Summary
उच्च गुणवत्ता खमीर सेल के अर्क की तैयारी व्यक्तिगत प्रोटीन या पूरे proteomes के विश्लेषण में एक आवश्यक पहला कदम है. यहाँ हम प्रोटीन कार्य, बातचीत, और बाद translational संशोधनों को संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया गया है कि नवोदित खमीर कोशिकाओं के लिए एक तेजी से, कुशल और विश्वसनीय homogenization के प्रोटोकॉल का वर्णन है.
Abstract
मनका पिटाई से homogenization बाधित करने के लिए बेहद मेहनत कर रहे हैं जो नवोदित खमीर कोशिकाओं से डीएनए, शाही सेना, प्रोटीन, और मेटाबोलाइट्स रिलीज करने के लिए एक तेजी से और कारगर तरीका है. यहाँ हम काम करता है, बातचीत और प्रोटीन के बाद translational संशोधनों को बनाए रखने के लिए अनुकूलित बफ़र्स में प्रोटीन की निकासी के लिए एक मनका मिल homogenizer के उपयोग का वर्णन. ब्याज की प्रोटीन व्यक्त लघुगणकीय बढ़ कोशिकाओं पसंद का एक तरल विकास मीडिया में बड़े हो रहे हैं. विकास मीडिया inducible प्रमोटरों (जैसे गैलेक्टोज) से प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए अभिकर्मकों के साथ पूरक हो सकते हैं, (उदाहरण के nocodazole) कोशिका चक्र चरण सिंक्रनाइज़, या (जैसे MG132) एंटीबॉडी समारोह को बाधित. कोशिकाओं तो pelleted और प्रोटीज और / या फॉस्फेट अवरोधकों युक्त एक उपयुक्त बफर में resuspended हैं और या तो तुरंत कार्रवाई की है या बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हैं. Homogenization 20 सेकंड BEA के छह चक्र से पूरा होता हैD-पिटाई (5.5 मी / सेक), बर्फ पर एक मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा प्रत्येक. परिणामस्वरूप homogenate centrifugation द्वारा मंजूरी दे दी है और छोटे कण निस्पंदन द्वारा हटाया जा सकता है. परिणामस्वरूप मंजूरी दे दी पूरे सेल निकालने (WCE) पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ द्वारा कुल प्रोटीन की प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए टी सी ए 20% का उपयोग उपजी है. अर्क भी विशिष्ट प्रोटीन के संबंध शुद्धीकरण, बाद translational संशोधनों, या सह शुद्ध प्रोटीन का विश्लेषण का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैं. सबसे प्रोटीन शुद्धि प्रोटोकॉल के लिए मामला है, कुछ एंजाइमों और प्रोटीन उनकी शुद्धि और दूसरों के लिए अद्वितीय स्थितियों या बफर रचनाओं कहा परिस्थितियों में अस्थिर या अघुलनशील हो सकता है आवश्यकता हो सकती है. उत्तरार्द्ध मामले में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल अनुभव से प्रोटीन निष्कर्षण और शुद्धि के लिए सबसे अच्छा मनका पिटाई रणनीति तय करने के लिए एक उपयोगी प्रारंभ बिंदु प्रदान कर सकता है. हम एक मिलान टैग सूमो E3 के ligase, Siz1, एक सेल चक्र के निष्कर्षण और शुद्धि दिखानेSlx5, sumoylated और phosphorylated है, साथ ही एक सूमो लक्षित ubiquitin ligase सबयूनिट दोनों हो जाता है कि प्रोटीन विनियमित.
Introduction
खमीर आनुवंशिकी के भयानक शक्ति महान है, लेकिन नवोदित खमीर, Saccharomyces cerevisiae, से देशी प्रोटीन की तैयारी और विश्लेषण अक्सर समस्याओं से भरा है. उत्तरार्द्ध काफी यांत्रिक शक्ति और खमीर कोशिका दीवार 1 की लोच की वजह से है. अलग अलग अर्थ एंजाइमी, रासायनिक, यांत्रिक, और दबाव के आधार पर पूरे सेल प्रोटीन निकालने 2-6 प्राप्त करने के लिए खमीर कोशिकाओं के विघटन के लिए वर्णित किया गया है. इन तकनीकों में बाद के विश्लेषण या शुद्धि चरणों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सेल प्रतिनिधि, देशी प्रोटीन अर्क उपज के लिए अपनी क्षमता में व्यापक रूप से भिन्न है. उदाहरण के लिए, खमीर कोशिका दीवार अपघट्य एंजाइमों (जैसे zymolyase) और परिणामस्वरूप spheroblasts से हटाया जा सकता है बाल काटना, डिटर्जेंट, या प्रोटीन रिलीज करने आसमाटिक सेल से बाधित हो सकता है. यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक कई subcellular fractionations के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्यरत हैं लेकिन यह लंबा incubations आवश्यकता किया गया हैकुछ प्रोटीन 7 की स्थिरता के साथ संगत नहीं हैं.
