Summary
高品质的酵母细胞提取物的制备是一个必要的分析单个蛋白质或整个蛋白质组的第一步。在这里，我们描述了一个快速，高效，可靠的同质化协议已被优化，以保持蛋白质的功能，相互作用和翻译后修饰的芽殖酵母细胞。
Abstract
珠跳动的同质化是一个快速和有效的方式来释放DNA，RNA，蛋白质和代谢产物，从芽殖酵母细胞，这是出了名的难以破坏。在这里，我们描述了使用珠磨机，均化器优化，保持的功能，相互作用的蛋白质的翻译后修饰的蛋白质的提取到缓冲区。对数生长期的细胞表达的蛋白质还给出的液体生长介质中生长。生长培养基可以补充试剂诱导蛋白表达诱导型启动子（ 如半乳糖），细胞周期阶段的同步（ 例如，诺考达唑），或抑制蛋白酶体的功能（ 例如，蛋白酶体抑制剂MG132）。细胞再沉淀，再悬浮在适当的缓冲液含有蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂，被立即处理，或在液氮中冷冻，以供稍后使用。同质化是通过6个周期的20秒BEA的d的跳动（5.5米/秒），然后在冰上保温一分钟。通过离心分离所得到的匀浆被清除，小颗粒可通过过滤除去。由此产生的清除的全细胞提取物（WCE）沉淀，用20％三氯乙酸的总蛋白，通过SDS-PAGE，然后通过Western印迹法直接分析。提取物也适合用于亲和纯化的特定蛋白质的翻译后修饰，或共同净化蛋白的分析，检测。大多数蛋白质的纯化协议的情况下，可能需要一些酶和蛋白质的独特条件或缓冲液的组合物的纯化和其他规定的条件下可能是不稳定的或不溶性的。在后者的情况下，提出的协议可提供一个有用的起点，凭经验确定最佳的蛋白提取和纯化珠跳动策略。我们显示了提取和纯化的表位标记的SUMO E3连接酶，SIZ1，一个细胞周期调节蛋白变得SUMO化和磷酸化，以及SUMO针对性的泛素连接酶亚基，Slx5。
Introduction
酵母遗传学的令人敬畏的力量是有口皆碑的，但是从芽殖酵母， 酿酒酵母，天然蛋白的制备和分析往往是充满了问题。后者是由于相当大的机械强度和弹性的酵母细胞壁1。已经描述了不同的手段的酶 ，化学，机械，和基于压力的破坏的酵母细胞获得全细胞蛋白提取物2-6。这些技术有很大的不同，在它们的功效产生代表细胞，天然蛋白质提取物，可用于随后的分析或纯化步骤。例如，可以去除酵母细胞壁溶解酶（ 如酶解酶）和由此产生的spheroblasts会受到剪切，洗涤剂，或渗透裂解，释放蛋白。这种方法已经成功地采用了许多亚细胞分馏的起点，但它需要漫长的孵化与一些蛋白7的稳定性是不兼容的。
专有的化学提取的酵母细胞的蛋白质的的酵母裂解试剂（如清洁剂）是市售的，但在蛋白提取这些试剂的功效在随后的蛋白质的生化特性和其效果并不总是很清楚8。高压均质机，通常被称为法国印刷机，有效突破首先对他们进行高压，然后挤出来通过一个小口压力细胞的酵母细胞。该技术生产出高品质的提取物，但设备是非常昂贵的，可能不适合小批量的细胞或多个样品9。因此，机械破碎酵母细胞在珠磨机往往是原生酵母蛋白制剂10给出的方法。这项技术涉及的酵母细胞壁的机械破碎，用酸娃流下的玻璃珠，它可以与各种振动筛，旋涡仪或珠磨机进行。值得注意的是，此方法可用于同时处理多个更小的样品（1毫升或更小的细胞）。许多不同的有孔玻璃珠或珠磨机干扰矩阵现在市售扰乱几乎任何种类的细胞类型在2ml管。考虑到其他的技术和设备，珠磨机具有额外的好处，酵母细胞中的中断发生得非常快，从而有助于保持翻译后修饰，如SUMO化的，尤其是当使用蛋白酶和/或蛋白酶抑制剂与合适的缓冲液提取物的温度控制。
该协议的重点在温和的条件下，其最终目标保持蛋白质的功能，相互作用和翻译后修饰的快速，有效，可靠的内源性和过度表达的蛋白质提取。生长培养基，细胞裂解液组合物，珠磨机设置优化，保持蛋白质相互作用和SUMO化的和泛素化等翻译后修饰。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
