Summary
La preparación de extractos de células de levadura de alta calidad es un primer paso necesario en el análisis de las proteínas individuales o proteomas completos. Aquí se describe un protocolo de homogeneización rápida, eficiente y fiable para las células de levadura en ciernes que ha sido optimizada para conservar funciones de las proteínas, las interacciones y las modificaciones posteriores a la traducción.
Abstract
Homogeneización por golpeo del talón es una manera rápida y eficiente para liberar el ADN, ARN, proteínas y metabolitos a partir de células de levadura en ciernes, que son notoriamente difícil de interrumpir. Aquí se describe el uso de un homogeneizador de molino de bolas para la extracción de las proteínas en tampones optimizados para mantener las funciones, interacciones y modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Células de crecimiento logarítmico que expresan la proteína de interés se cultivan en un medio de cultivo líquido de elección. Los medios de cultivo pueden suplementarse con reactivos para inducir la expresión de la proteína a partir de promotores inducibles (por ejemplo, galactosa), sincronizar la fase del ciclo celular (por ejemplo, nocodazol), o inhibir la función del proteasoma (por ejemplo, MG132). Las células se sedimentaron después y se resuspendieron en un tampón adecuado que contiene proteasa y / o inhibidores de la fosfatasa y se procesan inmediatamente o se congelan en nitrógeno líquido para su uso posterior. La homogeneización se lleva a cabo seis ciclos de 20 seg bead-latido (5,5 m / seg), cada una seguida por una incubación minutos en hielo. El homogeneizado resultante se aclaró por centrifugación y las partículas pequeñas se puede retirar por filtración. El extracto de células enteras aclarado resultante (WCE) se precipitó usando TCA al 20% para el análisis directo de proteínas totales por SDS-PAGE seguida de Western Blot. Los extractos también son adecuados para la purificación por afinidad de proteínas específicas, la detección de modificaciones post-traduccionales, o el análisis de proteínas co-purificación. Como es el caso para la mayoría de los protocolos de purificación de proteínas, algunas enzimas y proteínas pueden requerir condiciones únicas o composiciones tampón para su purificación y otros pueden ser inestables o insolubles en las condiciones indicadas. En este último caso, el protocolo presentado puede proporcionar un punto de partida útil para determinar empíricamente la mejor estrategia de cordón-latido para la extracción y purificación de proteínas. Se demuestra la extracción y purificación de un epítopo de etiquetado SUMO E3 ligasa, Siz1, un ciclo celularregulada proteína que se convierte en tanto sumoylated y fosforilados, así como una subunidad de ubiquitina ligasa SUMO-dirigida, Slx5.
Introduction
El asombroso poder de la genética de la levadura es legendaria, pero la preparación y el análisis de las proteínas nativas de levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, es a menudo lleno de problemas. Este último es debido a la considerable resistencia mecánica y la elasticidad de la pared celular de levadura 1. Diferentes medios han sido descritos para la enzimática, química, mecánica, y la presión basada en la interrupción de las células de levadura para obtener extracto de proteína de células enteras 2-6. Estas técnicas varían ampliamente en su eficacia para producir extractos de proteínas de células nativas representativas, que se pueden utilizar para los análisis posteriores o pasos de purificación. Por ejemplo, la pared celular de la levadura se puede quitar con enzimas líticas (por ejemplo, zimoliasa) y esferoblastos resultantes se pueden interrumpir por cizallamiento, detergentes, o lisis osmótica para liberar las proteínas. Este enfoque ha sido empleado con éxito como el punto de partida para muchos fraccionamientos subcelulares pero requiere largas incubacionesque no son compatibles con la estabilidad de algunas proteínas 7.
