Summary
De bereiding van hoogwaardige gist celextracten is een noodzakelijke eerste stap in de analyse van afzonderlijke eiwitten of hele proteomen. Hier een snelle, efficiënte en betrouwbare homogeniseren protocol voor gist cellen die is geoptimaliseerd om proteïnefuncties, interacties, en post-translationele modificaties behouden beschrijven we.
Abstract
Homogenisatie door kraal slaan is een snelle en efficiënte manier om DNA, RNA, eiwitten, metabolieten en bevrijden van gist cellen, die notoir moeilijk te verstoren. Hier beschrijven we het gebruik van een parelmolen homogenisator voor de extractie van eiwitten in buffers geoptimaliseerd om de functies interacties en post-translationele modificaties van eiwitten behouden. Logaritmisch groeiende cellen die het eiwit van belang worden gekweekt in een vloeibaar kweekmedium van keuze. De groeimedia kan worden aangevuld met reagentia om eiwitexpressie te induceren van induceerbare promoters (bijv. galactose), synchroniseren celcyclus stadium (bv. nocodazole), of remmen proteasoomfunctie (bijv. MG132). De cellen worden vervolgens gepelleteerd en geresuspendeerd in een geschikte buffer die protease en / of fosfatase remmers en worden hetzij onmiddellijk verwerkt of bevroren in vloeibare stikstof voor later gebruik. Homogenisatie bewerkstelligd door zes cycli van 20 sec bead-beating (5,5 m / s), elk gevolgd door een minuut incubatie op ijs. Het resulterende homogenaat wordt geklaard door centrifugeren en kleine deeltjes kunnen worden verwijderd door filtratie. De resulterende gewist gehele celextracten (WCE) wordt geprecipiteerd met 20% TCA als directe analyse van alle eiwitten door SDS-PAGE gevolgd door Western blotting. Extracten zijn ook geschikt voor affiniteitszuivering van specifieke eiwitten, de detectie van post-translationele modificaties, of de analyse van medezuiverende eiwitten. Zoals het geval voor de meeste eiwitzuivering protocollen, kunnen sommige enzymen en eiwitten vereisen unieke omstandigheden of buffer samenstellingen voor hun zuivering en anderen instabiel of onoplosbaar genoemde voorwaarden zijn. In het laatste geval kan het protocol gepresenteerd een goed uitgangspunt verschaffen empirisch bepalen van de beste kraal-beating strategie voor eiwit-extractie en zuivering. We tonen de winning en zuivering van een epitoopgemerkte SUMO E3 ligase, Siz1, een celcyclusgereguleerd eiwit dat wordt zowel sumoylated en gefosforyleerd, en een SUMO-gerichte ubiquitine ligase subeenheid Slx5.
Introduction
De ontzagwekkende kracht van gistgenetica is legendarisch, maar de voorbereiding en analyse van de natieve eiwitten uit gist Saccharomyces cerevisiae, is vaak beladen met problemen. Dit laatste is het gevolg van de aanzienlijke mechanische sterkte en elasticiteit van de gistcelwand 1. Verschillende middelen zijn beschreven voor de enzymatische, chemische, mechanische en druk gebaseerde verstoring van gistcellen whole-cell-extract te verkrijgen 2-6. Deze technieken verschillen sterk in hun effectiviteit om cel-vertegenwoordiger, natieve proteïne extracten die kan worden gebruikt voor verdere analyses of zuiveringsstappen leveren. Bijvoorbeeld, kan de gist celwand met lytische enzymen (bijv. zymolyase) en resulterende spheroblasts verwijderd kan worden verstoord door afschuiving, detergenten of osmotische lysis om eiwitten vrij. Deze aanpak is met succes toegepast als het startpunt voor vele subcellulaire fractioneringen maar het vereist langdurige incubatiedie niet verenigbaar zijn met de stabiliteit van sommige eiwitten 7.