खमीर कोशिकाओं के प्रोटीन के रासायनिक निष्कर्षण के लिए मालिकाना खमीर सेल अभिकर्मकों (जैसे डिटर्जेंट के रूप में) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन इन प्रोटीन निष्कर्षण में अभिकर्मकों और प्रोटीन के बाद जैव रासायनिक लक्षण वर्णन पर उनके प्रभाव की प्रभावकारिता हमेशा 8 स्पष्ट नहीं है. अक्सर फ्रेंच प्रेस के रूप में भेजा उच्च दबाव homogenizers, प्रभावी ढंग से पहले उच्च दबाव subjecting उन्हें और फिर एक दबाव सेल में एक छोटे से खोलने के माध्यम से उन्हें extruding द्वारा खमीर कोशिकाओं को तोड़ने. इस तकनीक को उच्च गुणवत्ता के निष्कर्षों का उत्पादन लेकिन उपकरण बहुत महंगा है और कोशिकाओं या कई नमूने 9 की कम मात्रा के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता. इसलिए, एक मनका चक्की में खमीर कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन अक्सर देशी खमीर प्रोटीन की तैयारी 10 के लिए पसंद की विधि है. इस तकनीक एसिड पानी के साथ खमीर कोशिका दीवार के यांत्रिक व्यवधान शामिलशेकर्स, vortexers या मनका मिलों की एक किस्म के साथ आयोजित किया जा सकता है, जो कांच के मोती, बहाया. उल्लेखनीय है कि इस विधि के साथ कई छोटे नमूने (कोशिकाओं या उससे कम के 1 मिलीलीटर) की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कई अलग मोती या मोती मिल व्यवधान मेट्रिसेस अब 2 मिलीलीटर ट्यूब में सेल प्रकार के लगभग किसी भी तरह बाधित करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. अन्य तकनीकों और उपकरणों को देखते हुए, एक मनका मिल प्रोटीज और / या एंटीबॉडी inhibitors के साथ उचित बफ़र्स उपयोग किया जाता है, खासकर जब खमीर कोशिकाओं के विघटन ऐसे sumoylation के बाद translational संशोधनों की रक्षा करने में मदद करता है, जो बहुत तेजी से होता है कि जोड़ा लाभ है और निष्कर्षों के तापमान को नियंत्रित किया जाता है.
इस प्रोटोकॉल प्रोटीन समारोह, बातचीत, और बाद translational संशोधनों को संरक्षित करने के परम लक्ष्य के साथ कोमल परिस्थितियों में अंतर्जात और अधिक व्यक्त प्रोटीन की, तेज, प्रभावी और विश्वसनीय निकासी पर केंद्रित है. ग्रोथ मीडिया, सेल बफररचनाओं, और मनका मिल सेटिंग्स प्रोटीन बातचीत और इस तरह sumoylation और ubiquitylation के रूप में बाद translational संशोधनों को बनाए रखने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं.
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Protocol
देशी परिस्थितियों में नवोदित खमीर कोशिकाओं में व्यक्त 6xHIS टैग प्रोटीन का शुद्धीकरण
1. प्रोटीन अभिव्यक्ति की खमीर कोशिकाओं और प्रेरण की ग्रोथ
(2 से संशोधित)
वैकल्पिक: ब्याज के बजाय नीचे वर्णित गैलेक्टोज प्रेरित संस्कृतियों के प्रोटीन व्यक्त लघुगणकीय बढ़ रही खमीर संस्कृतियों का प्रयोग करें.
- एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग एक galactose-inducible चुनाव के प्रोटीन 6xHIS टैग के साथ एक लड़की + खमीर तनाव की कोशिकाओं को बदलने. उदाहरण के लिए, अभिकर्मकों सूची देखें.
- 2% सूक्रोज युक्त उपयुक्त चयनात्मक मीडिया के 5 मिलीलीटर (जैसे एसडी uracil) में transformants टीका लगाना. 30 ° सीओ / एन, घूर्णन पर सेते हैं.
- 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व 2% sucrose के साथ चयनात्मक मीडिया के 33 मिलीलीटर में 0.3 (0.3 = 600 आयुध डिपो) के उपाय तो यह है कि हे / एन संस्कृति पतला. (Δ150 आरपीएम) मिलाते, 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें.
- संस्कृति आयुध डिपो 600 = 0.8 तक पहुँच गया है-1.5, 2% galactose के साथ 1x वाई ई पी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए, 6% गैलेक्टोज (1 टेबल में पकाने की विधि) के साथ 3x वाई ई पी की 17 मिलीलीटर जोड़कर वांछित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित. कुल संस्कृति मात्रा अब 50 मिलीलीटर है. सेते हैं, एक अतिरिक्त 5-6 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर, मिलाते हुए.
नोट: संस्कृति मात्रा अलग किया जा सकता है. वांछित अंतिम मात्रा के दो तिहाई में कदम 1.3, पतला में. 1.4 चरण में, 3 एक्स वाई ई पी / 6% गैलेक्टोज का एक तिहाई अंतिम मात्रा में जोड़ें. - 4 डिग्री सेल्सियस से कम 5,000 rpm पर 5 मिनट के लिए प्रेरित संस्कृति और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं की Δ150-200 आयुध डिपो के 600 इकाइयों के 600 आयुध डिपो उपाय
- 1x protease अवरोध कॉकटेल और एक 2 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूब को हस्तांतरण के साथ 1 मिलीलीटर ठंडा 1x पीबीएस के साथ resuspend सेल गोली.
- 4 पर 15,000 rpm पर 1 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस छानना सतह पर तैरनेवाला.
- -80 पर तत्काल सेल या भंडारण डिग्री सेल्सियस आगे उपयोग तक, इसके बाद तरल नाइट्रोजन में फ्रीज सेल गोली स्नैप.