纯化6xHis-tagged蛋白表达在芽殖酵母细胞在天然条件下
1。酵母细胞的生长和诱导蛋白表达
（修改自2）
可选：使用对数生长的酵母培养物表达感兴趣的蛋白质，而不是下面描述的半乳糖诱导的培养。
- 转化细胞的半乳糖+酵母菌株的质粒编码半乳糖诱导的6xHis标签的蛋白给出。例如，试剂列表。
- 合适的选择性培养基（ 如 SD-尿嘧啶）在5毫升含2％蔗糖，接种转化体。孵育在30°CO / N，旋转。
- 使稀释的O / N培养物在600nm处的光密度测量0.3（OD 600 = 0.3），33毫升的选择性培养基中，用2％蔗糖。增长在30°C，晃动（Δ150转）。
- 当培养已达到OD 600 = 0.8-1.5，通过加入17毫升的3倍的YEP 6％的半乳糖（配方在表1中），以使最终浓度为1x YEP用2％的半乳糖诱导表达所需蛋白。总培养体积是现在50毫升。孵育，振摇，在30℃下5-6小时。
注意：培养体积可以变化。在步骤1.3，稀释成所需的最终体积的三分之二的。在步骤1.4中，加入三分之一的最终体积的3倍YEP / 6％的半乳糖。 - 测量OD 600诱导培养物的离心Δ150-200 OD 600单位的细胞在4℃下以5,000 rpm 5分钟
- 重悬细胞沉淀用1 ml冰冷的1X PBS 1X蛋白酶抑制剂和转移到2毫升的螺丝帽筒。
- 离心细胞在4℃下以15,000 rpm的1分钟倒出上清。
- 在液氮中速冻细胞沉淀，随后立即细胞裂解或储存于-80℃下，直到进一步使用。
- 前一步骤中的冷冻细胞沉淀，加入200μl的酸洗过的玻璃珠，加入500μl冰冷的裂解缓冲液（配方在表1中，或使用细胞裂解缓冲液中给出）。
- 简言之吸取向上和向下。它不要求完全重悬细胞沉淀。冰在任何时候都保持管。
注：枪头年底前可能会被切掉上下吹打。 - 在4℃，地方管（S）与细胞成珠磨机，平衡，锁，并按照生产商的指示机器运行。
- 运行含珠打浆机管（次），持续20秒，在5.5米/秒，然后放置在泥泞的冰，持续1分钟。总重复6X。
- 清除所提取的蛋白质通过在15,000 rpm下离心15分钟，在4℃下可选：离心通过一个SpinX过滤去除小颗粒。
- 准备样品的全细胞Extract（WCE）的感兴趣的蛋白质的Western印迹，以确认存在：
- 添加WCE对应的2 OD 600单位的单元格（ 例如，5微升清零的提取物，如果200 OD 600单位的细胞收获），于800微升20％三氯乙酸（TCA）。旋涡混合。
- 在4℃下以15,000 rpm离心2.5分钟倒出上清，但小心保留沉淀。
- 添加800微升2％三氯乙酸颗粒与涡管，然后离心2.5分钟，以15,000 rpm于4℃。倒出上清，但小心保留沉淀。
- 添加100微升TCA样品缓冲液（配方见表1），涡旋解散颗粒。注：如果样品缓冲液变成酸性（除了沉淀后变成黄色），加等分Δ10微升Tris碱[1M]直到样品再次是蓝色。
- 孵育2-5分钟，在100℃加热块。
- 涡AG泉充分溶解，如果仍然存在残余颗粒。用这种方法制备的颗粒饲料是出了名的难以充分溶解。这可能需要Δ10分钟涡旋颗粒完全溶解。
- 商店样品在-80°C，直到进一步的使用。
- 急速冷冻，直到进一步利用剩余清除WCE在-80°C的液态氮和存储等分。
3。批量纯化蛋白酵母细胞匀浆
注：此纯化方法进行了优化，CO 2 +金属亲和树脂纯化6xHis-tagged蛋白。
- 树脂平衡
- 清除WCEΔ20-40 OD 600个单位的细胞制备的样品，加50-100μl的亲和树脂离心管。提取从细胞中不表达所需蛋白或一种非特异性的树脂，如直链淀粉，蛋白质可被用作控制S非特异性结合。
- 用1ml的洗涤缓冲液洗涤树脂5倍：翻转顶部比底部，直到树脂再悬浮，然后在每分钟5000转旋转1分钟，在4℃下吸出上清液。
注意：如果在同一天进行提取和纯化，树脂的平衡可以在提取前进行。
- 亲和纯化的蛋白结合