Proprietary gist lysis reagens (zoals detergenten) voor de chemische extractie van eiwitten van gistcellen in de handel verkrijgbaar, maar de doeltreffendheid van deze reagentia in eiwitextractie en hun effect op verdere biochemische karakterisatie van eiwitten is niet altijd duidelijk 8. Hoge druk homogenisatoren, vaak aangeduid als Franse persen, effectief te breken gistcellen door eerst te onderwerpen aan hoge druk en vervolgens extruderen ze via een kleine opening in een drukcel. Deze techniek produceert hoogwaardige extracten maar de apparatuur is erg duur en niet geschikt voor kleine hoeveelheden cellen of meerdere monsters 9. Daarom mechanische verbreking van gistcellen in een parelmolen is vaak de methode voor natieve gisteiwit preparaten 10. Deze techniek houdt mechanische verbreking van de gist celwand met zuur-waschuur glasparels, die kan worden uitgevoerd met diverse shakers, vortexers of parelmolens. Met name kan deze methode worden gebruikt om meerdere kleinere monsters (1 ml cellen of minder) tegelijkertijd verwerken. Veel verschillende kralen of parelmolen verstoring matrices zijn nu commercieel beschikbaar voor bijna elke vorm van celtype in 2 ml buizen verstoren. Gezien de andere technieken en apparatuur, een parelmolen heeft het voordeel dat verstoring van gistcellen komt zeer snel, wat helpt bij post-translationele modificaties zoals sumoylation behouden, vooral wanneer de geschikte buffers met protease en / of proteasome inhibitors worden gebruikt en de temperatuur van extracten wordt geregeld.
Dit protocol is gericht op de snelle, efficiënte en betrouwbare extractie van endogene en overexpressie gebrachte eiwitten onder milde omstandigheden met het uiteindelijke doel om eiwitfunctie, interacties, en post-translationele modificaties behouden. Groeimedia, cellysebuffersamenstellingen en parelmolen instellingen worden geoptimaliseerd eiwit interacties en post-translationele modificaties zoals sumoylation en ubiquitinering handhaven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zuivering van 6XHis-gemerkte eiwitten uitgedrukt in ontluikende gistcellen onder natieve omstandigheden
1. Groei van gistcellen en inductie van eiwitexpressie
(Modified van 2)
OPTIONEEL: Gebruik logaritmisch groeiende gist-kweken die eiwit van belang in plaats van de galactose-geïnduceerde kweken beschreven.
- Transformeren cellen van een Gal + giststam met een plasmide dat codeert voor een galactose-induceerbare 6XHis gemerkte eiwit keuze. Bijvoorbeeld, zie lijst reagentia.
- Inoculeer transformanten in 5 ml geschikte selectieve media (bijv. SD-uracil) bevattende 2% sucrose. Incubeer bij 30 ° CO / N, roterende.
- Verdun O / N kweek, zodat de optische dichtheid bij 600 nm meet 0,3 (OD 600 = 0,3) in 33 ml selectief medium met 2% sucrose. Groeien bij 30 ° C, onder schudden (Δ150 rpm).
- Als de cultuur heeft bereikt OD 600 = 0.8-1.5, Induceren de expressie van het gewenste eiwit door toevoeging van 17 ml YEP 3x met 6% galactose (recept in tabel 1), voor een uiteindelijke concentratie van 1 x YEP met 2% galactose. Totale cultuur volume is nu 50 ml. Incubeer onder schudden bij 30 ° C gedurende nog eens 5-6 uur.
Opmerking: het volume cultuur kan worden gevarieerd. In stap 1.3, verdund in tweederde van de gewenste uiteindelijke volume. In stap 1.4, voegen een-derde het eindvolume 3x YEP / 6% galactose. - Meet de OD 600 van de geïnduceerde kweek en centrifugeer Δ150-200 OD 600 eenheden van cellen gedurende 5 min bij 5000 rpm bij 4 ° C.
- Resuspendeer celpellet met 1 ml ijskoude PBS 1x met 1x proteaseremmer cocktail en transfer naar een 2 ml schroefdop buis.
- Centrifugeer cellen gedurende 1 min bij 15.000 rpm bij 4 ° C. Decanteren supernatant.