- पिछले चरण से जमे हुए सेल गोली, एसिड धोया ग्लास मनकों के 200 μl और ठंडा lysis बफर के 500 μl (1 टेबल या पसंद के सेल lysis बफर उपयोग में पकाने की विधि) जोड़ें.
- संक्षेप विंदुक ऊपर और नीचे. यह पूरी तरह से सेल गोली resuspend करने की आवश्यकता नहीं है. हर समय बर्फ पर ट्यूबों रखें.
नोट: पिपेट टिप के अंत और नीचे pipetting पहले से काटा जा सकता है. - 4 डिग्री सेल्सियस, जगह मनका चक्की, संतुलन, ताला, और प्रति निर्माता के निर्देशों के रूप में मशीन चलाने में कोशिकाओं के साथ ट्यूब (ओं).
- 5.5 से कम 20 सेकंड के लिए ट्यूब (ओं) युक्त मनका डिब्बा मी / सेक, तो 1 मिनट के लिए हलका बर्फ पर जगह चलाएँ. कुल में 6x दोहराएँ.
- 4 पर 15,000 rpm पर 15 मिनट के लिए centrifugation द्वारा निकाले गए प्रोटीन साफ़ डिग्री सेल्सियस वैकल्पिक: एक SPINX फिल्टर के माध्यम से centrifugation द्वारा छोटे कण को हटा दें.
- पूरे सेल ई का एक नमूना तैयारवेस्टर्न ब्लाट द्वारा ब्याज की प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए (WCE) xtract:
- 800 μl 20% trichloroacetic एसिड (TCA) के लिए कोशिकाओं के 2 आयुध डिपो के 600 इकाइयों (मंजूरी दे निकालने के उदाहरण के लिए 5 μl कोशिकाओं के 200 आयुध डिपो के 600 इकाइयों को काटा गया हो तो) के साथ इसी WCE जोड़ें. मिश्रण करने के भंवर.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 rpm पर 25 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र तैरनेवाला छानना, लेकिन गोली बनाए रखने के लिए सावधान रहना होगा.
- 4 पर 15,000 rpm पर 25 मिनट के लिए centrifugation द्वारा पीछा गोली और भंवर ट्यूब टी सी ए 2% की 800 μl, डिग्री सेल्सियस जोड़ें तैरनेवाला छानना, लेकिन गोली बनाए रखने के लिए सावधान रहना होगा.
- टीसीए नमूना बफर के 100 μl (1 टेबल में पकाने की विधि), गोली भंग करने के भंवर में जोड़ें. नोट: नमूना बफर गोली के अलावा के बाद (पीला पड़ जाता है) अम्लीय हो जाता है, Δ10 μl Tris आधार की aliquots जोड़ने [1 एम] नमूना फिर नीला है जब तक.
- 2-5 मिनट के लिए एक 100 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में सेते हैं.
- भंवर एजीगोली के अवशेष अभी भी मौजूद हैं, तो ऐन पूरी तरह से भंग करने के लिए. इस विधि से तैयार हिमपात पूरी तरह से भंग करने के लिए बेहद मुश्किल है. यह पूरी तरह से छर्रों भंग करने vortexing की Δ10 मिनट लग सकते हैं.
- -80 पर स्टोर नमूना डिग्री सेल्सियस आगे उपयोग करें जब तक.
- आगे का उपयोग करें जब तक -80 में तरल नाइट्रोजन और दुकान में शेष को मंजूरी दे दी WCE डिग्री सेल्सियस की aliquots फ्रीज स्नैप.
3. खमीर सेल homogenates से प्रोटीन के बैच शोधन
नोट: यह शोधन विधि सह 2 धातु आत्मीयता राल पर 6xHIS टैग प्रोटीन की शुद्धि के लिए अनुकूलित किया गया था.
- राल संतुलन
- कोशिकाओं के Δ20-40 आयुध डिपो 600 इकाइयों से तैयार की मंजूरी दे दी WCE का एक नमूना के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब आत्मीयता राल के 50-100 μl जोड़ें. , वांछित प्रोटीन या ऐसे एमाइलोज के रूप में एक अविशिष्ट राल, व्यक्त नहीं किया कि कोशिकाओं से निकाले गए प्रोटीन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैअविशिष्ट के लिए बाध्य है.
- धोने बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 5x राल धो: शीर्ष से अधिक नीचे पलटना राल resuspended, और फिर 4 में 5,000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिन है जब तक डिग्री सेल्सियस तैरनेवाला Aspirate.
नोट: उसी दिन निष्कर्षण और शुद्धि प्रदर्शन अगर, राल संतुलन निकासी से पहले किया जा सकता है.
- आत्मीयता शोधन के लिए प्रोटीन बंधन
- 50-100 μl धोया मोतियों को मंजूरी दे दी lysate के 100-200 μl (Δ20-40 आयुध डिपो के 600 इकाइयों) जोड़ें, और lysis बफर के साथ 1 मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा लाने.
- 2-5 घंटे के लिए 4 बजे शिखावर्तन या कमाल डिग्री सेल्सियस के साथ सेते हैं.
- 4 डिग्री सेल्सियस से कम 5,000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिन
- अगर वांछित, अनबाउंड प्रोटीन के बाद के विश्लेषण के लिए शेष सतह पर तैरनेवाला का एक नमूना बचा. टीसीए WCE (कदम 2.6) के लिए ऊपर विस्तृत रूप में वेग.
