask og effektiv måte å frigjøre DNA, RNA, proteiner og metabolitter fra spirende gjærceller, som er notorisk vanskelig å forstyrre. Her beskriver vi bruken av en kulemølle homogenisator for utvinning av proteiner til buffere optimalisert for å opprettholde de funksjoner, interaksjoner og post-translasjonelle modifikasjoner av proteiner. Logaritmisk voksende celler som uttrykker proteinet av interesse blir dyrket i et flytende vekstmedier valg. De vekstmedier kan suppleres med reagenser for å indusere protein uttrykk fra induserbar arrangører (f.eks galaktose), synkronisere cellesyklus stadium (f.eks nocodazole), eller hemmer proteasom funksjon (f.eks MG132). Celler behandles deretter pelletert og resuspendert i en passende buffer som inneholder protease-og / eller fosfatase-inhibitorer og er enten behandlet umiddelbart eller frosset i flytende nitrogen for senere bruk. Homogenisering oppnås ved seks sykluser med 20 sek bead-pisking (5,5 m / sek), hver etterfulgt av en minutters inkubasjon på is. Det resulterende homogenisat ble klarert ved sentrifugering og små partikler kan fjernes ved filtrering. Den resulterende fjernet helcelle-ekstraktet (WCE) blir utfelt med 20% TCA for direkte analyse av totale proteiner ved SDS-PAGE etterfulgt av Western blotting. Ekstrakter er også egnet for affinitetsrensing av spesifikke proteiner, og påvisning av post-translasjonelle modifikasjoner, eller analyse av ko-rensende proteiner. Som er tilfellet for de fleste protein rensing protokoller, kan enkelte enzymer og proteiner krever unike forhold eller buffer komposisjoner for deres rensing og andre kan være ustabile eller uløselig på de vilkår som fremgår. I det siste tilfelle kan den protokoll presentert gi et nyttig utgangspunkt for empirisk å bestemme den beste perle-bankende strategi for protein ekstraksjon og rensing. Vi viser utvinning og rensing av en epitope-merket SUMO E3 ligase, Siz1, en celle syklusregulert protein som blir både sumoylated og fosforylert, samt en SUMO-målrettet ubiquitin ligase subenheten, Slx5.
Introduction
Den utrolige kraften til gjær genetikk er legendarisk, men utarbeidelse og analyse av innfødte proteiner fra spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae, er ofte full av problemer. Sistnevnte skyldes den betydelig mekanisk styrke og elastisitet av gjærcelleveggen 1.. Forskjellige midler er blitt beskrevet for enzymatisk, kjemisk, mekanisk, og press-basert avbrudd av gjærceller for å oppnå hel-celle proteinekstrakt 2-6. Disse teknikkene varierer mye i deres effekt for å gi celle-representative, native proteinekstrakter som kan brukes for etterfølgende analyser eller rensningstrinn. For eksempel kan den gjærcelleveggen fjernes med lytiske enzymer (f.eks Zymolyase) og resulterende spheroblasts kan bli forstyrret ved skjærbehandling, vaskemidler, eller osmotisk lysering å frigjøre proteiner. Denne tilnærmingen har blitt ansatt som utgangspunkt for mange subcellular fractionations men det krever lange inkubasjonersom ikke er kompatible med stabiliteten av noen proteiner 7.
Proprietary gjær lysis reagenser (for eksempel detergenter) til kjemisk ekstraksjon av proteiner av gjærceller er kommersielt tilgjengelige, men effekten av disse reagenser i protein utvinning og deres effekt på påfølgende biokjemisk karakterisering av proteiner er ikke alltid klart 8.. Høytrykk homogenizers, ofte referert til som franske presser, effektivt kan bryte gjærceller ved først å utsette dem for høye trykk og deretter ekstrudere dem gjennom en liten åpning i en trykkcelle. Denne teknikken produserer høykvalitets ekstrakter men utstyret er veldig dyrt og kan ikke være egnet for små mengder celler eller flere prøver ni. Derfor er mekanisk forstyrrelse av gjærceller i en kulemølle ofte metoden for valg for native gjær proteinpreparater 10. Denne teknikken innebærer mekanisk forstyrrelse av gjærcelleveggen med syre-waskur glassperler, som kan bli gjennomført med en rekke shakers, vortexers eller perle møller. Spesielt, kan denne metode benyttes til å samtidig behandle flere mindre prøver (1 ml celler eller mindre). Mange forskjellige perler eller kulemølle avbrudd matriser er nå kommersielt tilgjengelig for å forstyrre nesten alle slags celletype i 2 ml rør. Vurderer andre teknikker og utstyr, har en kulemølle den ekstra fordelen at avbrudd av gjærceller skjer veldig fort, noe som bidrar til å bevare posttranslasjonelle modifikasjoner som sumoylation, spesielt når de riktige buffere med protease og / eller proteasomhemmere benyttes og temperaturen av ekstrakter er under kontroll.
