Summary
Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten.
Abstract
Homogenisierung Wulst Prügel ist eine schnelle und effiziente Möglichkeit, DNA, RNA, Proteine und Metaboliten aus Hefe-Zellen, die notorisch schwer zu stören sind freizugeben. Hier beschreiben wir die Verwendung einer Perlmühle homogenisiert zur Gewinnung von Proteinen in Puffer optimiert, um die Funktionen, die Interaktion und post-translationalen Modifikationen von Proteinen zu erhalten. Logarithmisch wachsenden Zellen, die das Protein von Interesse in einem flüssigen Wachstumsmedium Wahl geworden. Die Nährmedien mit Reagenzien können ergänzt werden, um die Proteinexpression von Promotoren (zB Galaktose) zu induzieren, synchronisieren Zellzyklusstadium (zB Nocodazol) oder hemmen Proteasom-Funktion (zB MG132). Die Zellen werden dann pelletiert und in einem geeigneten Puffer, der Protease und / oder Phosphatase-Inhibitoren und entweder sofort verarbeitet oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Verwendung. Homogenisierung wird durch sechs Zyklen von 20 sec erreicht bead-Schlagen (5,5 m / sec), die jeweils von einem minütigen Inkubation auf Eis. Das erhaltene Homogenisat wird durch Zentrifugation geklärt und kleine Partikel kann durch Filtration entfernt werden. Die resultierende gelöscht Ganzzellextrakt (WCE) ausgefällt mit 20% TCA zur direkten Analyse des gesamten Proteine durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting. Extrakte eignen sich auch zur Affinitätsreinigung von spezifischen Proteinen, die Detektion von post-translationalen Modifikationen, oder der Analyse der Co-Reinigung von Proteinen. Wie bei den meisten Proteinreinigung Protokolle können einige Enzyme und Proteine eine eindeutige Bedingungen oder Puffer-Zusammensetzungen für die Reinigung und andere möglicherweise instabil oder unlöslich ist unter den angegebenen Bedingungen. Im letzteren Fall kann das Protokoll präsentiert einen nützlichen Ausgangspunkt, um empirisch die besten Perlen-Prügel Strategie für Protein Extraktion und Reinigung. Wir zeigen die Extraktion und Reinigung eines epitopmarkierter SUMO E3 Ligase Siz1 ein Zellzyklusreguliertes Protein, das sowohl sumoyliert und phosphoryliert, sowie eine gezielte SUMO-Ubiquitin-Ligase-Untereinheit Slx5 wird.
Introduction
Die gewaltige Kraft der Hefegenetik ist legendär, aber die Vorbereitung und Analyse von nativen Proteinen aus Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist oft mit Problemen behaftet. Letzteres ist aufgrund der hohen mechanischen Festigkeit und Elastizität der Hefezellwand 1. Verschiedene Mittel sind für die enzymatische, chemische, mechanische und Druck auf die Unterbrechung des Hefe-Zellen zu erhalten, Ganzzell-Proteinextrakt 2-6 beschrieben. Diese Techniken sind sehr unterschiedlich in ihrer Wirksamkeit zu Zell-Vertreter, native Protein-Extrakte, die für spätere Analysen oder Reinigungsschritte verwendet werden können, zu erhalten. Zum Beispiel kann das Hefe-Zellwand mit lytischen Enzymen (zB Zymolyase) und die daraus resultierenden Sphäroblasten entfernt werden kann durch Scherung, Detergenzien oder osmotische Lyse, um Proteine freizusetzen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich als Ausgangspunkt für viele subzelluläre Fraktionierung eingesetzt, aber es erfordert langwierige Inkubationendie nicht kompatibel sind mit der Stabilität einiger Proteine 7.