- कम 5,000 rpm पर 1 मिनट के लिए एक स्पिन के द्वारा पीछा धोने बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 5x बाध्य प्रोटीन, साथ राल धो4 डिग्री सेल्सियस Washes के दौरान नमूने ठंडा रखें.
- बाध्य प्रोटीन की क्षालन
- 4 में, राल को डोलना 150 μl क्षालन बफर जोड़ें ° 5 मिनट के लिए सी, 4 में 5000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस और एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला बचाने. वैकल्पिक: 2x और पूल elutions दोहराएँ.
- पश्चिमी धब्बा के लिए eluted नमूना तैयार: eluted प्रोटीन की 25 μl करने के लिए, के साथ 25 μl 2x लिथियम dodecyl सल्फेट (एलडीएस) नमूना बफर जोड़ने के 2 μl β-mercaptoethanol (बीएमई) और 2 मिनट के लिए एक 100 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में सेते.
नोट: मानक 2X Laemmli नमूना बफर भी इस्तेमाल किया जा सकता है. - तरल नाइट्रोजन में फ्रीज अतिरिक्त eluted प्रोटीन निकलो.
वैकल्पिक: 65 में 2x एलडीएस नमूना बफर के एक बराबर मात्रा के साथ राल से पट्टी शेष प्रोटीन डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए, एक नया ट्यूब एलडीएस-eluted प्रोटीन को हटा दें, तो नहीं राल, eluted प्रोटीन के लिए 2 μl बीएमई जोड़ें. इस क्रम conjuga हैं कि किसी भी आयनों या एंटीबॉडी के हटाने को रोकने के लिए हैमोतियों के लिए टेड. - -80 डिग्री सेल्सियस आगे उपयोग तक स्टोर नमूनों.
- उचित एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लाट और जांच प्रोटीन कल्पना करने के लिए.
- प्रत्येक नमूने की 10-20 μl (Δ1-3 आयुध डिपो 600 इकाइयां) और पसंद का एक एसडीएस पृष्ठ जेल में एक प्रोटीन सीढ़ी के 3-10 μl लोड. नियमित रूप से इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल जैल 4-12% बीआईएस Tris और 8% Tris-Glycine शामिल हैं.
- 50 मिनट के लिए 200 वी पर जेल चलाएँ.
- 20-30 मिनट (तालिका 1 में नुस्खा) के लिए 19 वी पर अर्द्ध शुष्क हस्तांतरण द्वारा जेल से एक PVDF झिल्ली के लिए प्रोटीन स्थानांतरण.
- 4% milk/1x Tris में ब्लॉक झिल्ली 4 डिग्री सेल्सियस (तालिका 1 में नुस्खा) में आर टी या ओ / एन पर 1 घंटे के लिए खारा के बीच (TBST) बफर.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या ओ / एन में 1-3 घंटे के लिए 4% milk/1x TBST में ब्याज का मिलान टैग प्रोटीन को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते
- 5 मिनट 1x TBST के साथ प्रत्येक के लिए 3x झिल्ली धो लें.
- उपयुक्त साथ झिल्ली सेतेमाध्यमिक हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित आरटी पर 1-3 घंटे के लिए एंटीबॉडी.
- 1x TBST की एक बड़ी मात्रा में 15 मिनट प्रत्येक के लिए 3x झिल्ली धो लें.
- सरन लपेट में ईसीएल सब्सट्रेट और चादर के साथ झिल्ली को कवर किया.
- फिल्म के लिए झिल्ली बेनकाब और प्रोटीन कल्पना करने के लिए विकसित करना.
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Representative Results
हमारे प्रतिनिधि परिणाम वर्णित मनका पिटाई और प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल बहाव के अनुप्रयोगों (2 तालिका में संक्षेप) की एक किस्म के लिए प्रोटीन की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की तैयारी के लिए उपयोगी है कि पता चलता है. WCEs की Coomassie धुंधला द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ प्रोटीन (~ 12 से> 250 केडीए) की एक विस्तृत श्रृंखला reproducibly खमीर कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) से निकाला जा सकता है. आणविक वजन की एक सीमा से अधिक अलहदा बैंड उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन के अर्क का संकेत कर रहे हैं. निष्कर्षों की गुणवत्ता पश्चिमी विशिष्ट मिलान टैग प्रोटीन के लिए सोख्ता से इसकी पुष्टि की जा सकती है. दिखाया Δ120kDa (चित्रा 1 बी) में प्रवास करती है जो गैलेक्टोज-overexpressed, वी 5 टैग सूमो ligase Siz1 के लिए एक प्रतिनिधि का परिणाम है. आम तौर पर, आंशिक रूप से अपमानित प्रोटीन उम्मीद वजन नीचे कई टुकड़े के रूप में चला जाएगा, लेकिन यहां केवल पूर्ण लंबाई प्रोटीन मनाया जाता है. एक दिया प्रोटीन के साथ ही, उच्च आणविक भार adductsबाद translational संशोधनों के संकेत हो सकता है. उदाहरण के लिए, हम गैलेक्टोज-overexpressed sumoylated Siz1Δ440 और पूर्ण लंबाई Siz1 (चित्रा 1C और चित्र -1) दिखा. संशोधन भी endogenously व्यक्त Siz1 (चित्रा 1E) पर संरक्षित किया जा सकता है.