Reactivos de lisis de levadura específicos (tales como detergentes) para la extracción química de las proteínas de las células de levadura están disponibles comercialmente, pero la eficacia de estos reactivos en la extracción de la proteína y su efecto en la caracterización bioquímica posterior de las proteínas no siempre es clara 8. Homogeneizadores de alta presión, se hace referencia a menudo como prensas francesas, se rompen eficazmente células de levadura por primera sometiéndolos a alta presión y luego extruir a través de una pequeña abertura en una celda de presión. Esta técnica produce extractos de alta calidad, pero el equipo es muy caro y puede no ser adecuado para pequeñas cantidades de células o múltiples muestras 9. Por lo tanto, la rotura mecánica de las células de levadura en un molino de perlas es a menudo el método de elección para la levadura preparaciones de proteínas nativas 10. Esta técnica implica la ruptura mecánica de la pared celular de la levadura con ácido-waarrojar perlas de vidrio, que pueden llevarse a cabo con una variedad de sacudidores, Vórtices o molinos de perlas. En particular, este método se puede utilizar para procesar simultáneamente múltiples muestras más pequeñas (1 ml de células o menos). Muchas cuentas de diferentes matrices o interrupción molino de perlas están ahora disponibles comercialmente para interrumpir casi cualquier tipo de tipo de células en tubos de 2 ml. Teniendo en cuenta las otras técnicas y equipos, un molino de bolas tiene la ventaja añadida de que la interrupción de las células de levadura se produce muy rápido, lo que ayuda a preservar las modificaciones post-traduccionales tales como la sumoilación, especialmente cuando se utilizan los tampones apropiados con proteasa y / o inhibidores del proteasoma y la temperatura de los extractos se controla.
Este protocolo se centra en la extracción rápida, eficaz, fiable y de proteínas endógenas y sobre-expresado en condiciones suaves con el objetivo final de preservar la función de proteínas, interacciones, y modificaciones post-traduccionales. El medio de crecimiento, tampón de lisis celularcomposiciones, y la configuración de molino de perlas están optimizados para mantener interacciones de proteínas y modificaciones post-traduccionales tales como la ubiquitinación y la sumoilación.
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Protocol
Purificación de proteínas marcadas con 6xHis expresadas en células de levadura en ciernes en condiciones nativas
1. Crecimiento de células de levadura y la inducción de la expresión de la proteína
(Modificado de 2)
OPCIONAL: Usa logarítmicamente crecientes cultivos de levaduras que expresan la proteína de interés en lugar de los cultivos inducidos por galactosa se describen a continuación.
- Transformar células de una cepa de levadura Gal + con un plásmido que codifica una proteína inducible por galactosa de elección 6xHis de etiquetado. Por ejemplo, véase la lista de reactivos.
- Inocular transformantes en 5 ml de medios selectivos apropiados (por ejemplo, SD-uracilo) que contiene 2% de sacarosa. Se incuba a 30 ° CO / N, rotación.
- Diluir cultivo O / N de modo que la densidad óptica a 600 nm mide 0,3 (DO600 = 0,3) en 33 ml de medio selectivo con 2% de sacarosa. Crecer a 30 º C, agitando (Δ150 rpm).
- Cuando el cultivo alcanzó una DO600 = 0,8-1,5, Inducir la expresión de la proteína deseada mediante la adición de 17 ml de YEP 3x con 6% de galactosa (receta en la Tabla 1), para una concentración final de 1x YEP con 2% de galactosa. Cultura volumen total es ahora de 50 ml. Incubar, agitación, a 30 ° C para un 5-6 horas más.
Nota: el volumen de cultivo se puede variar. En la etapa 1.3, diluido en dos terceras partes de el volumen final deseado. En la etapa 1.4, añadir un tercio del volumen final de 3x YEP / 6% de galactosa. - Mida la OD 600 de la cultura inducida y centrifugar Δ150-200 OD 600 unidades de células durante 5 minutos a 5000 rpm a 4 ° C.
- Resuspender el sedimento de células con 1 ml de PBS enfriado en hielo con 1x 1x cóctel inhibidor de proteasa y transferir a un tubo con tapón de 2 ml de tornillo.
- Centrifugar las células durante 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante.