- Snap freeze celpellet in vloeibare stikstof, gevolgd door onmiddellijk cellysis of opslag bij -80 ° C tot verder gebruik.
- Om de bevroren celpellet uit de vorige stap, voeg 200 pl zuur gewassen glazen parels en 500 ui ijskoude lysis buffer (recept in tabel 1 of gebruik cellysis buffer van keuze).
- Kort pipet op en neer. Het is niet noodzakelijk volledig resuspendeer de cel pellet. Houd buizen op ijs te allen tijde.
Opmerking: Het einde van de pipet tip kan worden afgesneden vóór en neer te pipetteren. - Bij 4 ° C, plaats de buis (s) met cellen in de kraal molen, balans, slot, en laat de machine volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer de kraal klopper met de tube (s) gedurende 20 sec bij 5,5 m / sec, dan plaats op slushy ijs gedurende 1 minuut. Herhaal 6x in totaal.
- Schakel het geëxtraheerde proteïnen door centrifugeren gedurende 15 min bij 15.000 rpm bij 4 ° C. OPTIONEEL: verwijder kleine deeltjes door centrifugeren door een Spinx filter.
- Bereid een monster van de gehele cel eitpakken (WCE) de aanwezigheid van het eiwit van belang bevestigen Western Blot:
- Voeg WCE overeenkomend met 2 OD 600 eenheden van cellen (bijvoorbeeld 5 pl ontruimd extract als 200 OD 600 eenheden van de cellen werden geoogst) tot 800 ul 20% trichloorazijnzuur (TCA). Vortex te mengen.
- Centrifugeer gedurende 2,5 min bij 15.000 rpm bij 4 ° C. Schenk de bovenstaande vloeistof, maar wees voorzichtig om de pellet te behouden.
- Voeg 800 ul van 2% TCA de pellet en vortex de buis gevolgd door centrifugatie gedurende 2,5 min bij 15.000 rpm bij 4 ° C. Schenk de bovenstaande vloeistof, maar wees voorzichtig om de pellet te behouden.
- Voeg 100 ul van TCA Sample Buffer (recept in tabel 1), vortex om pellet op te lossen. Opmerking: Als het monster buffer wordt zuur (geel wordt) na toevoeging aan de pellet, fracties van Δ10 ui Trisbase toevoegen [1M] totdat het monster is weer blauw.
- Incubeer in een 100 ° C warmte-blok voor 2-5 minuten.
- Vortex again om volledig te ontbinden indien restanten van pellet zijn nog aanwezig. Pellets middels deze methode bereid zijn notoir moeilijk volledig oplossen. Het kan Δ10 min van vortexen tot pellets volledig op te lossen nemen.
- WINKEL monster bij -80 ° C tot verder gebruik.
- Snap bevriezen aliquots resterende vrijgemaakt WCE in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik.
3. Batch Zuivering van eiwitten uit gist celhomogenaten
Opmerking: Deze zuiveringswerkwijze werd geoptimaliseerd voor de zuivering van 6XHis gemerkte eiwitten on Co2 + metaalaffiniteitshars.
- Hars Equilibration
- Voor een steekproef van ontruimd WCE bereid uit Δ20-40 OD 600 eenheden van cellen, voeg 50-100 ul van affiniteithars een microcentrifugebuis. Eiwitten geëxtraheerd uit cellen die niet het gewenste eiwit of een niet-specifieke hars zoals amylose heeft uitgesproken, kan worden gebruikt als controles voor niet-specifieke binding.
- Was 5x hars met 1 ml wasbuffer: invertsuiker top-over-bottom totdat hars opnieuw gesuspendeerd en vervolgens draaien gedurende 1 min bij 5000 rpm bij 4 ° C. Het supernatans aspireren.
Opmerking: als het uitvoeren van extractie en zuivering op dezelfde dag, kan hars evenwicht worden uitgevoerd voorafgaand aan extractie.
- Eiwit Bindende voor Affinity Purification
- Zet 100-200 pi geklaard lysaat (Δ20-40 OD 600 eenheden) tot 50-100 ul gewassen kralen, en brengen het totaal volume aan met lysebuffer 1 ml.