हम दो परमाणु समृद्ध प्रोटीन, Slx5 और Siz1Δ440, सफलतापूर्वक हमारे WCEs (आंकड़े 2A, 2B, और 2 सी) से शुद्ध किया गया है कि प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं. दोनों देशी और denaturing परिस्थितियों में हमारे WCEs से शुद्ध आकर्षण हो सकता है, विशेष रूप से, हम एक 6xHIS टैग प्रोटीन (Slx5 2A चित्रा) बताते हैं कि. इसके विपरीत, Slx5-जीएसटी (चित्रा 2 बी) और Siz1Δ440 हा (चित्रा -2) एक 6xHIS मिलान की कमी है लेकिन देशी शर्तों के तहत अब भी एक imidazole के प्रति संवेदनशील ढंग से धातु आत्मीयता राल के साथ बातचीत. हम जानते हैं कि Siz1 का प्रस्ताव है, और एक हद तक कम एसLX5, उनके धातु समन्वय रिंग डोमेन के माध्यम से धातु आत्मीयता राल बाध्य करने में सक्षम हैं. , हमारे ज्ञान करने के लिए, इस विशेष घटना अभी तक नहीं बताया गया है, जबकि एक ऐसी ही स्थिति हैजा विष बी सबयूनिट नी 2 अपनी प्राकृतिक हिस्टडीन अवशेषों 11 द्वारा मध्यस्थता में एक तरह से + आत्मीयता राल जो बांध में वर्णित किया गया है. महत्वपूर्ण बात है, इस अवलोकन WCE में प्रोटीन, कम से कम भाग में, natively का मुड़ा हुआ है कि पता चलता है.
विशेष रूप से प्रोटीन की कार्यप्रणाली के अध्ययन के लिए यह प्रोटीन परिसरों पूरे सेल के अर्क में बरकरार रहेगा कि दिखाने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे प्रतिनिधि डेटा Siz1Δ440, Slx5, और Pgk1 (एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है कि एक साइटोसोलिक प्रोटीन) WCEs में मौजूद थे कि पता चलता है. Siz1Δ440 धातु आत्मीयता रेजिन (चित्रा -2) की तुलना करने के लिए बाध्य करने के लिए अपने निहित क्षमता के आधार पर इन निष्कर्षों से शुद्ध किया गया था. Slx5 और Siz1 खमीर कोशिकाओं में सह व्यक्त कर रहे थे, eluates में Slx5 स्तर बढ़ गया,Slx5 Siz1 (चित्रा 3) के साथ बातचीत कर सकते हैं कि संभावना बढ़ गई है.
चित्रा 1. निकासी के बाद खमीर सेल lysate में बरकरार है और sumoylated प्रोटीन की उपस्थिति. इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में अन्यथा न कहा पूरे सेल के अर्क तैयार थे जब तक. नमूने हा, वी 5, या Myc मिलान टैग या तो एंटीबॉडी के साथ जांच कर रहे थे एसडीएस पृष्ठ से और पश्चिमी सोख्ता के बाद अलग हो गए थे. खमीर उपभेदों 3 तालिका में संकलित हैं. पश्चिम बंगाल: पश्चिमी धब्बा. (ए) टीसीए उपजी WCE (Yok 2514 (बाईं ओर दो लेन) और Yok 2592 (सही पर दो लेन), (Δ0.2 आयुध डिपो / लेन) से) के प्रतिनिधि नमूने एक जेल दाग के साथ धुंधला करके देखे थे ( ) माल खंड देखें. (बी) के लेन 1 और 2: खमीर तनाव Yok 2510 और Yok 251 के homogenates2 युक्त गैलेक्टोज-overexpressed Siz1-V5/6xHIS. आंशिक रूप से अपमानित प्रोटीन टुकड़े के अभाव ध्यान दें. एक विरोधी वी 5 एंटीबॉडी के साथ जांच जब अज्ञात कारणों के लिए, इस विशेष नमूना sumoylated adducts खुलासा नहीं करता है. हालांकि, sumoylation चित्र में दिखाया गया के रूप में एक विरोधी सूमो (विरोधी Smt3) एंटीबॉडी के साथ पाया जा सकता है. -1 डी. (सी) लेन 3 व 4: गैलेक्टोज-overexpressed Siz1Δ440 हा युक्त खमीर तनाव Yok 2508 और Yok 2509 के homogenates. (डी) लेन 5, 6 और 7: गैलेक्टोज-overexpressed Siz1-V5/6xHIS सह 2 का उपयोग कर शुद्ध किया गया था + धातु आत्मीयता 200 मिमी imidazole साथ eluted राल, और विरोधी वी 5 (5 लेन), विरोधी Smt3 (लेन के साथ जांच 6). लेन 7 विरोधी वी 5 एंटीबॉडी के साथ 6 लेन का एक reprobe है. और दोनों Siz1 और sumoylated Siz1 adducts (Smt3 एन) से पता चलता है. (ई) 8 लेन: Myc टैग Siz1 (Yok 2397) की अंतर्जात स्तर वाले JD52 wildtype कोशिकाओं. मंजूरी दे दी एक स्तनधारी lysis बफर का उपयोग कर तैयार lysate. लेन 9: Lyविरोधी वी 5 agarose के साथ एक 2 घंटे ऊष्मायन के बाद सतह पर तैरनेवाला पूरा करना. Siz1 की sumoylated adducts ध्यान दें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. के शोधन से अधिक व्यक्त कूपन धातु आत्मीयता राल के साथ प्रोटीन युक्त रिंग डोमेन. इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में गैलेक्टोज प्रेरण, प्रोटीन निष्कर्षण और शुद्धि प्रदर्शन किया गया. शोधन guanidinium हाइड्रोक्लोराइड राल के साथ ऊष्मायन से पहले 6 एम के लिए नमूने के लिए जोड़ा गया है, जिसके लिए देशी शर्तों और denaturing शर्तों के तहत किया गया था. Lysate दोनों एमाइलोज नियंत्रण राल (ए) और