Denne protokollen fokuserer på rask, effektiv og pålitelig utvinning av endogene og over-uttrykte proteiner etter milde forhold med det endelige målet å bevare protein funksjon, interaksjoner, og posttranslasjonelle modifikasjoner. Vekstmedier, cellelyse bufferkomposisjoner, og kulemølle innstillinger er optimalisert for å opprettholde protein interaksjoner og posttranslasjonelle modifikasjoner som sumoylation og ubiquitylation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Rensing av 6xHIS-merkede proteiner uttrykt i spirende gjærceller i henhold innfødte forhold
En. Vekst av gjærceller og induksjon av Protein Expression
(Modifisert fra 2)
Alternativ: Bruk logaritmisk voksende gjærkulturer som uttrykker proteinet av interesse i stedet for den galaktose-induserte kulturer beskrevet nedenfor.
- Transformere cellene i en Gal + gjærstamme med et plasmid som koder en galaktose-induserbar 6xHIS-merket protein av valget. Se for eksempel reagenser listen.
- Inokuler transformanter i 5 ml egnede selektive medier (f.eks SD-uracil) inneholdende 2% sukrose. Inkuber ved 30 ° CO / N, roterende.
- Fortynn O / N kulturen slik at den optiske tettheten ved 600 nm måler 0,3 (OD 600 = 0,3) i 33 ml av selektive medier med 2% sukrose. Vokse ved 30 ° C, risting (Δ150 rpm).
- Når kulturen har nådd OD 600 = 0,8-1,5, Indusere ekspresjon av det ønskede protein ved å tilsette 17 ml 3x YEP med 6% galaktose (Oppskrift i tabell 1), til en sluttkonsentrasjon på 1 x YEP med 2% galaktose. Total kultur volum er nå 50 ml. Inkuber, risting, ved 30 ° C i ytterligere 5-6 timer.
Merk: kulturen volum kan varieres. I trinn 1.3, fortynnes i to tredjedeler av det ønskede sluttvolum. I trinn 1.4, legg en tredjedel av siste bind av 3x YEP / 6% galaktose. - Måle OD 600 av den induserte kultur og sentrifuge Δ150-200 OD 600 enheter av celler i 5 min ved 5000 rpm ved 4 ° C.
- Resuspender cellepelleten med 1 ml iskald 1x PBS med 1x proteasehemmer cocktail og overføring til et 2 ml skrukork tube.
- Sentrifuger cellene i 1 min ved 15.000 rpm ved 4 ° C. Dekanter supernatanten.
- Snap fryse cellepelleten i flytende nitrogen, etterfulgt av umiddelbar cellelyse eller lagring ved -80 ° C inntil videre bruk.
- Til den frosne cellepellet fra forrige trinn, tilsett 200 pl av syre-vasket glassperler og 500 pl iskald lyseringsbuffer (Oppskrift i tabell 1, eller bruk av celle-lyseringsbuffer valg).
- Kort pipette opp og ned. Det er ikke nødvendig å fullt cellepelleten suspenderes. Hold rørene på is til alle tider.
Merk: Slutten av pipette spissen kan bli kuttet av før pipettering opp og ned. - Ved 4 ° C, sted røret (e) med celler inn i kulemølle, balanse, lås, og kjør maskinen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Kjør vulsten beater inneholdende røret (e) i 20 sekunder ved 5,5 m / sek, og deretter plassere på kramme is i 1 min. Gjenta 6x totalt.
- Fjern de ekstraherte proteiner ved sentrifugering i 15 min ved 15.000 rpm ved 4 ° C. EKSTRA: fjerne små partikler ved sentrifugering gjennom en Spinx filter.
- Forbered en prøve av hele cellen extract (WCE) for å bekrefte tilstedeværelse av protein av interesse ved Western Blot:
- Legg WCE korresponderende med to OD 600 enheter av celler (for eksempel 5 mL av ryddet ekstrakt hvis 200 OD 600 enheter av celler ble høstet) til 800 pl 20% trikloreddiksyre (TCA). Vortex å blande.