Proprietary Hefelyse Reagenzien (z. B. Waschmittel) für die chemische Extraktion von Proteinen von Hefezellen sind im Handel erhältlich, aber die Wirksamkeit dieser Reagenzien in Protein-Extraktion und ihre Wirkung auf nachfolgende biochemische Charakterisierung von Proteinen ist nicht immer klar, 8. Hochdruckhomogenisatoren, die oft als Französisch Pressen bezeichnet, effektiv zu brechen Hefezellen durch sie einer ersten hohen Druck und anschließend extrudiert durch eine kleine Öffnung in einer Druckzelle. Diese Technik produziert hochwertige Extrakte aber die Ausrüstung ist sehr teuer und nicht geeignet für kleine Mengen von Zellen oder mehrere Proben 9. Daher ist die mechanische Störung der Hefezellen in einer Kugelmühle oft die Methode der Wahl für die native Hefeprotein Zubereitungen 10. Diese Technik beinhaltet mechanische Zerstörung des Hefe-Zellwand mit Säure-waSchuppen Glasperlen, die mit einer Vielzahl von Schüttler, Vortexer oder Kugelmühlen durchgeführt werden kann. Insbesondere kann dieses Verfahren verwendet werden, um gleichzeitig zu verarbeiten mehrere kleine Proben (1 ml Zellen oder weniger) ist. Viele verschiedene Perlen oder Kugelmühle Störung Matrizen sind jetzt im Handel erhältlich für fast jede Art von Zelltyp in 2-ml-Röhrchen zu stören. Unter Berücksichtigung der sonstigen Techniken und Ausrüstung hat eine Perlmühle den zusätzlichen Vorteil, dass die Unterbrechung des Hefe-Zellen sehr schnell, die hilft, posttranslationale Modifikationen wie sumoylation erhalten auftritt, vor allem, wenn die entsprechenden Puffer mit Protease-und / oder Proteasom-Inhibitoren verwendet werden, und die Temperatur der Extrakte gesteuert wird.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die schnelle, effektive und zuverlässige Extraktion von endogenen und überexprimierten Proteine unter schonenden Bedingungen mit dem Ziel, um Protein-Funktion, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten. Nährmedien, ZelllysepufferZusammensetzungen und Perlmühle Einstellungen optimiert, um Protein-Wechselwirkungen und posttranslationale Modifikationen wie sumoylation und Ubiquitinierung halten.
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Protocol
Reinigung von 6xHis-markierte Proteine in Hefe-Zellen unter nativen Bedingungen ausgedrückt
1. Wachstum von Hefe-Zellen und Induktion der Proteinexpression
(Geändert von 2)
Optional: Verwenden logarithmisch wachsenden Hefekulturen Ausdruck Protein von Interesse anstelle der Galaktose-induzierten Kulturen beschrieben.
- Verwandeln Zellen eines Gal + Hefestamm mit einem Plasmid, das ein Galaktose-induzierbaren 6XHIS-markierten Protein der Wahl. Siehe zum Beispiel Reagenzien Liste.
- Impfen Transformanten in 5 ml geeigneten selektiven Medien (z. B. SD-Uracil) mit 2% Saccharose. Inkubation bei 30 ° CO / N, rotierend.
- Verdünnen O / N-Kultur, so dass die optische Dichte bei 600 nm 0,3 (OD 600 = 0,3) misst in 33 ml selektivem Medium mit 2% Saccharose. Wachsen bei 30 ° C, Zittern (Δ150 rpm).
- Wenn die Kultur hat OD 600 = 0,8 erreichte-1.5, Induzieren die Expression des gewünschten Proteins durch Zugabe von 17 ml YEP 3x mit 6% Galactose (in der nachfolgenden Tabelle 1) bei einer endgültigen Konzentration von 1x YEP mit 2% Galaktose. Insgesamt Kultur Volumen ist nun 50 ml. Inkubieren, Schütteln, bei 30 ° C für weitere 5-6 Stunden.
Hinweis: das Kulturvolumen variiert werden kann. In Schritt 1.3, verdünnt in zwei Drittel der gewünschte Endvolumen. In Schritt 1.4, fügen Sie ein Drittel der endgültigen Volumen von 3x YEP / 6% Galaktose. - Messen der OD 600 der induzierten Kultur und Zentrifuge Δ150-200 OD 600 Einheiten von Zellen für 5 min bei 5000 rpm bei 4 ° C.
- Zellpellet mit 1 ml eiskaltem 1x PBS mit 1x Proteaseinhibitorcocktail und Transfer zu einem 2 ml Schraubdeckel Rohr.
- Zentrifuge Zellen für 1 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. Überstand dekantieren.