- Incubeer met nutatie of schommelen bij 4 ° C gedurende 2-5 uur.
- Draai gedurende 1 min bij 5000 rpm bij 4 ° C.
- Schrijf desgewenst een monster van het resterende supernatant voor verdere analyse van de niet-gebonden eiwitten. TCA neerslaan zoals hierboven voor de WCE (stap 2.6).
- Wassen met hars gebonden eiwitten 5x met 1 ml wasbuffer, gevolgd door een rotatie gedurende 1 min bij 5000 rpm bij4 ° C. Houd monsters koud tijdens wasbeurten.
- Elutie van gebonden eiwitten
- Voeg 150 ul elutiebuffer om hars nutate bij 4 ° C gedurende 5 min, rotatie gedurende 1 min bij 5000 rpm bij 4 ° C en bewaar het supernatant in een nieuwe buis. OPTIONEEL: Herhaal 2x en zwembad eluties.
- Bereid uitgewassen steekproef voor Western Blot: Om 25 ul van geëlueerde eiwitten, voeg 25 ul 2x lithium-sulfaat (HLD) monsterbuffer met 2 pl β-mercapto-ethanol (BME) en incubeer in een 100 ° C hitte blok gedurende 2 minuten.
Opmerking: Standard 2X Laemmli monster buffer kunnen ook worden gebruikt. - Snap bevriezen overtollige geëlueerde eiwit in vloeibare stikstof.
OPTIONEEL: strip overgebleven eiwitten uit hars met een gelijk volume van 2x LDS monsterbuffer bij 65 ° C gedurende 5 minuten, verwijder de LDS geëlueerde eiwitten naar een nieuwe buis en voeg 2 pl BME de geëlueerde eiwitten niet aan de hars. Deze volgorde is om het verwijderen van alle ionen of antilichamen die conjuga voorkomented aan de kralen. - WINKEL monsters bij -80 ° C tot verder gebruik.
- Western Blot en probe met geschikte antilichamen tegen eiwitten te visualiseren.
- Laad 10-20 pl (Δ1-3 OD 600 eenheden) van elk monster en 3-10 ul van een eiwit ladder in een SDS-PAGE gel van keuze. Gels routinematig gebruikt voor dit protocol zijn 4-12% Bis-Tris en 8% Tris-Glycine.
- Voer gel bij 200 V gedurende 50 minuten.
- Transfer van eiwitten gel een PVDF membraan door semi-droge overdracht bij 19 V gedurende 20-30 min (recept in tabel 1).
- Blok membraan 4% milk/1x Tris gebufferde zoutoplossing TWEEN (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C (recept in tabel 1).
- Incubeer membraan met primair antilichaam tegen het epitoop-gemerkte eiwit plaats in 4% milk/1x TBST gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C.
- Was 3x membraan voor elk 1 x 5 minuten TBST.
- Incubeer membraan met de juistesecundaire mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd antilichaam gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur.
- Was 3x membraan gedurende 15 minuten elk in een groot volume 1x TBST.
- Bedek membraan met ECL substraat en wikkel in Saran Wrap.
- Blootstellen membraan te filmen en te ontwikkelen om eiwitten te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve resultaten blijkt dat de beschreven kraal-beating en eiwitextractie protocol is bruikbaar voor de reproduceerbare bereiding van eiwitten voor verschillende stroomafwaartse toepassingen (samengevat in tabel 2). SDS-PAGE gevolgd door Coomassie kleuring van WCEs blijkt dat een groot aantal proteïnen (~ 12 tot> 250 kDa) reproduceerbaar kunnen worden geëxtraheerd uit gist cellen (Figuur 1A). Discrete banden over een reeks molecuulgewichten indicatie van hoge kwaliteit eiwitextracten. De kwaliteit van de extracten kan worden bevestigd door western blotting specifieke epitoop-gemerkte eiwitten. Getoond wordt een representatief resultaat voor de galactose-overexpressie, V5-gelabeld SUMO ligase Siz1 die migreert bij Δ120kDa (Figuur 1B). In het algemeen, zou gedeeltelijk afgebroken eiwitten draaien als meerdere fragmenten onder de verwachte gewicht, maar hier alleen volledige lengte eiwit wordt waargenomen. Daarnaast hoog molecuulgewicht adducten van een bepaald eiwitkan wijzen post-translationele modificaties. Zo tonen we galactose-overexpressie sumoylated Siz1Δ440 en volledige lengte Siz1 (figuur 1C en fig. 1D). Modificaties kunnen ook worden bewaard op endogeen tot expressie Siz1 (figuur 1E).