- Sentrifuger i 2,5 min ved 15.000 rpm ved 4 ° C. Dekanter supernatanten, men vær nøye med å beholde pellet.
- Legg 800 pl 2% TCA til pelleten og vortex-røret, etterfulgt av sentrifugering i 2,5 minutter ved 15.000 rpm ved 4 ° C. Dekanter supernatanten, men vær nøye med å beholde pellet.
- Tilsett 100 ul TCA prøvebuffer (Oppskrift i tabell 1), vortex å oppløse pelleten. Merk: Hvis prøven buffer blir sure (blir gul) etter tillegg til pellets, legge aliquoter av Δ10 ul Tris basen [1M] til prøven er blå igjen.
- Inkuber i en 100 ° C varmeblokk i 2-5 min.
- Vortex again å fullt oppløses dersom restene av pellets er fortsatt til stede. Pellets utarbeidet av denne metoden er notorisk vanskelig å fullt oppløse. Det kan ta Δ10 min av virvle å løse opp pellets.
- Store-prøven ved -80 ° C inntil videre bruk.
- Snap fryse porsjoner av gjenværende ryddet WCE i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C inntil videre bruk.
3. Batch Rensing av Proteiner fra gjær Cell homogenates
Merk: Denne rensemetoden ble optimalisert for rensing av 6xHIS-merkede proteiner på Co 2 + metall affinitet harpiks.
- Resin Ekvilibrering
- For et utvalg av ryddet WCE forberedt fra Δ20-40 OD 600 enheter av celler, legge 50-100 mL affinitet harpiks til et mikrosentrifugerør. Proteiner ekstrahert fra celler som ikke uttrykker det ønskede protein eller et ikke-spesifikk harpiks, slik som amylose, kan bli anvendt som kontrolls for spesifikk binding.
- Vask harpiks 5x med 1 ml vaskebuffer: invert topp-over-bunn inntil harpiks resuspenderes, og deretter spinne i 1 minutt ved 5000 opm ved 4 ° C. Aspirer supernatanten.
Merk: Hvis du utfører ekstraksjon og rensing på samme dag, kan harpiks likevekt utføres før utvinning.
- Protein Binding for affinitetsrensing
- Legg 100-200 mL av ryddet lysatet (Δ20-40 OD 600 enheter) til 50-100 mL vaskede perler, og bringe det totale volumet til 1 ml med lysis buffer.
- Inkuber med nutation eller gynging ved 4 ° C i 2-5 timer.
- Sentrifugering i 1 minutt ved 5000 opm ved 4 ° C.
- Hvis ønskelig, lagre en prøve av den gjenværende supernatanten for påfølgende analyse av ubundne proteiner. TCA bunnfall som beskrevet ovenfor for WCE (trinn 2.6).
- Vask harpiks med bundne proteiner 5x med 1 ml vaske buffer, etterfulgt av en snurr i 1 min ved 5000 rpm ved4 ° C. Hold prøvene kaldt under vask.
- Eluering av Bound Proteiner
- Tilsett 150 pl elueringsbuffer til harpiks, nutate ved 4 ° C i 5 min, sentrifugering i 1 minutt ved 5000 rpm ved 4 ° C og supernatanten lagre i et nytt rør. EKSTRA: Gjenta 2x og basseng elueringer.
- Forbered eluerte prøve for Western blot: Til 25 ul av eluerte proteiner, tilsett 25 pl 2x litium-dodecyl-sulfat (LDS) prøvebuffer med 2 mL β-merkaptoetanol (BME) og inkuberes i en 100 ° C varmeblokk i 2 min.
Merk: Standard 2X Laemmli prøvebuffer kan også anvendes. - Snap fryse overskytende eluerte protein i flytende nitrogen.
EKSTRA: bånd gjenværende proteiner fra harpiks med et likt volum av 2x prøvebuffer LDS ved 65 ° C i 5 minutter, fjern LDS-eluerte proteiner til et nytt rør, så til 2 mL BME til de eluerte proteiner, ikke til harpiksen. Denne orden er å hindre fjerning av eventuelle ioner eller antistoffer som er Conjugated til perlene. - Oppbevar prøver ved -80 ° C inntil videre bruk.
- Western Blot og sensoren med egnede antistoffer for å visualisere proteiner.