- Snap congelación sedimento de células en nitrógeno líquido, seguido por la lisis celular inmediata o de almacenamiento a -80 ° C hasta su uso posterior.
- Para el sedimento celular congelado de la etapa anterior, añadir 200 l de perlas de vidrio lavadas con ácido y 500 l de tampón de lisis enfriado en hielo (receta en la Tabla 1 o utilizar tampón de lisis celular de elección).
- Brevemente pipeta hacia arriba y abajo. No es necesario para resuspender completamente el sedimento celular. Mantenga los tubos en hielo en todo momento.
Nota: El extremo de la punta de la pipeta puede ser cortada antes de pipetear arriba y hacia abajo. - A 4 ° C, el lugar del tubo (s) a las células en el molino de bolas, el equilibrio, la cerradura, y ejecutar la máquina según las instrucciones del fabricante.
- Ejecute el batidor del grano que contiene el tubo (s) durante 20 segundos a 5,5 m / seg, a continuación, colocar en hielo fangoso por 1 min. Repetir 6 veces en total.
- Borrar las proteínas extraídas por centrifugación durante 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPCIONAL: eliminar pequeñas partículas por centrifugación a través de un filtro spinx.
- Prepare una muestra de toda la célula eXtract (EBB) para confirmar la presencia de la proteína de interés mediante Western Blot:
- Añadir WCE correspondiente con 2 unidades de DO 600 de células (por ejemplo, 5 l de extracto aclarado si se cosecharon 200 OD 600 unidades de células) a 800 l 20% de ácido tricloroacético (TCA). Vortex para mezclar.
- Centrifugar durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante, pero tenga cuidado de mantener el sedimento.
- Añadir 800 l de TCA al 2% a la pastilla y el tubo de vórtice, seguido por centrifugación durante 2.5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante, pero tenga cuidado de mantener el sedimento.
- Añadir 100 l de TCA al tampón de muestra (receta en la Tabla 1) y agitar para disolver el precipitado. Nota: Si el tampón de muestra se convierte en ácida (se vuelve amarilla) después de la adición al sedimento, añadir alícuotas de Δ10 l Tris base [1M] hasta que la muestra es de color azul de nuevo.
- Incubar en un bloque de 100 ° C de calor para 2-5 min.
- Vortex again se disuelva completamente si los restos de pellets siguen presentes. Gránulos preparados por este método son notoriamente difíciles de disolver completamente. Puede tomar Δ10 min de agitación para disolver completamente pellets.
- La tienda de la muestra a -80 ° C hasta su uso posterior.
- Snap congelar alícuotas de permanecer WCE despejado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso posterior.
3. La purificación por lotes de proteínas de homogeneizados de células de levadura
Nota: Este método de purificación se ha optimizado para la purificación de las proteínas marcadas con 6xHis de Co 2 + resina de afinidad de metal.
- Resina Equilibrio
- Para una muestra de WCE aclarado preparado a partir de Δ20-40 OD 600 unidades de células, añadir 50-100 l de resina de afinidad a un tubo de microcentrífuga. Las proteínas extraídas a partir de células que no expresan la proteína deseada o una resina no específica, tales como amilosa, se pueden usar como controls para la unión no específica.
- Lavar la resina 5x con 1 ml de tampón de lavado: invertir arriba-más de fondo hasta que se vuelve a suspender la resina y, a continuación, girar durante 1 minuto a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante.
Nota: si se realiza la extracción y purificación en el mismo día, el equilibrado de resina se puede realizar antes de la extracción.
- Binding Protein para purificación por afinidad
- Añadir 100-200 l de lisado aclarado (Δ20-40 OD 600 unidades) a 50-100 l perlas lavadas, y llevar el volumen total a 1 ml con tampón de lisis.
- Incubar con nutación o mecedora a 4 ° C durante 2-5 horas.
- Haga girar durante 1 minuto a 5000 rpm a 4 ° C.
- Si lo desea, guarde una muestra del sobrenadante restante para el análisis posterior de las proteínas no fijadas. TCA precipitar como se detalló anteriormente para el WCE (paso 2.6).