नाखून धातु आत्मीयता राल (टी) के साथ घुमाया था. प्रोटीन क्षालन बफर में 200 मिमी imidazole साथ eluted थे. नमूने एसडीएस पृष्ठ से अलग कर दिया और पश्चिमी मिट गया(पश्चिम बंगाल) उपयुक्त मिलान टैग के लिए एक एंटीबॉडी के साथ. ए) गैलेक्टोज प्रेरित Slx5-V5/6xHIS (Yok 2096) बी) गैलेक्टोज प्रेरित Slx5-जीएसटी (Yok 2071) था दोनों देशी और denaturing शर्तों के तहत कूपन राल के साथ शुद्ध किया गया था देशी में कूपन राल के साथ शुद्ध, लेकिन शर्तों denaturing नहीं. ठीक से मुड़ा हुआ जब मुमकिन है, धातु समन्वय रिंग डोमेन कूपन राल के साथ सूचना का आदान प्रदान. सी) गैलेक्टोज प्रेरित Siz1Δ440 हा (Yok 2353) भी मूल में कूपन राल के साथ शुद्ध, लेकिन शर्तों denaturing नहीं किया गया था. ये प्रोटीन 6xHIS टैग शामिल नहीं है, लेकिन प्रत्येक स्वाभाविक Zn 2 + आयनों निर्देशांक और ठीक से मुड़ा हुआ जब आंतरिक रूप से कूपन धातु आत्मीयता राल बाध्य करने की क्षमता प्रदान कर सकते हैं जो एक रिंग डोमेन, नियंत्रित करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. कूपन धातु आत्मीयता राल पर व्यक्त प्रोटीन की सह शुद्धि.
JD52 कोशिकाओं (उपभेदों YOKs 2353, 2402 2224 क्रमशः) में - (/) Slx5-जीएसटी और Siz1Δ440 हा स्वयं द्वारा या संयोजन में व्यक्त किया गया. प्रोटीन के रूप में वर्णित निकाले गए थे (WCE) और lysates कूपन धातु आत्मीयता राल (देखें चित्र 2) के साथ nutated गया. प्रोटीन क्षालन बफर (eluate) में 200 मिमी imidazole साथ राल से eluted और एलडीएस नमूना बफर में तैयार किए गए थे. प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे और पश्चिमी सोख्ता के बाद हा टैग या उचित रूप में जीएसटी टैग के लिए एक एंटीबॉडी के साथ जांच कर रहे थे. प्रोटीन के बराबर लोडिंग एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में PGK के साथ की पुष्टि की है. Slx5 शुद्धि Siz1Δ440 की उपस्थिति में बढ़ाया है कि ध्यान दें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
| समाधान | अवयव | टिप्पणियां |
|---|---|---|
| 3x वाई ई पी | DDH 2 हे की 700 मिलीलीटर में 30 ग्राम खमीर निकालें 60 ग्राम Peptone | अवयवों मिश्रण और बाँझ आटोक्लेव. जब उपयोग के लिए तैयार 3x वाई ई पी की व्यक्तिगत aliquots के लिए 6% से फिल्टर निष्फल गैलेक्टोज जोड़ें |
| टीसीए नमूना बफर | 15% ग्लिसरॉल 80 मिमी Tris बेस (गैर pH'd) 3.5% एसडीएस bromophenol नीले "स्वाद के लिए." मात्रा DDH 2 हे के साथ 25 मिलीलीटर लाओ | इससे पहले का उपयोग करें: 1 मिलीलीटर टीसीए नमूना बफर करने β-mercaptoethanol के 40 μl (बीएमई) जोड़ |
| बफर धो | 50 मिमी HEPES पीएच 7.3 200 मिमी NaCl 1% ट्राइटन X-100 20 मिमी imidazole | Imidazole नी 2 के लिए इस्तेमाल किया + या सह 2 धातु आत्मीयता शुद्धि ही |
| Lysis बफर | 50 मिमी HEPES पीएच 7.3 200 मिमी NaCl 1% ट्राइटन X-100 10 मिमी imidazole 1x protease अवरोध कॉकटेल तुरंत उपयोग करने से पहले protease अवरोध कॉकटेल जोड़ें. Imidazole + या सह 2 धातु आत्मीयता शुद्धि ही नी 2 के लिए इस्तेमाल किया. वैकल्पिक: 25 मिमी एन ethylmaleimide (सिस्टीन protease अवरोध, sumoylation संरक्षित करने के लिए), 1 मिमी सोडियम orthovanadate (प्रोटीन tyrosine फॉस्फेट अवरोध), और / या अध्ययन के विशिष्ट क्षेत्र के आधार पर अन्य अनुभव से निर्धारित प्रोटीज अवरोधकों | |
| क्षालन बफर | 50 मिमी HEPES पीएच 7.3 200 मिमी NaCl 200 मिमी imidazole | Imidazole + या सह 2 धातु आत्मीयता शुद्धि ही नी 2 में हिस्टडीन बाध्यकारी साइटों के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. क्षालन के अन्य तरीकों अलग आत्मीयता रेजिन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. |
| अर्ध शुष्क स्थानांतरण बफर (10x) | 58 ग्राम Tris 29.3 ग्राम ग्लाइसिन 18.75 मिलीलीटर 20% एसडीएस: DDH 2 हे 1 एल में | मिश्रण 200 मिलीलीटर मेथनॉल और 700 एमएल DDH 2 ओएस के साथ 100 मिलीलीटर 10x अर्ध शुष्क स्थानांतरण बफर: 1x अर्ध शुष्क स्थानांतरण बफर बनाने के लिए |
| Tris (टीबीएस, 10x) खारा buffered | 50 मिलीलीटर 1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 8.0 150 मिलीलीटर 5 एम NaCl 300 मिलीलीटर DDH 2 हे | 1x TBST के बनाने के लिए, 900 मिलीलीटर DDH 2 हे के साथ 100 मिलीलीटर 10x टीबीएस मिश्रण और बीच 20 में से 1 मिलीलीटर जोड़ें |
तालिका 1. समाधान और बफ़र.