- Schnellfrostmedium Zellpellet in flüssigem Stickstoff gefolgt von unmittelbarer Zelllyse oder Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Um dem gefrorenen Zellpellets aus dem vorherigen Schritt, 200 ul acid-washed Glasperlen und 500 ul eiskaltem Lysepuffer (Rezept in Tabelle 1 oder verwenden Zelllysepuffer der Wahl).
- Kurz und Abpipettieren. Es ist nicht erforderlich, um vollständig Zellpellet. Halten Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten.
Hinweis: Das Ende der Pipettenspitze kann, bevor und Abpipettieren geschnitten werden. - Bei 4 ° C, statt die Röhre (n) mit Zellen in der Kugelmühle, Balance, Schloss, und führen Sie die Maschine gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Sie die Kugelmühle mit der Röhre (n) für 20 Sekunden bei 5,5 m / sec, dann auf matschigen Eis legen für 1 min. Wiederholen 6x insgesamt.
- Löschen der extrahierten Proteine durch Zentrifugation für 15 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. OPTIONAL: entfernen kleine Partikel durch Zentrifugation durch ein SpinX Filter.
- Vorbereiten einer Probe der gesamten Zelle eXtract (WCE), um die Anwesenheit des Proteins von Interesse durch Western Blot bestätigen:
- In WCE entsprechenden OD 600 mit 2 Einheiten von Zellen (zB 5 ul Extrakt gelöscht, wenn 200 OD 600 Einheiten von Zellen wurden geerntet) bis 800 ul 20% Trichloressigsäure (TCA). Vortex mischen.
- Zentrifuge für 2,5 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. Den Überstand umfüllen, aber seien Sie vorsichtig, um das Pellet zu erhalten.
- In 800 ul 2% TCA dem Pellet und Wirbel der Röhre, durch Zentrifugation für 2,5 min bei 15.000 Upm bei 4 ° C. Den Überstand umfüllen, aber seien Sie vorsichtig, um das Pellet zu erhalten.
- In 100 ul TCA Sample Buffer (Rezept in Tabelle 1), Vortex zu Pellets aufzulösen. Hinweis: Wenn die Probenpuffer sauer wird (wird gelb) nach Zugabe zu dem Pellet, fügen Aliquots Δ10 ul Tris base [1M], bis die Probe wieder blau.
- Inkubation in einem 100 ° C Heizblock für 2-5 min.
- Vortex again vollständig auflösen, wenn Reste von Pellet noch vorhanden sind. Pellets nach dieser Methode hergestellt werden, sind bekanntlich schwer vollständig zu lösen. Es kann Δ10 min Vortexen vollständig auflösen Pellets.
- Shop Probe bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Schnellfrostmedium Aliquots restlichen gelöscht WCE in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
3. Batch Reinigung von Proteinen aus Hefe Zellhomogenaten
Hinweis: Dieses Reinigungsverfahren wurde zur Reinigung von 6xHis-markierten Proteine auf Co 2 + Metall Affinitätsharz optimiert.
- Resin Equilibration
- Für eine Probe geräumte WCE von Δ20-40 OD 600 Einheiten von Zellen hergestellt, fügen 50-100 ul Affinitätsharz in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Proteine aus Zellen, die nicht zum Ausdruck hat das gewünschte Protein oder eine unspezifische Harz wie Amylose, extrahiert kann als Kontrolle verwendet werden,s für unspezifische Bindung.
- Waschen Harz 5x mit 1 ml Waschpuffer: invertieren top-over-Boden bis Harz wird suspendiert, und dann drehen für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand.
Hinweis: Wenn die Durchführung Extraktion und Reinigung am selben Tag, Harz Äquilibrierung kann vor der Extraktion durchgeführt werden.
- Protein Binding für Affinity Purification
- 100-200 ul geklärte Lysat (Δ20-40 OD 600 Einheiten), 50-100 ul gewaschenen Perlen, und bringen das Gesamtvolumen auf 1 ml mit Lysepuffer.
- Inkubation mit Nutation oder rocking bei 4 ° C für 2-5 Stunden.
- Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C.
- Falls gewünscht, Speichern einer Probe der verbliebenen Überstand für die nachfolgende Analyse von ungebundenen Proteinen. TCA ausgefällt wie oben für die WCE (Schritt 2.6).