- Lavar la resina con proteínas unidas 5x con 1 ml de tampón de lavado, seguidos de un centrifugado durante 1 minuto a 5000 rpm a4 ° C. Mantener las muestras frías durante el lavado.
- La elución de las proteínas unidas
- Añadir 150 l de tampón de elución a la resina, titubear a 4 ° C durante 5 minutos, centrifugado durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C y guardar el sobrenadante en un nuevo tubo. OPCIONAL: Repetir 2x y eluciones piscina.
- Preparar muestra eluida de Western blot: Para 25 l de proteínas eluidas, añadir 25 l 2x dodecil sulfato de litio (LDS) tampón de muestra con 2 l β-mercaptoetanol (BME) y se incuba en un bloque de 100 ° C de calor durante 2 min.
Nota: 2X tampón de muestra de Laemmli estándar también se puede utilizar. - Snap congelación exceso de proteína eluida en nitrógeno líquido.
OPCIONAL: proteínas restantes tiras de resina con un volumen igual de 2x tampón de muestra LDS a 65 ° C durante 5 min, eliminar las proteínas SUD-eluidas a un tubo nuevo, a continuación, añadir 2 l BME a las proteínas eluidas, no a la resina. Esta orden es para evitar la retirada de cualesquiera iones o anticuerpos que son conjugaciónted a las perlas. - Almacene las muestras a -80 ° C hasta nuevo uso.
- Western Blot y la sonda con los anticuerpos apropiados para visualizar las proteínas.
- Cargar 10-20 l (Δ1-3 600 unidades de DO) de cada muestra y 3-10 l de una escalera de proteína en un gel de SDS-PAGE de elección. Los geles utilizados habitualmente para este protocolo son, entre 4-12% Bis-Tris y el 8% Tris-glicina.
- Ejecutar en gel a 200 V durante 50 min.
- Transferir las proteínas a partir de gel a una membrana de PVDF mediante transferencia semiseca a 19 V durante 20-30 minutos (receta en la Tabla 1).
- Bloquear la membrana en 4% milk/1x solución salina amortiguadora Tris-Tween (TBST) durante 1 hora a TA o O / N a 4 ° C (receta en la Tabla 1).
- Incubar la membrana con el anticuerpo primario a la proteína epítopo de etiquetado de interés en el 4% milk/1x TBST durante 1-3 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
- Lavar la membrana 3x durante 5 minutos cada uno con TBST 1x.
- Incubar la membrana con apropiadaperoxidasa de rábano secundaria (HRP) conjugada con anticuerpo durante 1-3 horas a temperatura ambiente.
- Lavar la membrana 3 veces durante 15 min cada uno en un gran volumen de TBST 1x.
- Cubra membrana con sustrato ECL y envolver en papel film.
- Exponer la membrana a una película y desarrollar para visualizar las proteínas.
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Representative Results
Nuestros resultados representativos revelan que el protocolo de extracción del talón-latido y proteína descrita es útil para la preparación reproducible de proteínas para una variedad de aplicaciones aguas abajo (que se resumen en la Tabla 2). SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie de WCE muestran que una amplia gama de proteínas (~ 12 a> 250 kDa) se puede reproducible extrae de las células de levadura (Figura 1A). Bandas discretas más de una gama de pesos moleculares son indicativos de extractos de proteínas de alta calidad. La calidad de los extractos puede ser confirmado por el Western Blot para las proteínas etiquetadas con epítopo específicos. Se muestra un resultado representativo de la galactosa-sobreexpresado, V5-etiquetados SUMO ligasa Siz1 que migra en Δ120kDa (Figura 1B). En general, las proteínas parcialmente degradadas corrían como varios fragmentos por debajo del peso esperado, pero no se observa aquí sólo proteína de longitud completa. Adicionalmente, los aductos de alto peso molecular de una proteína dadapuede indicar modificaciones post-traduccionales. Por ejemplo, mostramos galactosa-sobreexpresa sumoylated longitud Siz1Δ440 y lleno Siz1 (Figura 1C y la figura 1D). Las modificaciones también pueden ser conservados en Siz1 expresado de forma endógena (Figura 1E).