- Laste 10-20 mL (Δ1-3 OD 600 enheter) av hver prøve og 3-10 ul av et protein stigen i en SDS-PAGE gel av valget. Geleer som brukes rutinemessig for denne protokollen inneholde 4-12% Bis-Tris og 8% Tris-Glycine.
- Kjør gel ved 200 V i 50 min.
- Overfør proteinene fra gelen til en PVDF membran ved semi-tørr overføring på 19 V i 20-30 min (oppskrift i tabell 1).
- Blokk membran i 4% milk/1x Tris bufret saltvann-Tween (TBST) i 1 t ved RT eller O / N ved 4 ° C (oppskriften i tabell 1).
- Inkuber membran med primært antistoff til epitop-merket protein av interesse i 4% milk/1x TBST i 1-3 timer ved romtemperatur eller O / N ved 4 ° C.
- Vask membran 3x for 5 min hver med 1x TBST.
- Inkuber membran med passendesekundær pepperrot peroksydase (HRP)-konjugert antistoff i 1-3 timer ved romtemperatur.
- Vask membran 3x i 15 min hver i et stort volum av 1x TBST.
- Dekk membran med ECL substrat og sjal i Saran wrap.
- Expose membran til film og utvikle seg til å visualisere proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre representative resultater viser at den beskrevne perle-vibrerende og protein utvinning protokoll er anvendelig for reproduserbar fremstilling av proteiner for en rekke nedstrømsapplikasjoner (oppsummert i tabell 2). SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie farging av WCEs viser at et stort utvalg av proteiner (~ 12 til> 250 kDa) kan reproduserbart ekstrahert fra gjærceller (figur 1A). Diskrete band over et område av molekylvekter som er indikative av høykvalitets proteinekstrakter. Kvaliteten av ekstrakter kan bli bekreftet ved western blotting for spesifikke epitop-merkede proteiner. Vist er et representativt resultat for galaktose-overexpressed, V5-merket SUMO ligase Siz1 som vandrer på Δ120kDa (figur 1B). Vanligvis ville delvis degraderte proteiner kjørt som flere fragmenter under den forventede vekt, men her bare full lengde proteinet er observert. I tillegg, høymolekylære addukter av et gitt proteinkan indikere posttranslasjonelle modifikasjoner. For eksempel viser vi galaktose-overexpressed sumoylated Siz1Δ440 og full lengde Siz1 (figur 1C og figur 1D). Modifikasjoner kan også bli bevart på endogent uttrykt Siz1 (figur 1E).
Vi gir representative resultater som to kjernefysiske beriket proteiner, Slx5 og Siz1Δ440, ble vellykket renset fra våre WCEs (Tall 2A, 2B og 2C). Spesielt, viser vi at en 6xHIS-merket protein (Figur 2A; Slx5) kan være affinitetsrenset fra våre WCEs begge under innfødte og denaturing forhold. I kontrast, Slx5-GST (figur 2B) og Siz1Δ440-HA (figur 2C) mangler en 6xHIS epitope men under innfødte forholdene fortsatt samhandle med metall-affinitet harpiks i en imidazole-følsom måte. Vi foreslår at Siz1, og i mindre grad SLX5, er i stand til å binde metall-affinitet harpiks via sin metall-koordinerende RING domene. Mens, til vår kunnskap, har denne spesielle fenomenet ennå ikke blitt rapportert, har en lignende situasjon blitt beskrevet som koleratoksin B-subenhet binder Ni 2 + affinitet harpiks på en måte formidlet av sin naturlige histidin rester 11. Viktigere, tyder dette observasjon at proteiner i WCE er, i hvert fall delvis, opprinnelig foldet.
Spesielt for studiet av protein funksjon er det viktig å vise at proteinkomplekser forbli intakt i helcelle-ekstrakter. Våre representative data indikerer at Siz1Δ440, Slx5, og Pgk1 (a cytosolprotein som fungerer som en lasting kontroll) var til stede i WCEs. Siz1Δ440 ble renset fra disse ekstrakter basert på dets iboende evne til å binde til metall-affinitet harpikser (sammenlign figur 2C). Når Slx5 og Siz1 ble co-uttrykt i gjærceller, ble Slx5 nivåer i eluatene økt,øke muligheten for at Slx5 kan interagere med Siz1 (figur 3).