- Waschen mit Harz gebundenen Proteine 5x mit 1 ml Waschpuffer durch einen Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei gefolgt4 ° C. Die Proben Kälte während Wäschen.
- Elution der gebundenen Proteine
- In 150 ul Elutionspuffer zum Harz, nutieren bei 4 ° C für 5 min, Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C und speichern Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. OPTIONAL: Wiederholen 2x und Pool Elutionen.
- Bereiten eluierten Probe für Western-Blot: Um 25 ul eluierten Proteine, fügen Sie 25 ul 2x Lithiumdodecylsulfat (LDS) Probenpuffer mit 2 ul β-Mercaptoethanol (BME) und Inkubation in einem 100 ° C Heizblock für 2 min.
Hinweis: Standard-2X Laemmli Probenpuffer können ebenfalls verwendet werden. - Schnellfrostmedium überschüssige eluierte Protein in flüssigem Stickstoff.
OPTIONAL: strip restlichen Proteine aus Harz mit dem gleichen Volumen 2x LDS-Probenpuffer bei 65 ° C für 5 min, entfernen Sie die LDS-eluierten Proteine in ein neues Röhrchen, dann fügen Sie 2 ul BME zu den eluierten Proteine, nicht an das Harz. Dieser Auftrag ist auf das Entfernen von Ionen oder Antikörper, die Konjugation sind zu vermeidented zu den Perlen. - Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Western Blot und Sonde mit entsprechenden Antikörpern Proteine zu visualisieren.
- Legen 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 Einheiten) jeder Probe und 3-10 ul eines Proteins Leiter in einem SDS-PAGE-Gel der Wahl. Gels routinemäßig für dieses Protokoll verwendet werden, umfassen 4-12% Bis-Tris und 8% Tris-Glycin.
- Führen Gel bei 200 V für 50 min.
- Übertragen Proteine aus Gel auf eine PVDF-Membran durch halbtrockenen Transfer bei 19 V für 20-30 min (Rezept in Tabelle 1).
- Blockieren Membran in 4% milk/1x Tris gepufferte Kochsalzlösung-Tween (TBST) für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C (in der nachfolgenden Tabelle 1).
- Dazu werden die Membranen mit primären Antikörpers an das Epitop-markierten Proteins von Interesse in 4% milk/1x TBST für 1-3 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit 1x TBST.
- Inkubieren Membran mit geeignetensekundären Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Antikörper für 1-3 h bei RT.
- Waschen Sie die Membran 3x für je 15 min in einem großen Volumen von 1x TBST.
- Titelbild Membran mit ECL Substrat und wickeln Sie sie in Frischhaltefolie.
- Expose Membran zu filmen und zu entwickeln, um Proteine zu visualisieren.
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Representative Results
Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Perlen-Schläge und Protein Extraktionsprotokoll nützlich für die reproduzierbare Herstellung von Proteinen für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen (in Tabelle 2). SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung von WCES gefolgt zeigen, dass eine Vielzahl von Proteinen (~ 12 bis> 250 kDa) reproduzierbar aus Hefezellen (1A) extrahiert werden. Diskrete Bands über einen Bereich von Molekulargewichten sind bezeichnend für hochwertiges Protein-Extrakten. Die Qualität der Extrakte kann durch Western-Blot-spezifische Epitop-markierten Proteinen zu bestätigen. Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis für die Galactose-überexprimiert, V5-Tag SUMO-Ligase Siz1 die an Δ120kDa (1B) wandert. Generell würde teilweise abgebauten Proteinen als mehrere Fragmente unter dem erwarteten Gewicht laufen, aber hier nur Protein voller Länge beobachtet. Zusätzlich hochmolekularen Addukte eines gegebenen Proteinskann post-translationale Modifikationen geben. Zum Beispiel zeigen wir, Galaktose-überexprimiert sumoyliert Siz1Δ440 und in voller Länge Siz1 (1C und 1D). Änderungen können auch auf endogen exprimiert Siz1 (1E) bewahrt werden.