| आवेदन | प्रकोष्ठों की राशि | अगला चरण |
|---|---|---|
| सेल | काटा सेल गोली की 150-200 ods | चरण 2 में वर्णित के रूप में पिटाई मनका |
| WCE के वेस्टर्न ब्लाट | तैयार lysed कोशिकाओं के 2 ods | कदम 2.6 में वर्णित के रूप में टी सी ए तेज़ी से पश्चिमी धब्बा के लिए तैयार करते हैं. Δ0.3 आयुध डिपो इकाइयों (Δ15 μl) जेल पर रन आउट |
| आत्मीयता शोधन और / या हटाने | Lysed कोशिकाओं के 30 ods | बाँध, elute, और कदम 3.2 और 3.3 में वर्णित के रूप में प्रोटीन तैयार |
| लगभग 1-2 ODS (कदम 3.3 में के रूप में तैयार हो तो) | पश्चिमी धब्बा के रूप में 3.4 कदम में वर्णित |
तालिका 2. इस प्रोटोकॉल के लिए आवेदन का सारांश.
| नाम | प्रासंगिक जीनोटाइप या जनक तनाव | प्लाज्मिड (ओं) या कैसेट प्रविष्टि | संदर्भ |
|---|---|---|---|
| Yok 2062 | माता ura3 -52 HIS3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ63 lys2-801 | DOHMEN एट अल., 1995 | |
| Yok 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (बॉक 629, OpenBiosystems खमीर जीएसटी संग्रह YSC4515-202484078) | इस अध्ययन |
| Yok 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6 TOPO (बॉक 390) | इस अध्ययन |
| Yok 2224 | JD52 | GAL1/10-जीएसटी Slx5 (बॉक 629, OpenBiosystems खमीर जीएसटी संग्रह YSC4515-202484078); pRS425 (बॉक 343) | इस अध्ययन |
| Yok 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440 हा (बॉक 795) | इस अध्ययन |
| Yok 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogenously टैग किए गए) | इस अध्ययन |
| Yok 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (बॉक 629, OpenBiosystems खमीर जीएसटी संग्रह YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440 हा (बॉक 795) | इस अध्ययन |
| Yok 2501 | MHY3765, अल्फा संभोग प्रकार, ura3 -52, lys2-801, trp1-Δ63, HIS3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, चटाई alpha2Δ :: kanMX | झी एट अल., 2010 |
| Yok 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 चटाई alpha2Δ :: kanMX (Yok 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440 हा (बॉक 795) | इस अध्ययन |
| Yok 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, चटाई alpha2Δ :: kanMX (Yok 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (बॉक 629, OpenBiosystems खमीर जीएसटी संग्रह YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440 हा (बॉक 795) | इस अध्ययन |
| Yok 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, चटाई alpha2Δ :: kanMX (Yok 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (बॉक 898); pRS425 (बॉक 343) | इस अध्ययन |
| Yok 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, चटाई alpha2Δ :: kanMX (Yok 2501) | Slx5-एक प्रोटीन (बॉक 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (बॉक 898) | इस अध्ययन |
| Yok 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (Yok 2397) | msn5Δ :: hygromycin | इस अध्ययन |
| Yok 2592 | JD52 में msn5Δ :: hygromycin (Yok 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | इस अध्ययन |
| Yok 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6 TOPO (बॉक 898) | इस अध्ययन |
तालिका 3. खमीर उपभेदों.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल बरकरार, देशी की तैयारी पर केंद्रित है, और बाद translationally डाउन स्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए नवोदित खमीर कोशिकाओं से प्रोटीन संशोधित. इस प्रोटोकॉल का प्रयास करने से पहले, यह ब्याज की प्रोटीन आसानी से स्थितियों 12 denaturing तहत तैयार प्रोटीन निष्कर्षों में पाया जा सकता है, तो यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं, तो यह संलयन प्रोटीन पश्चिमी blots पर पता लगाया जा सकता है कि इतनी टैग ब्याज की प्रोटीन का मिलान करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम हा, 6xHIS-वी 5, या Myc मिलान टैग के साथ SIZ1 टैग किया और इस रणनीति हमें स्पष्ट रूप से पश्चिमी blots (चित्रा 1) पर प्रोटीन और उसके sumoylated रूपों की पहचान करने की अनुमति दी. उच्च आत्मीयता विरोधी GFP एंटीबॉडी (नहीं दिखाया डेटा है) प्राप्त करने के लिए मेहनत कर रहे हैं संभवतः क्योंकि हम GFP टैग प्रोटीन का पता लगाने के कम सफलता मिली. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर से संबंधित है. व्यक्ति का स्तरप्रोटीन 4 नवोदित खमीर कोशिकाओं में व्यापक रूप से भिन्न है और कुछ प्रोटीन वे पता लगाया है और / या शुद्ध किया जा सकता है ताकि overexpressed किया जाना है. Galactose-inducible वैक्टर ब्याज 2 की खमीर जीन की उच्च स्तर की अभिव्यक्ति के लिए उपलब्ध हैं. Chromosomally टैग ORFs या से मजबूत inducible गैलेक्टोज प्रवर्तक के नियंत्रण में व्यक्त की है जब एक प्लाज्मिड (चित्रा 1). से व्यक्त जब Siz1 के मामले में, हम पूरी लंबाई या छोटा प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम थे truncations के उपयोग / समारोह विश्लेषण संरचना में उपयोगी हो सकता है या पूरी लंबाई अणु व्यक्त करने के लिए मुश्किल या अस्थिर है. गैलेक्टोज प्रेरित overexpression के प्रोटीन का पता लगाने और शुद्धि को बढ़ाता है जबकि संभावित सेल चक्र विशिष्ट बाद translational संशोधनों और बातचीत की शारीरिक प्रासंगिकता का अध्ययन कर रहा है, यह स्पष्ट सीमाएँ हैं. उदाहरण के लिए, Siz1 की sumoylation सेल चक्र के जी 2 / एम चरण में सबसे अधिक प्रचलित है, और संशोधनों या बातचीत कीoverexpressed प्रोटीन अन्य प्रयोगात्मक साधन के द्वारा पुष्टि करने के लिए हो सकता है. अंत में, विशिष्ट प्रोटीज, फॉस्फेट, और / या एंटीबॉडी inhibitors के अलावा इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है. आम तौर पर, सबसे अच्छा परिणाम कोशिकाओं जमे हुए और निष्कर्षण और कमजोर पड़ने बफ़र्स में कर रहे हैं इससे पहले इन अवरोधकों को जोड़ने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. यह बाद में धातु आत्मीयता purifications के साथ हस्तक्षेप कर सकता है ईडीटीए, protease अवरोध कॉकटेल में कभी कभी वर्तमान एक धातु आयन chelator, के अलावा उचित नहीं है.
मनका पिटाई से प्राप्त प्रोटीन अर्क अच्छी तरह से व्यक्ति प्रोटीन की शुद्धि के लिए सामग्री शुरू करने के रूप में उपयुक्त हैं. विशेष रूप से, हम एक 6xHIS आत्मीयता टैग ले जाने overexpressed Slx5 एक धातु आत्मीयता राल (2A चित्रा) का उपयोग WCEs से शुद्ध किया जा सकता है. बाद translational संशोधनों के संरक्षण और प्रोटीन गिरावट को कम करने के लिए, 6xHIS टैग प्रोटीन अक्सर denaturing परिस्थितियों में शुद्ध कर रहे हैं5. हालांकि, देशी परिस्थितियों में प्रोटीन की शुद्धि के साथ जुड़े अलग फायदे हैं. उदाहरण के लिए, ये प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों के साथ सहयोग को शुद्ध कर सकते हैं या इन विट्रो assays 13,14 में बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है. Siz1 और Slx5 के मामले में हम serendipitously दोनों प्रोटीन 6xHIS टैग की स्वतंत्र धातु आत्मीयता राल, के लिए आंतरिक आत्मीयता दिखा रहे हैं, और इस अवलोकन दोनों प्रोटीन देशी पुष्टियों मान लिया है कि हमें करने के लिए सुझाव दिया है कि निर्धारित. दुर्भाग्य से, शुद्ध प्रोटीन की उचित तह और जैविक गतिविधि के मामले के आधार पर एक मामले पर निर्धारित किया गया है. यह अंत करने के लिए, या तो अमीनो या carboxy टर्मिनस पर आत्मीयता और मिलान टैग की नियुक्ति, बहुत संलयन प्रोटीन की गतिविधि या स्थिरता को प्रभावित और एक प्रोटीन शुद्धि रणनीति की योजना में एक महत्वपूर्ण विचार है सकते हैं.
भविष्य के काम परीक्षा के लिए शुद्धि के दौरान बाद translational संशोधनों को बढ़ाने के लिए पर ध्यान दिया जाएगाप्रोटीज कमी खमीर उपभेदों, विभिन्न प्रोटीज inhibitors, या अन्य आत्मीयता टैग के उपयोग के माध्यम मिसाल. हम अपने वर्तमान या बफर अनुकूलित रूप में इस प्रोटोकॉल में कई नवोदित खमीर प्रोटीन की स्केलेबल निष्कर्षण, शुद्धि और बाद के अध्ययन के लिए लागू है कि अनुमान है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम उनके समर्थन के लिए KERSCHER प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद. हम खमीर तनाव MHY3765 के लिए मार्क Hochstrasser धन्यवाद. इस काम NSF अनुदान 1051970 (ठीक करने के लिए) और एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अंडर यात्रा अनुदान और मुनरो विद्वान कार्यक्रम अनुदान (ते के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
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- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
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- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
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- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