Figur 1. Tilstedeværelse av intakte og sumoylated proteiner i gjær cellelysat etter ekstraksjon. Mindre annet er angitt helcelle ekstrakter ble fremstilt som beskrevet i denne protokollen. Prøver ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og Western blot-etter ble probet med antistoffer til enten HA, V5, eller myc epitop koder. Gjær stammer er samlet i Tabell 3. WB: western blot. (A) Representative prøver av TCA-utfelt WCE (fra YOK 2514 (to kjørefelt til venstre) og YOK 2592 (to kjørefelt til høyre), (Δ0.2 OD / kjørefelt)) ble visualisert ved farging med en gel stain ( se Materialer avsnitt). (B) Lane 1 & 2: homogenates av gjærstamme YOK 2510 og YOK 2512 inneholder galaktose-overexpressed Siz1-V5/6xHIS. Legg merke til fraværet av delvis degraderte proteinfragmenter. Av ukjente grunner, betyr dette utvalget ikke avsløre sumoylated addukter når analysert med en anti-V5 antistoff. Imidlertid kan sumoylation bli detektert med et anti SUMO (anti-Smt3)-antistoff som vist i fig. 1D. (C) Lane 3 & 4: homogenates av gjærstamme YOK 2508 og YOK 2509 inneholder galaktose-overexpressed Siz1Δ440-HA. (D) 5 Lane, 6 & 7: galaktose-overexpressed Siz1-V5/6xHIS ble renset ved hjelp av Co 2 + metall affinitet harpiks, eluert med 200 mM imidazol, og analysert med anti-V5 (lane 5), anti-Smt3 (lane 6). Lane 7 er et reprobe av felt 6 med anti-V5-antistoff. og viser både Siz1 og sumoylated Siz1 addukter (Smt3 n). (E) Lane 8: JD52 hvete celler som inneholder endogene nivåer av myc-merket Siz1 (YOK 2397). Ryddet lysatet utarbeidet med en pattedyr lysis buffer. Lane 9: Lysate supernatanten etter en 2 timers inkubasjon med anti-V5 agarose. Note sumoylated addukter av Siz1. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Rensing av over-uttrykk RING-domene som inneholder proteiner med Talon Metal Affinity harpiks. Galactose induksjon, protein ekstraksjon og rensing ble utført som beskrevet i denne protokollen. Rensing ble utført under innfødte forhold og denaturerende betingelser, som guanidinium-hydroklorid ble tilsatt til prøven til 6 M før inkubering med harpiks. Lysat ble rotert med både amylose kontroll-harpiks (A) og Talon Metal Affinity harpiks (T). Proteiner ble eluert med 200 mM imidazol i elueringsbufferen. Prøver ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og Western blottet(WB) med et antistoff til riktig epitope tag. A) Galactose-indusert Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) ble renset med Talon harpiks under begge innfødte og denaturing forhold B) Galactose-indusert Slx5-GST (YOK 2071) var renset med Talon harpiks i native, men ikke denaturing forhold. Antagelig samhandler metall koordinere RING domene med Talon harpiks når brettet skikkelig. C) Galactose-indusert Siz1Δ440-HA (YOK 2353) ble også renset med Talon harpiks i native, men ikke denaturing forhold. Disse proteinene inneholder ikke 6xHIS koder, men hver inneholder en RING domene, som naturligvis koordinerer Zn 2 +-ioner og kan gi muligheten til å egentlig binde Talon Metal Affinity harpiks når brettet skikkelig. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Co-rensing på over-uttrykt proteiner på Talon Metal Affinity harpiks.
Slx5-GST og Siz1Δ440-HA ble uttrykt av seg selv eller i kombinasjon (+ / -) i JD52 celler (stammer YOKs 2353, 2402, 2224 henholdsvis). Proteiner ble trukket som beskrevet (WCE) og lysatene ble nutated med Talon Metal Affinity resin (se figur 2). Proteiner ble eluert fra harpiksen med 200 mM imidazol i elueringsbuffer (eluat) og fremstilt i LDS prøvebuffer. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og Western blot-etter ble analysert med et antistoff til ha-koden eller GST-tag som er hensiktsmessig. Lik belastning av proteiner er bekreftet med PGK som en lasting kontroll. Merk at Slx5 rensing er forbedret i nærvær av Siz1Δ440. Klikk her for å se større bilde .