We bepalen representatieve resultaten die twee nucleaire eiwitten verrijkte, Slx5 en Siz1Δ440, succesvol werden gezuiverd Aanbevolen WCEs (Figuren 2A, 2B en 2C). Met name wordt aangetoond dat een 6XHis gemerkt eiwit (Figuur 2A; Slx5) affiniteit gezuiverd Aanbevolen WCEs zowel onder natieve en denaturerende omstandigheden kan worden. In tegenstelling, Slx5-GST (Figuur 2B) en Siz1Δ440-HA (figuur 2C) missen een 6xHis epitoop maar onder natieve omstandigheden nog steeds interactie met het metaal-affiniteit hars in een imidazol-gevoelige manier. We stellen Siz1, en in mindere mate SLX5, kunnen de metaal-affiniteitshars via hun metaal-coördinerende RING domein binden. Terwijl onze kennis, dit fenomeen is nog niet gerapporteerd, is een soortgelijke situatie beschreven waarin cholera toxine B subeenheid bindt Ni2 + affiniteitshars op een wijze gemedieerd door zijn natuurlijke histidine residuen 11. Belangrijk is dat deze waarneming suggereert dat eiwitten in de WCE zijn, althans gedeeltelijk, native gevouwen.
Speciaal voor de studie van eiwitfunctie is het belangrijk te zien dat eiwitcomplexen intact geheel celextracten. Onze representatieve gegevens blijkt dat Siz1Δ440, Slx5, en PGK1 (een cytosolisch eiwit dat fungeert als een laad controle) aanwezig in WCEs waren. Siz1Δ440 werd gezuiverd uit extracten op basis van zijn inherente vermogen om te binden aan metalen affiniteitsharsen (vergelijk figuur 2C). Wanneer Slx5 en Siz1 werden tezamen in gistcellen werden Slx5 niveaus in de eluaten toegenomen,het verhogen van de mogelijkheid dat Slx5 kunnen interageren met Siz1 (figuur 3).
Figuur 1. Aanwezigheid van intacte en sumoylated eiwitten in gist cellysaat na extractie. Tenzij anders vermeld gehele celextracten werden bereid zoals beschreven in dit protocol. Monsters werden gescheiden door SDS-PAGE en na Western blotting werden gemerkt met antilichamen tegen het HA, V5 of myc epitoop ofwel markeringen. Giststammen worden samengevat in tabel 3. WB: western blot. (A) Representatieve monsters van de TCA-neergeslagen WCE (vanaf YOK 2514 (twee rijstroken aan de linkerkant) en YOK 2592 (twee rechtse rijvakken), (Δ0.2 OD / laan)) werden gevisualiseerd door kleuring met een gel vlek ( zie sectie Materials). (B) Lane 1 & 2: homogenaten van giststam YOK 2510 en YOK 2512 bevattende galactose-overexpressie Siz1-V5/6xHIS. Let op de afwezigheid van gedeeltelijk afgebroken eiwitfragmenten. Om onbekende redenen is dit voorbeeld niet onthullen sumoylated adducten als gesondeerd met een anti-V5 antilichamen. Echter, sumoylation worden gedetecteerd met een anti SUMO (anti-SMT3) antilichaam zoals getoond in Fig. 1D. (C) Lane 3 & 4: homogenaten van giststam YOK 2508 en YOK 2509 met galactose-overexpressie Siz1Δ440-HA. (D) Lane 5, 6 en 7: galactose-overexpressie Siz1-V5/6xHIS werd gezuiverd met Co2 + metaalaffiniteitshars, geëlueerd met 200 mM imidazool, en gesondeerd met anti-V5 (laan 5), anti-SMT3 (lane 6). Laan 7 is een reprobe van baan 6 de anti-V5 antilichamen. en toont zowel Siz1 en sumoylated Siz1 adducten (SMT3 n). (E) Lane 8: JD52 wildtype cellen die endogene niveaus van myc-tagged Siz1 (YOK 2397). Geklaard lysaat bereid middels een zoogdier lysis buffer. Laan 9: Lysate supernatant na 2 uur incubatie met anti-V5 agarose. Opmerking sumoylated adducten van Siz1. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Zuivering van over-expressie RING-domein-bevattende eiwitten met Talon Metal Affinity hars. Galactose inductie, eiwit-extractie en zuivering werden uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol. Zuivering werd uitgevoerd onder natuurlijke omstandigheden en denaturerende omstandigheden, waarbij guanidinium hydrochloride werd aan het monster toegevoegd tot 6 M voor de incubatie met hars. Lysaat werd geroteerd met zowel amylose controle hars (A) en Talon Metal Affinity hars (T). Eiwitten werden geëlueerd met 200 mM imidazool in elutiebuffer. Monsters werden gescheiden door SDS-PAGE en Western blotting(WB) met een antilichaam tegen de juiste epitooplabel. A) galactose-geïnduceerde Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) werd gezuiverd met TALON hars onder zowel inheemse en denatureringsomstandigheden B) galactose-geïnduceerde Slx5-GST (YOK 2071) was gezuiverd met TALON hars in de moedertaal, maar niet denatureringsomstandigheden. Vermoedelijk, de metaal coördinerende RING domein interageert met TALON hars op de juiste wijze gevouwen. C) galactose-geïnduceerde Siz1Δ440-HA (YOK 2353) werd ook gezuiverd met TALON hars in de moedertaal, maar niet denatureringsomstandigheden. Deze eiwitten niet 6xHis tags bevatten, maar elk bevat een RING domein, dat van nature coördineert Zn 2 +-ionen en kan de mogelijkheid om intrinsiek binden Talon Metal Affinity hars op de juiste wijze gevouwen verlenen. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Co-zuivering van tot overexpressie gebrachte eiwitten op Talon Metal Affinity hars.
Slx5-GST en Siz1Δ440-HA werden uitgedrukt op zichzelf of in combinatie (+ / -) in JD52 cellen (respectievelijk stammen YOKs 2353, 2402, 2224). Eiwitten werden geëxtraheerd zoals beschreven (WCE) en lysaten werden nutated met Talon Metal Affinity hars (zie figuur 2). Eiwitten werden geëlueerd uit de hars met 200 mM imidazool in elutiebuffer (eluaat) vastgestelde en LDS monsterbuffer. Eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE en na Western blotting werden gemerkt met een antilichaam tegen het HA-tag of GST-tag als nodig. Gelijke belading van de eiwitten wordt bevestigd door PGK als beladingscontrole. Merk op dat Slx5 zuivering wordt versterkt in de aanwezigheid van Siz1Δ440. Klik hier voor grotere afbeelding .