Proporcionamos resultados representativos que dos proteínas nucleares enriquecidos, Slx5 y Siz1Δ440, se purificaron con éxito de nuestros WCE (Figuras 2A, 2B, y 2C). En particular, se muestra que una proteína marcada con 6xHis (Figura 2A; Slx5) puede ser purificado por afinidad a partir de nuestros WCE tanto en condiciones nativas y desnaturalizantes. Por el contrario, Slx5-GST (Figura 2B) y Siz1Δ440-HA (Figura 2C) carecen de un epítopo 6XHIS pero bajo condiciones nativas aún interactúan con la resina de afinidad de metal en forma de imidazol y minúsculas. Proponemos que Siz1, y en menor medida SLX5, son capaces de unirse a la resina de afinidad de metal a través de su metal-coordinadora anillo de dominio. Mientras que, a nuestro conocimiento, todavía no se ha informado de este fenómeno particular, una situación similar se ha descrito en el que la toxina del cólera subunidad B se une de Ni 2 + resina de afinidad de una manera mediada por sus residuos de histidina naturales 11. Es importante destacar que esta observación sugiere que las proteínas en el EBB son, al menos en parte, de forma nativa plegadas.
Especialmente para el estudio de la función de la proteína es importante para mostrar que los complejos de proteínas permanecen intactos en los extractos de células enteras. Nuestros datos representativos revelan que Siz1Δ440, Slx5, y PGK1 (una proteína citosólica que sirve como control de carga) estaban presentes en WCE. Siz1Δ440 se purificó a partir de estos extractos sobre la base de su capacidad inherente para unirse a resinas de afinidad de metal (compárese con la figura 2C). Cuando se co-expresó Slx5 y Siz1 en células de levadura, Slx5 niveles en los eluidos se incrementaron,aumentando la posibilidad de que Slx5 puede interactuar con Siz1 (Figura 3).
Figura 1. La presencia de proteínas intactas y sumoylated en lisado de células de levadura después de la extracción. A menos que se prepararon extractos de células enteras se indique lo contrario, como se describe en este protocolo. Las muestras fueron separadas por SDS-PAGE y Western Blot después se probaron con anticuerpos ya sea a la HA, V5, o etiquetas de epítopo myc. Las cepas de levadura se compilan en la Tabla 3. WB: western blot. (A) las muestras representativas de WCE precipitado con TCA (de YOK 2514 (dos carriles de la izquierda) y YOK 2592 (dos carriles de la derecha), (Δ0.2 OD / carril)) se visualizaron por tinción con una mancha de gel de ( véase la sección de Materiales). (B) El carril 1 y 2: homogeneizado de la cepa de levadura YOK 2510 y 251 YOK2 Siz1-V5/6xHIS galactosa sobreexpresados que contienen. Nótese la ausencia de fragmentos de proteínas parcialmente degradadas. Por razones desconocidas, este ejemplo particular, no revela aductos sumoylated cuando se sondearon con un anticuerpo anti-V5. Sin embargo, la sumoilación se puede detectar con un SUMO contra (anti-Smt3) de anticuerpos tal como se muestra en la figura. 1D. (C) Carril 3 y 4: homogeneizados de la cepa de levadura YOK YOK 2508 y 2509 contienen galactosa sobreexpresada Siz1Δ440-HA. (D) Carril 5, 6 y 7: Siz1-V5/6xHIS galactosa-sobreexpresados se purificó usando Co 2 + resina de afinidad de metal, se eluyó con 200 mM de imidazol, y se sondearon con anti-V5 (carril 5), anti-Smt3 (carril 6). El carril 7 es un Reprobe de carril 6 con el anticuerpo anti-V5. y muestra tanto Siz1 y sumoylated Siz1 aductos Smt3 (n). (E) Carril 8: JD52 células de tipo salvaje que contienen niveles endógenos de myc-etiquetados Siz1 (YOK 2397). Se borra lisado preparado usando un tampón de lisis de mamífero. Carril 9: Lysaciar sobrenadante después de una incubación de 2 h con anti-V5 de agarosa. Nota aductos sumoylated de Siz1. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Purificación de la sobre-expresado RING-dominio que contienen las proteínas con TALON resina de afinidad de metal. Inducción de galactosa, la extracción y purificación de proteínas se realizaron como se describe en este protocolo. La purificación se lleva a cabo bajo condiciones nativas y condiciones desnaturalizantes, para lo cual se añadió hidrocloruro de guanidinio a la muestra a 6 M antes de la incubación con la resina. El lisado se hace girar con el control tanto de resina de amilosa (A) y resina de afinidad de metal TALON (T). Las proteínas se eluyeron con 200 mM de imidazol en el tampón de elución. Las muestras fueron separadas por SDS-PAGE y transferencia Western(WB) con un anticuerpo para el epítopo etiqueta apropiada. A) Galactosa inducida Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) se purificó con resina TALON, tanto en condiciones nativas y de desnaturalización B) Galactosa inducida Slx5-GST (YOK 2071) fue purificado con resina TALON en nativo, pero no desnaturalización condiciones. Presumiblemente, la coordinación de dominio anillo de metal interactúa con resina TALON cuando estén dobladas. C) La galactosa inducida Siz1Δ440-HA (YOK 2353) también se purificó con resina TALON en nativo, pero no desnaturalización condiciones. Estas proteínas no contienen etiquetas 6XHIS, pero cada uno contiene un anillo de dominio, que coordina naturalmente iones Zn 2 + y puede conferir la capacidad de unir intrínsecamente TALON resina de afinidad de metal cuando está correctamente plegada. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Co-purificación de exceso de proteínas expresadas en resina de afinidad de metal TALON.
Slx5-GST y Siz1Δ440-HA se expresan por sí mismos o en combinación (+ / -) de las células (JD52 cepas YOKs 2353, 2402, 2224, respectivamente). Las proteínas se extrajeron como se describe (WCE) y lisados se habla de cabezal universal con metal TALON resina de afinidad (véase la figura 2). Las proteínas se eluyeron de la resina con 200 mM de imidazol en el tampón de elución (eluato) y se prepararon en tampón de muestra LDS. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y Western Blot después se sondearon con un anticuerpo para la etiqueta HA o la etiqueta de GST según sea apropiado. La igualdad de carga de proteínas se confirmó con PGK como control de carga. Tenga en cuenta que Slx5 purificación se potencia en presencia de Siz1Δ440. Click aquí para ampliar la imagen .
| Solución | Componentes | Comentarios |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g Extracto de levadura 60 g de peptona en 700 ml de ddH 2 O | Mezclar los ingredientes y esterilizar en autoclave para esterilizar. Añadir filtro galactosa esterilizada a 6% a alícuotas individuales de 3x YEP cuando esté listo para su uso |
| TCA tampón de muestras | 15% de glicerol 80 mM Tris base (no pH'd) 3.5% SDS bromofenol azul "a gusto". Aumentar el volumen hasta 25 ml con ddH2O | Antes de usar: añadir 40 l de β-mercaptoetanol (BME) a 1 ml de TCA tampón de muestra |
| Tampón de lavado | HEPES 50 mM, pH 7,3 200 mM de NaCl 1% de Triton X-100 20 mM de imidazol | Imidazol utilizado para el Ni 2 + y Co 2 + sólo la purificación de afinidad de metal |