| Oppløsning | Komponenter | Kommentarer |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g gjær ekstrakt 60 g Peptone i 700 ml DDH 2 O | Bland ingrediensene og autoklaver å sterilisere. Legg filteret sterilisert galaktose til 6% til individuelle alikvoter av 3x YEP da klar til bruk |
| TCA Sample Buffer | 15% glyserol 80 mM Tris Base (non-pH'd) 3,5% SDS bromfenolblå "etter smak." Ta med volumet til 25 ml med DDH 2 O | Før bruk: tilsett 40 pl av β-merkaptoetanol (BME) til 1 ml TCA prøvebuffer |
| Vask Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 20 mM imidazol | Imidazol brukes for Ni 2 + eller Co 2 + metall affinitetsrensing bare |
| Lysebuffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 10 mM imidazol 1x proteaseinhibitor cocktail Legg proteasehemmer cocktail umiddelbart før bruk. Imidazol brukes for Ni 2 + eller Co 2 + metall affinitetsrensing bare. EKSTRA: 25 mM N-etylmaleimid (cystein proteasehemmere, for å bevare sumoylation), 1 mM natrium orthovanadate (protein tyrosin fosfatase inhibitor), og / eller andre empirisk bestemt proteasehemmere basert på spesifikke fagområde | |
| Elueringsbuffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 200 mm imidazole | Imidazol brukes til å konkurrere om histidin bindende områder i Ni 2 + eller Co 2 + metall affinitetsrensing bare. Andre metoder for eluering kan benyttes for ulike affinitet harpikser. |
| Semi Dry Transfer Buffer (10x) | I en L av DDH 2 O: 58 g Tris 29,3 g Glycine 18.75 ml 20% SDS | For å gjøre 1x Semi Dry Transfer Buffer: mix 100 ml 10x Semi Dry Transfer Buffer med 200 ml metanol og 700 ml DDH 2 Os |
| Tris saltløsning (TBS, 10x) | 50 ml 1 M tris-HCl, pH 8,0, 150 ml 5 M NaCl 300 ml DDH 2 O | For å gjøre 1x TBST, bland 100 ml 10x TBS med 900 ml DDH 2 O og tilsett 1 ml Tween-20 |
Tabell 1. Løsninger og buffere.
| Søknad | Mengde Cells | Neste trinn |
|---|---|---|
| Cellelysis | 150-200 ODS av slaktet cellepellet | Perlene slo som er beskrevet i trinn 2 |
| Western Blot av WCE | 2 ODS av lyserte celler forberedt | Forbered deg på Western blot av TCA nedbør som beskrevet i trinn 2.6. Δ0.3 OD enheter (Δ15 ul) kjører ut på gel |
| Affinitetsrensing og / eller Pulldown | 30 ODS av lyserte celler | Bind, eluer, og forberede proteiner som beskrevet i trinn 3.2 og 3.3 |
| Omtrent 1-2 ODS (dersom fremstilt som i trinn 3.3) | Western blot som beskrevet i trinn 3.4 |
Tabell 2. Oppsummering av applikasjoner for denne protokoll.
| Navn | Relevant Genotype eller Parent Strain | Plasmid (s) eller Kassett-innsetting | Referanse |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | Mata ura3-52 his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ63 lys2-801 | Dohmen et al. 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gjær GST samling YSC4515-202484078) | denne studien |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | denne studien |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (629 BOK, OpenBiosystems Gjær GST samling YSC4515-202484078); pRS425 (BOK 343) | denne studien |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denne studien |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogent merket) | denne studien |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (629 BOK, OpenBiosystems Gjær GST samling YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denne studien |
| YOK 2501 | MHY3765, alfa parring type, ura3-52, lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; matte-alpha2Δ :: kanMX | Xie et al., 2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 Matte-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denne studien |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; matte-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (629 BOK, OpenBiosystems Gjær GST samling YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denne studien |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; matte-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898); pRS425 (BOK 343) | denne studien |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; matte-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | Slx5-Protein A (BOK 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | denne studien |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YOK 2397) | msn5Δ :: hygromycin | denne studien |
| YOK 2592 | msn5Δ :: hygromycin i JD52 (YOK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | denne studien |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | denne studien |