| Oplossing | Onderdelen | Comments |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g gistextract 60 g pepton in 700 ml DDH 2 O | Meng ingrediënten en autoclaaf te steriliseren. Voeg filtergesteriliseerd galactose tot 6% aan individuele porties van 3x YEP wanneer het gebruiksklaar |
| TCA Sample Buffer | 15% glycerol 80 mM Tris Base (non-pH'd) 3,5% SDS broomfenolblauw "te proeven." Breng het volume tot 25 ml met DDH 2 O | Voor gebruik: voeg 40 ul van β-mercapto-ethanol (BME) tot 1 ml TCA Sample Buffer |
| Wash Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 20 mM imidazool | Imidazol gebruikt voor Ni 2 + of alleen + metalen affiniteitzuivering Co 2 |
| Lysis Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 10 mM imidazool 1x proteaseremmercocktail Voeg proteaseremmercocktail vlak voor gebruik. Imidazol alleen gebruikt + of Co 2 + metalen affiniteitzuivering voor Ni 2. OPTIONEEL: 25 mM N-ethylmaleimide (cysteine proteaseremmer te sumoylation behouden), 1 mM natriumorthovanadaat (proteïne tyrosine fosfatase inhibitor) en / of andere empirisch bepaalde proteaseremmers basis bepaald gebied van studie | |
| Elution Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 200 mM imidazool | Imidazol gebruikt om mee te dingen naar histidine bindingsplaatsen in Ni 2 + of Co 2 alleen + metal affiniteitzuivering. Andere werkwijzen voor elutie worden gebruikt voor verschillende affiniteit harsen. |
| Semi Dry Transfer Buffer (10x) | In 1 L van DDH 2 O: 58 g Tris 29,3 g Glycine 18,75 ml 20% SDS | Meng 100 ml 10x Semi Dry Transfer Buffer met 200 ml methanol en 700 ml DDH 2 O's: tot 1x Semi Dry Transfer Buffer maken |
| Tris gebufferde zoutoplossing (TBS, 10x) | 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 150 ml 5 M NaCl 300 ml DDH 2 O | Om 1x TBST, meng 100 ml 10x TBS met 900 ml DDH 2 O en voeg 1 ml TWEEN-20 |
Tabel 1. Oplossingen en buffers.
| Toepassing | Hoeveelheid cellen | Volgende stappen |
|---|---|---|
| Cell Lysis | 150-200 ODs van geoogst celkorrel | Kraal slaan zoals beschreven in stap 2 |
| Western Blot van WCE | 2 OD van gelyseerde cellen bereide | Bereid je voor Western Blot door TCA precipitatie zoals beschreven in stap 2.6. Δ0.3 OD-eenheden (Δ15 pl) draaien op gel |
| Affiniteitszuivering en / of Pulldown | 30 ODs van gelyseerde cellen | Bind, elueren, en bereiden eiwitten zoals beschreven in stap 3.2 en 3.3 |
| Ongeveer 1-2 OD (indien bereid als in stap 3.3) | Western blot zoals beschreven in stap 3.4 |
Tabel 2. Samenvatting van Toepassingen voor dit protocol.
| Naam | Relevante Genotype of Parent Strain | Plasmide (s) of Cassette inbrengen | Verwijzing |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATa ura3-52 his3-Δ200 leu2-3, 112 trp 1-Δ63 lys2-801 | Dohmen et al., 1995. | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gist GST collectie YSC4515-202484078) | deze studie |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | deze studie |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gist GST collectie YSC4515-202484078); pRS425 (BOK 343) | deze studie |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | deze studie |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogeen gelabeld) | deze studie |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gist GST collectie YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | deze studie |
| YOK 2501 | MHY3765, alfa mating type, ura3-52, LYS2-801, TRP1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX | Xie et al., 2010. |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | deze studie |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gist GST collectie YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | deze studie |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898); pRS425 (BOK 343) | deze studie |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | Slx5-Proteïne A (BOK 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | deze studie |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YOK 2397) | msn5Δ :: hygromycine | deze studie |
| YOK 2592 | msn5Δ :: hygromycine in JD52 (YOK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | deze studie |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | deze studie |