| Tampón de Lisis | HEPES 50 mM, pH 7,3 200 mM de NaCl 1% de Triton X-100 10 mM de imidazol 1x cóctel inhibidor de proteasa Añadir cóctel inhibidor de proteasa inmediatamente antes de su uso. Imidazol utilizado para Ni + 2 sólo o Co 2 + purificación de afinidad de metal. OPCIONAL: 25 mM de N-etilmaleimida (inhibidor de la proteasa de cisteína, para preservar la sumoilación), ortovanadato de sodio 1 mM (inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa), y / o otros inhibidores de la proteasa determinadas empíricamente basándose en el área específica de estudio | |
| Tampón de elución | HEPES 50 mM, pH 7,3 200 mM de NaCl 200 mM de imidazol | Imidazol utiliza para competir por los sitios de unión de histidina en Ni 2 + y Co 2 + sólo purificación de afinidad de metal. Otros métodos de elución se pueden utilizar para resinas de afinidad diferentes. |
| Semi Tampón de transferencia en seco (10x) | En 1 l de ddH 2 O: 58 g de Tris 29,3 g Glicina 18,75 ml de 20% de SDS | Para 1x Semi Dry Transfer Buffer: mezcla 100 ml de 10x Semi Buffer de transferencia en seco con 200 ml de metanol y 700 ml de ddH 2 Os |
| Solución salina tamponada con Tris (TBS, 10 veces) | 50 ml de 1 M Tris-HCl, pH 8,0 150 ml de NaCl 5 M 300 ml de ddH2O | Para 1x TBST, mezclar 100 ml de TBS 10 veces con 900 ml de ddH 2 O y se añade 1 ml de Tween-20 |
Tabla 1. Soluciones y tampones.
| Aplicación | Cantidad de células | Pasos siguientes |
|---|---|---|
| Lisis celular | 150-200 OD de cosechado sedimento celular | Bolas golpear como se describe en el paso 2 |
| Western Blot de Europa occidental y central | 2 OD de células lisadas preparadas | Prepárese para Western blot por precipitación con TCA como se describe en el paso 2.6. Δ0.3 unidades de DO (Δ15 l) se quedan en gel |
| Purificación por afinidad y / o pulldown | 30 de las DO de las células lisadas | Bind, eluir, y preparar las proteínas como se describe en los pasos 3.2 y 3.3 |
| Aproximadamente 1-2 OD (si se prepara como en el paso 3.3) | Western blot como se describe en el paso 3.4 |
Tabla 2. Resumen de las aplicaciones de este Protocolo.
| Nombre | Genotipo relevante o cepa parental | El plásmido (s) o inserción de casete | Referencia |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATa ura3-52 his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ63-801 lys2 | Dohmen et al., 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems levadura colección GST YSC4515-202484078) | este estudio |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | este estudio |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems colección levadura GST YSC4515-202484078), pRS425 (BOK 343) | este estudio |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | este estudio |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endógena etiquetado) | este estudio |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems colección levadura GST YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | este estudio |
| YOK 2501 | MHY3765, alfa tipo de apareamiento, ura3-52, lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: kanMX | Xie et al., 2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | este estudio |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems colección levadura GST YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | este estudio |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898); pRS425 (BOK 343) | este estudio |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | Slx5-proteína A (BOK 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | este estudio |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YOK 2397) | msn5Δ :: higromicina | este estudio |
| YOK 2592 | msn5Δ :: higromicina en JD52 (YOK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | este estudio |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | este estudio |
Tabla 3. Las cepas de levadura.