Tabell 3. Gjær stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen fokuserer på utarbeidelse av intakt, innfødt, og post-translationally modifiserte proteiner fra spirende gjærceller for ned-stream applikasjoner. Før du forsøker denne protokollen, er det avgjørende å finne ut om protein av interesse kan lett oppdages i proteinekstrakter utarbeidet under denaturing forhold 12. Dersom polyklonale antistoffer ikke er tilgjengelige, kan det være fordelaktig å epitop tag for proteinet av interesse, slik at fusjonsproteinet kan detekteres på Western blots. I den foreliggende protokollen, merket vi SIZ1 med HA, 6xHIS-V5, eller myC epitop koder og denne strategien mulig for oss å identifisere proteinet og dets sumoylated skjemaer på vestlige blotter (figur 1). Vi hadde mindre suksess detektere GFP-merkede proteiner, muligens fordi høyaffinitets-anti-GFP antistoffer er vanskelig å få tak (data ikke vist). En annen kritisk problem gjelder uttrykket nivået av proteinet av interesse. Nivåene av enkelteproteiner varierer mye i spirende gjærceller 4 og noen proteiner må være overuttrykt, slik at de kan oppdages og / eller renset. Galaktose-induserbare vektorer er tilgjengelige for den høynivå ekspresjon av genet av interesse gjær to. I tilfelle av Siz1, var vi i stand til å detektere full lengde eller avkortet protein uttrykt fra kromosomalt-merkede ORF'er eller når den uttrykkes under kontroll av den galaktose-induserbare sterk promotor fra et plasmid (figur 1). Bruken av trunkeringer kan være nyttig i struktur / funksjons analyser eller når den fulle lengde molekylet er vanskelig å uttrykke eller ustabil. Mens galaktose-indusert overexpression forbedrer protein deteksjon og rensing, det har klare begrensninger når studere fysiologiske betydningen av potensielle celle-syklus spesifikke posttranslasjonelle modifikasjoner og interaksjoner. For eksempel er sumoylation av Siz1 mest utbredt i G2 / M fasen av cellesyklusen, og modifiseringer eller interaksjoner avden overexpressed protein kan ha for å bli bekreftet av andre eksperimentelle metoder. Endelig er tillegg av spesifikke protease, fosfatase, og / eller proteasomhemmere en viktig faktor for å lykkes med denne protokollen. Vanligvis er de beste resultatene oppnås ved å legge disse hemmere før cellene er frosset og inn i utvinning og fortynning buffere. Tilsetningen av EDTA, en metallion innføyning av og til tilstede i protease-inhibitor cocktail, er ikke tilrådelig, da det kan forstyrre påfølgende metall affinitet rensinger.
Proteinekstrakter oppnådd ved perle-bankende er godt egnet som utgangsmateriale for rensing av de enkelte proteiner. Konkret viser vi at overexpressed Slx5 bærer en 6xHIS affinitet tag kan bli renset fra WCEs ved hjelp av en metall affinitet harpiks (Figur 2A). For å bevare posttranslasjonelle modifikasjoner og redusere protein degradering, er 6xHIS-merkede proteiner ofte renset i henhold denaturing forhold5. Det er imidlertid klare fordeler i forbindelse med rensing av proteiner i henhold opprinnelige forhold. For eksempel kan disse proteinene samtidig rense med bindingspartnere eller kan anvendes i etterfølgende in vitro analyser 13,14. I tilfelle av Siz1 og Slx5 serendipitously vi fastslått at begge proteinene utviser iboende affinitet for metall affinitet harpiks, uavhengig av 6xHIS taggen, og denne observasjonen foreslått for oss at begge proteinene antas innfødte bekreftelser. Dessverre har riktig folding og biologisk aktivitet av renset proteiner som skal fastsettes fra sak til sak. For å oppnå dette, plassering av affinitet og epitop koder ved enten amino-eller carboxy terminus, kan i stor grad påvirke aktiviteten eller stabiliteten av fusjonsproteinet, og er en viktig faktor i å planlegge en proteinrensing strategi.
Fremtidig arbeid vil fokusere på hvordan du kan forbedre posttranslasjonelle modifikasjoner under rensing, for eksamenpel ved bruk av protease mangelfulle gjærstammer, ulike proteaseinhibitorer, eller andre affinitet koder. Vi spår at denne protokollen i sin nåværende eller buffer-optimalisert skjema som gjelder for den skalerbare ekstraksjon, rensing og påfølgende studie av mange spirende gjær proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av Kerscher lab for deres støtte. Vi takker Mark Hochstrasser for gjærstamme MHY3765. Dette arbeidet ble støttet av NSF stipend 1051970 (til OK) og Howard Hughes Medical Institute Lavere Reisestipend og Monroe Scholars Program Grant (til ES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al.
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