Tabel 3. Giststammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is gericht op de voorbereiding van intacte, inheemse, en post-translationeel gemodificeerde eiwitten uit gist cellen voor downstream-toepassingen. Voordat dit protocol, is het essentieel om te bepalen of het eiwit van belang gemakkelijk kan worden gedetecteerd in eiwitextracten bereid onder 12 denaturerende omstandigheden. Indien polyklonale antilichamen niet beschikbaar kan voordelig zijn om het epitoop tag eiwit van belang, zodat het fusie-eiwit kan worden gedetecteerd op Western blots. In het huidige protocol, we gelabeld SIZ1 met de HA, 6xHis-V5, of myc epitooplabels en deze strategie liet ons toe om de eiwitten en zijn sumoylated formulieren op Western blots (Figuur 1) duidelijk vast te stellen. We hadden minder succesvol detecteren van GFP-gemerkte eiwitten, mogelijk omdat een hoge affiniteit anti-GFP antilichamen zijn moeilijk te verkrijgen (data niet getoond). Een ander cruciaal punt betreft de expressie van het eiwit van belang. Niveau van individueleeiwitten variëren sterk in gist cellen 4 en sommige eiwitten moet overexpressie zodat ze kunnen worden gedetecteerd en / of gezuiverd. Galactose-induceerbare vectoren zijn beschikbaar voor de expressie van het gist-gen plaats 2 hoog niveau. Bij Siz1, konden we de volledige lengte of afgeknot eiwit te detecteren bij expressie van chromosomaal gelabeld ORFs of indien tot expressie onder controle van de sterke galactose induceerbare promotor van een plasmide (Figuur 1). Het gebruik van inkortingen nuttig zijn om structuur / functie analyse of wanneer de volledige molecule moeilijk te drukken of instabiel. Terwijl galactose-geïnduceerde overexpressie verbetert eiwit detectie en zuivering, heeft duidelijke beperkingen bij het bestuderen van de fysiologische relevantie van potentiële celcyclus specifieke post-translationele modificaties en interacties. Bijvoorbeeld sumoylation van Siz1 komt het meest voor bij G2 / M fase van de celcyclus en wijzigingen of interacties vande overexpressie eiwit kan worden bevestigd door andere experimentele middelen. Ten slotte worden specifieke protease, fosfatase en / of proteasome inhibitors is een belangrijke overweging voor het succes van dit protocol. In het algemeen worden de beste resultaten verkregen door deze remmers voor cellen worden bevroren en in extractie en verdunning buffers. De toevoeging van EDTA, een metaalion chelator soms aanwezig in proteaseremmer cocktails, is niet aan te raden als het kan interfereren met latere metalen affiniteit zuiveringen.
Eiwitextracten verkregen kraal-verslagen zijn geschikt als uitgangsmateriaal voor het zuiveren van individuele eiwitten. Specifiek wordt aangetoond dat overexpressie Slx5 die een 6xHis affiniteit tag kan worden gezuiverd uit WCEs met een metaalaffiniteitshars (Figuur 2A). Aan post-translationele modificaties behouden en te verminderen afbraak van eiwitten, zijn 6XHis-gemerkte eiwitten vaak gezuiverd onder denaturerende omstandigheden5. Er zijn verschillende voordelen van de zuivering van eiwitten onder natieve omstandigheden. Bijvoorbeeld kunnen deze eiwitten co-zuivert met bindingspartners of kunnen worden gebruikt in volgende in vitro assays 13,14. Bij Siz1 en Slx5 serendipitously we vastgesteld dat beide eiwitten vertonen intrinsieke affiniteit voor de metaalaffiniteitshars, onafhankelijk van de 6xHIS en deze waarneming ons voorgesteld dat beide eiwitten verondersteld natieve bevestiging. Helaas, juiste vouwing en biologische activiteit van gezuiverde eiwitten moet worden bepaald op een geval tot geval. Daartoe de plaatsing van affiniteit en epitooplabels aan hetzij de amino-of carboxy-uiteinde, kan grote invloed op de activiteit of stabiliteit van fusie-eiwit en is een belangrijke overweging bij het plannen van een eiwitzuivering strategie.
Toekomstig werk zal zich richten op hoe de post-translationele modificaties tijdens de zuivering, voor het examen te verbeterengeren door het gebruik van protease deficiënte giststammen, verschillende proteaseremmers of andere affiniteit tags. Wij voorspellen dat dit protocol in zijn huidige of buffer-geoptimaliseerde vorm is van toepassing voor de schaalbare winning, zuivering en latere studie van veel gist eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken alle leden van de Kerscher lab voor hun steun. Wij danken Mark Hochstrasser voor giststam MHY3765. Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie 1051970 (op OK) en een Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Reizen subsidie en Monroe Scholars Program Grant (naar ES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al.
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