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Discussion
Este protocolo se centra en la preparación de intacta, nativa, y después de la traducción modificada proteínas a partir de células de levadura en ciernes para aplicaciones de corriente abajo. Antes de intentar este protocolo, es fundamental para determinar si la proteína de interés puede ser fácilmente detectado en extractos proteicos preparados bajo condiciones de desnaturalización 12. Si los anticuerpos policlonales no están disponibles, puede ser ventajoso epítopo etiqueta de la proteína de interés de manera que la proteína de fusión se puede detectar en las transferencias Western. En el presente protocolo, marcamos SIZ1 con la HA, 6xHis-V5 o etiquetas de epítopo myc y esta estrategia nos permitió identificar con claridad la proteína y sus formas sumoylated en transferencias Western (Figura 1). Tuvimos menos la detección de GFP proteínas marcadas con éxito, posiblemente porque la alta afinidad de los anticuerpos anti-GFP son difíciles de obtener (datos no mostrados). Otra cuestión fundamental se refiere al nivel de expresión de la proteína de interés. Los niveles de individuoproteínas variar ampliamente en células de levadura en ciernes 4 y algunas proteínas que se sobreexpresa por lo que se pueden detectar y / o purificarse. Vectores inducible por galactosa están disponibles para la expresión de alto nivel del gen de levadura de interés 2. En el caso de Siz1, hemos sido capaces de detectar la proteína de longitud completa o truncado cuando se expresa a partir de ORFs cromosómicamente-etiquetados o cuando se expresa bajo el control del fuerte promotor inducible por galactosa de un plásmido (Figura 1). El uso de truncamientos puede ser útil en los análisis de estructura / función o cuando la molécula de longitud completa es difícil de expresar o inestable. Mientras que la sobreexpresión inducida por galactosa mejora la detección y purificación de proteínas, que tiene claras limitaciones al estudiar la relevancia fisiológica de potenciales del ciclo celular y de las interacciones modificaciones post-traduccionales específicas. Por ejemplo, sumoylation de Siz1 es más prevalente en G2 / M fase del ciclo celular, y modificaciones o interacciones dela proteína sobreexpresada puede ser confirmado por otros medios experimentales. Por último, la adición de la proteasa específica, la fosfatasa, y / o inhibidores del proteasoma es una consideración importante para el éxito de este protocolo. En general, los mejores resultados se obtienen mediante la adición de estos inhibidores antes de células se congelan y en tampones de extracción y dilución. La adición de EDTA, un quelante de iones de metal a veces presentes en cócteles inhibidores de proteasa, no es aconsejable, ya que puede interferir con posteriores purificaciones de afinidad de metal.
Los extractos de proteína obtenidos por el grano que-superando son muy adecuadas como material de partida para la purificación de las proteínas individuales. Específicamente, mostramos que Slx5 sobreexpresados que llevan una etiqueta de afinidad 6xHis se pueden purificar a partir de WCE utilizando una resina de afinidad de metal (Figura 2A). Para preservar modificaciones post-traduccionales y reducir la degradación de proteínas, proteínas de 6xHis-etiquetados a menudo se purificaron en condiciones de desnaturalización5. Sin embargo, existen claras ventajas asociadas con la purificación de proteínas bajo condiciones nativas. Por ejemplo, estas proteínas pueden co-purificar con parejas de unión o pueden ser utilizados en ensayos in vitro posterior 13,14. En el caso de Siz1 y Slx5 que casualmente determinó que ambas proteínas muestran una afinidad intrínseca de la resina de afinidad de metal, independiente de la etiqueta 6xHis, y esta observación nos sugirieron que ambas proteínas supone confirmaciones nativas. Por desgracia, la actividad biológica y plegado correcto de las proteínas purificadas se ha determinado en un caso por caso. Para este fin, la colocación de etiquetas de afinidad y epítopo ya sea en el extremo amino o carboxi, puede afectar en gran medida la actividad o la estabilidad de la proteína de fusión y es una consideración importante en la planificación de una estrategia de purificación de proteínas.
El trabajo futuro se centrará en cómo mejorar las modificaciones posteriores a la traducción durante la purificación, para examenple a través del uso de cepas de levadura deficientes en proteasa, inhibidores de proteasas diferentes, u otras etiquetas de afinidad. Nuestra predicción es que este protocolo en su forma actual o tampón optimizado es aplicable para la extracción, purificación y posterior estudio escalable de muchas proteínas de levadura en ciernes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Kerscher por su apoyo. Damos las gracias a Marcos Hochstrasser para la cepa de levadura MHY3765. Este trabajo fue apoyado por la subvención NSF 1051970 (para bien) y el Instituto Médico Howard subvención Pregrado Viajes y Monroe Académicos Programa de Subvenciones (a ES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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