Wir stellen repräsentative Ergebnisse, dass zwei nukleare angereicherten Proteine, Slx5 und Siz1Δ440, wurden erfolgreich von unserem WCES (2A, 2B und 2C) gereinigt. Bemerkenswert ist, zeigen wir, dass eine 6xHis-markierten Protein (2A; Slx5) kann Affinität von unserem WCES sowohl unter nativen und denaturierenden Bedingungen gereinigt werden. Im Gegensatz dazu fehlt Slx5-GST (2B) und Siz1Δ440-HA (2C) ein Epitop 6XHIS aber unter nativen Bedingungen noch die Interaktion mit der Metall-Affinität Harz in einer Imidazol-sensitive Weise. Wir schlagen vor, dass Siz1, und in geringerem Maße Slx5, können die Metall-Affinitäts-Harz über ihre Metall-koordinierenden RING Domäne binden. Während unseres Wissens diese besondere Phänomen wurde noch nicht berichtet, hat eine ähnliche Situation beschrieben, in dem Cholera-Toxin B-Untereinheit bindet Ni 2 + Affinitätsharz in einer Weise, durch seine natürliche Histidinresten 11 vermittelt. Wichtig ist, schlägt diese Beobachtung, dass Proteine in der WCE sind mindestens teilweise nativ gefaltet.
Insbesondere für die Untersuchung von Protein-Funktion ist es wichtig, dass Proteinkomplexe intakt Ganzzellextrakten bleiben. Unsere repräsentative Daten zeigen, dass Siz1Δ440, Slx5 und PGK1 (a cytosolischen Protein, das als Ladekontrolle dient) in WCES waren. Siz1Δ440 wurde aus diesen Extrakten auf ihr innewohnenden Fähigkeit, Metall Affinitätsharze (vergleiche Abbildung 2C) zu binden gereinigt. Wenn Slx5 und Siz1 wurden in Hefezellen co-exprimiert wurden Slx5 Ebenen in den Eluaten erhöht,was die Möglichkeit, dass Slx5 kann mit Siz1 (Abbildung 3) zu interagieren.
Abbildung 1. Bei intakter und sumoyliert Proteine in Hefe Zelllysat nach der Extraktion. Sofern nicht anders angegeben Ganzzellextrakten wurden wie in diesem Protokoll beschrieben. Die Proben wurden durch SDS-PAGE und Western-Blot nach getrennt wurden mit Antikörpern sondiert, um die HA, V5 oder myc-Epitop-Tags entweder. Hefestämme sind in Tabelle 3 zusammengestellt. WB: Western-Blot. (A) Repräsentative Proben der TCA-gefällten WCE (ab YOK 2514 (zwei Fahrspuren auf der linken Seite) und YOK 2592 (zwei Fahrspuren auf der rechten Seite), (Δ0.2 OD / Spur)) wurden durch Färben mit einem Gelfärbemittels ( siehe Materialien Abschnitt). (B) Spur 1 & 2: Homogenaten von Hefestamm YOK 2510 und YOK 2512 enthaltenden Galaktose-Siz1-V5/6xHIS überexprimiert. Beachten Sie das Fehlen von teilweise abgebauten Protein-Fragmente. Aus unbekannten Gründen hat diese besondere Probe nicht verraten sumoyliert Addukte beim Proben mit einem Anti-V5-Antikörper. Allerdings kann sumoylation mit einem Anti SUMO (anti-Smt3) Antikörper, wie in gezeigt detektiert werden. 1D. (C) Lane 3 & 4: Homogenaten von Hefestamm YOK 2508 und 2509 YOK mit Galaktose-überexprimiert Siz1Δ440-HA. (D) Spur 5, 6 und 7: Galactose-überexprimiert Siz1-V5/6xHIS wurde unter Verwendung von Co 2 + Metall Affinitätsharz mit 200 mM Imidazol eluiert und sondiert mit Anti-V5 (Spur 5), anti-Smt3 (Spur 6). Spur 7 ist eine reprobe der Bahn 6 mit der Anti-V5-Antikörper. und zeigt beide Siz1 und sumoyliert Siz1 Addukte (Smt3 n). (E) Lane 8: JD52 Wildtyp-Zellen, die endogenen myc-markierten Siz1 (YOK 2397). Geklärte Lysat unter Verwendung eines Säugetier-Lysepuffer. Lane 9: Lysättigen Überstand nach einer 2-stündigen Inkubation mit anti-V5-Agarose. Hinweis sumoyliert Addukte Siz1. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 2. Die Reinigung des überexprimierten RING-Domäne enthält Proteine mit Talon Metall Affinitätsharz. Galaktose Induktion, Protein Extraktion und Reinigung wurden durchgeführt, wie in diesem Protokoll beschrieben. Die Reinigung wurde unter nativen Bedingungen und denaturierenden Bedingungen durchgeführt, bei denen Guanidinhydrochlorid zu der Probe wurde auf 6 M vor der Inkubation mit dem Harz hinzugefügt. Lysate gedreht wurde sowohl Amylose Steuerung Harz (A) und Talon Metall Affinitätsharz (T). Die Proteine wurden mit 200 mM Imidazol in Elutionspuffer eluiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und Western-Blot(WB) mit einem Antikörper gegen das entsprechende Epitop-Tag. A) Galaktose-induzierte Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) wurde mit TALON Harz unter beiden nativen und denaturierenden Bedingungen gereinigt B) Galactose-induzierten Slx5-GST (YOK 2071) war gereinigt mit TALON Harz im Heimatland, aber nicht denaturierenden Bedingungen. Vermutlich wirkt das Metall koordinieren RING-Domäne mit TALON Harz, wenn sie richtig gefaltet. C) Galactose-induzierten Siz1Δ440-HA (YOK 2353) wurde auch mit TALON Harz in nativen gereinigt, aber nicht denaturierenden Bedingungen. Diese Proteine enthalten keine 6XHIS Tags, aber jeder tut enthalten eine RING-Domäne, die natürlich koordiniert Zn 2 +-Ionen und kann die Fähigkeit an eigensichere binden TALON Metall Affinitätsharz wenn richtig gefaltet verleihen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 3. Co-Aufreinigung von überexprimierten Proteinen auf TALON Metall Affinity Harz.
Slx5-GST und Siz1Δ440-HA wurden allein oder in Kombination ausgedrückt (+ / -) in JD52-Zellen (Stämme YOKs 2353, 2402, 2224 jeweils). Die Proteine wurden extrahiert, wie beschrieben (WCE) und Lysate wurden mit Talon Metall Affinity Harz (siehe Abbildung 2) nutiert. Die Proteine wurden aus dem Harz mit 200 mM Imidazol in Elutionspuffer (Eluat) eluiert und hergestellt in LDS-Probenpuffer. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt und nach Western Blot wurden mit einem Antikörper sondiert, um die HA-Tag oder GST Tag automatisch. Equal Belastung von Proteinen mit PGK als Ladekontrolle bestätigt. Beachten Sie, dass Slx5 Reinigung in Gegenwart von Siz1Δ440 verbessert wird. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
| Lösung | Components | Kommentare |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g Hefeextrakt 60 g Pepton in 700 ml ddH2O | Alle Zutaten und Autoklaven sterilisieren. In filtersterilisiert Galaktose zu 6% auf einzelnen Aliquots 3x YEP wenn einsatzbereit |
| TCA Sample Buffer | 15% Glycerin 80 mM Tris-Base (nicht pH'd) 3,5% SDS Bromphenolblau "zu schmecken." Bringt Volumen bis 25 ml mit ddH2O | Vor dem Gebrauch: add 40 ul β-Mercaptoethanol (BME) zu 1 ml TCA Sample Buffer |
| Waschpuffer | 50 mM HEPES pH 7,3, 200 mM NaCl 1% Triton X-100 20 mM Imidazol | Imidazole für Ni 2 + verwendet oder Co 2 + Metall Affinitätsreinigung nur |
| Lysis Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3, 200 mM NaCl 1% Triton X-100 10 mM Imidazol 1x Proteaseinhibitorcocktail In Proteaseinhibitorcocktail unmittelbar vor dem Gebrauch. Imidazole für Ni 2 + verwendet oder Co 2 + Metall Affinitätsreinigung nur. Optional 25 mM N-Ethylmaleimid (Cystein-Protease-Inhibitor, zu sumoylation erhalten), 1 mM Natriumorthovanadat (Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor), und / oder anderen empirisch bestimmt Proteaseinhibitoren zu spezifischen Bereich der Studie basiert | |
| Elutionspuffer | 50 mM HEPES pH 7,3, 200 mM NaCl 200 mM Imidazol | Imidazol verwendet werden, um für Histidin Bindungsstellen konkurrieren in Ni 2 + oder Co 2 + Metall Affinitätsreinigung nur. Andere Verfahren zur Elution kann unterschiedliche Affinität Harze verwendet werden. |
| Semi Dry Transfer Buffer (10x) | In 1 l ddH 2 O: 58 g Tris 29,3 g Glycin 18,75 ml 20% SDS | Mix 100 ml 10x Semi Dry Transfer-Puffer mit 200 ml Methanol und 700 ml ddH 2 Os: Um 1x Semi Dry Transfer Buffer machen |
| Tris Buffered Saline (TBS, 10x) | 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 150 ml 5 M NaCl 300 ml ddH 2 O | Um 1x TBST machen, mischen Sie 100 ml 10x TBS mit 900 ml ddH2O und 1 ml Tween-20 |
Tabelle 1. Lösungen und Puffer.
| Anwendung | Anzahl der Zellen | Nächste Schritte |
|---|---|---|
| Cell Lysis | 150-200 ODs geernteter Zellpellet | Bead schlagen wie in Schritt 2 beschrieben |
| Western Blot von WCE | 2 ODs von lysierten Zellen hergestellt | Bereiten Sie sich für Western-Blot durch TCA-Fällung wie in Schritt 2.6 beschrieben. Δ0.3 OD Einheiten (Δ15 ul) laufen auf Gel |
| Affinity Purification und / oder Pulldown | 30 ODs von lysierten Zellen | Bind, eluieren, und bereiten Proteine wie in den Schritten 3.2 und 3.3 beschrieben |
| Etwa 1-2 ODs (wenn, wie in Schritt 3.3 vorbereitet) | Western-Blot wie in Schritt 3.4 beschrieben |
Tabelle 2. Zusammenfassung von Anwendungen für dieses Protokoll.
| Name | Relevante Genotyp oder Elternstamms | Plasmid (e) oder Kassetteneinfügungsfehler | Referenz |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATa ura3-52-his3 Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ63 lys2-801 | Dohmen et al., 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Hefe GST Sammlung YSC4515-202484078) | diese Studie |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | diese Studie |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Hefe GST Sammlung YSC4515-202484078); pRS425 (BOK 343) | diese Studie |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | diese Studie |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogen getaggt) | diese Studie |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Hefe GST Sammlung YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | diese Studie |
| YOK 2501 | MHY3765, alpha Paarungstyp, ura3-52, lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX | Xie et al., 2010, |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | diese Studie |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Hefe GST Sammlung YSC4515-202484078); pAG425-GAL1-ccdB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | diese Studie |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898); pRS425 (BOK 343) | diese Studie |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3; ubc6Δ :: TRP1; mat-alpha2Δ :: kanMX (YOK 2501) | Slx5-Protein A (BOK 762); pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | diese Studie |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YOK 2397) | msn5Δ :: Hygromycin | diese Studie |
| YOK 2592 | msn5Δ :: Hygromycin in JD52 (YOK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | diese Studie |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | diese Studie |
Tabelle 3. Hefe-Stämme.
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Discussion
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Herstellung von intakten, nativen und posttranslational modifizierte Proteine von Hefe-Zellen für down-stream Applikationen. Bevor dieses Protokoll, ist es wichtig zu bestimmen, ob das Protein von Interesse kann leicht in Proteinextrakte unter denaturierenden Bedingungen 12 hergestellt detektiert werden. Wenn polyklonale Antikörper nicht verfügbar sind, kann es vorteilhaft sein, Epitop-Markierung des Proteins von Interesse, so dass das Fusionsprotein auf Western-Blots nachgewiesen werden kann. In der vorliegenden Protokoll, mit dem wir SIZ1 HA, 6XHIS-V5 oder myc Epitop-Tags markiert und diese Strategie erlaubt uns der eindeutigen Identifizierung des Proteins und seiner sumoyliert Formen auf Western Blots (Abbildung 1). Wir hatten weniger Erfolg Erfassen GFP-markierten Proteine, möglicherweise weil hochaffine Anti-GFP-Antikörper schwer zu erhalten (Daten nicht gezeigt). Ein weiterer wichtiger Punkt betrifft die Expression des Proteins von Interesse. Levels der einzelnenProteine sind sehr unterschiedlich in Hefe-Zellen 4 und einige Proteine überexprimiert, so dass sie erkannt werden und / oder gereinigt werden. Galaktose-induzierbaren Vektoren sind für die High-Level-Expression der Hefe Gen von Interesse 2 verfügbar. Im Falle der Siz1, konnten wir über die gesamte Länge oder verkürztes Protein erkennen, wenn von chromosomal-markierten ORFs oder wenn sie unter Kontrolle des starken induzierbaren Galaktose-Promotor aus einem Plasmid exprimiert (Abbildung 1). Ausgedrückt Die Verwendung von Verkürzungen kann in Struktur / Funktions-Analysen nützlich oder wenn die volle Länge Molekül ist schwer auszudrücken oder instabil. Während Galactose-induzierten Überexpression erhöht Proteinnachweise und Reinigung hat klare Grenzen bei der Untersuchung der physiologischen Bedeutung der eventuellen Zellzyklus-spezifische posttranslationale Modifikationen und Interaktionen. Zum Beispiel ist der sumoylation Siz1 häufigsten bei G2 / M Phase des Zellzyklus und Modifikationen oder Wechselwirkungendie überexprimierten Protein kann durch andere experimentelle Wege bestätigt werden. Schließlich ist der Zusatz von spezifischen Protease, Phosphatase und / oder Proteasom-Inhibitoren ein wichtiger Aspekt für den Erfolg dieses Protokolls. Im Allgemeinen werden die besten Ergebnisse durch Zugabe dieser Inhibitoren vor Zellen eingefroren werden und in Extraktion und Verdünnung Puffer erhalten. Die Zugabe von EDTA, eine Metallionenchelatbildner manchmal in Protease Inhibitor Cocktail ist nicht ratsam, da es mit anschließender Metall Affinitätsreinigungen stören können.
Proteinextrakte von Wulst-Pfosten erhalten werden und als Ausgangsmaterial für die Reinigung von Proteinen geeignet. Insbesondere zeigen wir, dass überexprimiert Slx5 Tragen eines 6XHIS Affinitätstag von WCES mit einem Metall Affinitätsharz (2A) gereinigt werden kann. Posttranslationalen Modifikationen zu erhalten und zu reduzieren Proteinabbau werden 6 × His-markierten Proteine häufig unter denaturierenden Bedingungen gereinigt5. Allerdings gibt es deutliche Vorteile mit der Reinigung von Proteinen unter nativen Bedingungen verbunden. Zum Beispiel können diese Proteine mit Bindungspartnern zusammen zu reinigen oder in nachfolgenden in-vitro-Assays 13,14 verwendet werden. Im Falle Siz1 und Slx5 wir serendipitously bestimmt, dass beide Proteine intrinsische Affinität zum Metall Affinitätsharz, unabhängig von der 6xHis-Tag, und diese Beobachtung vorgeschlagen uns, dass beide Proteine nativen Bestätigungen angenommen. Leider hat die richtige Faltung und biologische Aktivität von gereinigten Proteinen auf einer von Fall zu Fall bestimmt werden. Zu diesem Zweck wird die Anordnung der Affinität und Epitop-Tags entweder am Amino oder Carboxy-Terminus kann einen großen Einfluss auf die Aktivität oder Stabilität des Fusionsproteins und ist eine wichtige Überlegung bei der Planung einer Proteinreinigung Strategie.
Zukünftige Arbeiten werden sich darauf konzentrieren, wie post-translationale Modifikationen während der Reinigung, z. verbessernple durch den Einsatz von Protease-defizienten Hefestämme verschiedenen Proteaseinhibitoren oder andere Affinitäts-Tags. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll in seiner jetzigen oder Puffer-optimierten Form, wie sie für die skalierbare Extraktion, Reinigung und anschließende Untersuchung der viele angehende Hefeproteine ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern der Kerscher Labor für ihre Unterstützung. Wir danken Mark für Hochstrasser Hefestamm MHY3765. Diese Arbeit wurde von der NSF 1051970 (OK) und Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Reisestipendium und Monroe Scholars Program Grant (ES) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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