- 加入100-200微升的澄清的裂解液（Δ20-40 OD 600单位），以50〜100微升的洗涤过 的有孔玻璃珠，使总体积为1毫升用裂解缓冲液。
- 章动或摆动，在4℃孵育2-5小时。
- 自旋为1分钟，在5,000 rpm在4℃下
- 如果需要的话，除未结合的蛋白，用于随后的分析的样品的剩余的上清液。三氯乙酸沉淀详细在WCE（步骤2.6）以上。
- 洗树脂与结合蛋白5倍用1ml的洗涤缓冲液在5,000 rpm，1分钟，然后通过旋4℃下在洗涤过程中保持样品冷。
- 洗脱结合蛋白
- 树脂加入150μl的洗脱缓冲液，章动，在4℃下5分钟，自旋为1分钟，在5,000 rpm在4℃下保存一个新的管中的上层清液。可选：重复2倍和游泳池洗脱。
- 准备洗脱样品的Western blot分析：将25μl洗脱的蛋白质，加入25μl的2倍的锂十二烷基硫酸钠（LDS）样品缓冲液中与2μl的β-巯基乙醇（BME），并在100℃的加热块中孵育2分钟。
注意：也可以使用标准的2X Laemmli样品缓冲液。 - 速冻多余洗脱蛋白在液氮。
可选：带材的剩余树脂的蛋白质与等体积的2×LDS样品缓冲液中于65℃下进行5分钟，取出LDS洗脱的蛋白质，以一个新的管，然后加入2微升的BME的洗脱蛋白，而不是到树脂。此命令是为了防止拆除任何离子或抗体共轭到珠。 - 样品储存在-80°C，直到进一步利用。
- 可视化蛋白质印迹和探针与相应的抗体 。
- 装入10-20μl的各样品给出的SDS-PAGE凝胶中的蛋白质入水口和3-10微升（Δ1-3 OD 600单位）。常规用于此协议包括4-12％的Bis-Tris和8％Tris-甘氨酸凝胶。
- 在200伏50分钟运行凝胶。
- 半干转移蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上，在19伏特，约20-30分钟（在表1中的配方）。
- 1小时RT或O / N挡膜在4％milk/1x的Tris缓冲生理盐水吐温（TBST）在4°C（配方见表1）。
- 在4℃下孵育膜与初级抗体的表位标记的感兴趣的蛋白在4％milk/1x，TBST为1-3小时，在室温下或O / N
- 各5分钟，用1×TBST洗膜3倍。
- 适当的孵育膜次级辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体为1-3小时，在RT。
- 为各15分钟，在一个大的体积为1x TBST洗膜3倍。
- ，ECL底和包裹在保鲜膜覆盖膜。
- 公开膜膜，并开发可视化蛋白质。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们的代表性的结果揭示了用于各种下游应用（总结在表2）的蛋白质的制备重现性，所描述的珠跳动和蛋白质提取协议是有用的。然后通过考马斯亮蓝染色的WCEs的SDS-PAGE表明，蛋白质（〜12> 250 kDa）的广泛的可再现性地从酵母细胞中（ 图1A）萃取。分子量在一定范围内的离散频段的优质蛋白质提取物的指标。提取物的质量可以针对特定抗原标记的蛋白质免疫印迹证实。所示的是具有代表性的结果为半乳糖的高表达，V5标签的SUMO连接酶SIZ1在Δ120kDa（ 图1B）迁移。一般来说，部分降解的蛋白质会运行为多个片段低于预期的重量，但这里只观察全长蛋白。此外，高分子量的给定的蛋白质的加合物可能表明翻译后修饰。例如，我们显示半乳糖过量表达的的SUMO化Siz1Δ440全长SIZ1（ 图1C和图1D）。修改也可以被保留于内源性表达的SIZ1（ 图1E）。
我们提供有代表性的结果，两个核浓的蛋白质，Slx5Siz1Δ440，成功来自我们的WCEs（ 图2A，2B和2C）纯化。值得注意的是，我们证明了一个6xHis标签蛋白（ 图2A; Slx5中 ）可以从我们的WCEs天然和变性条件下亲和纯化。相比之下，Slx5 GST（ 图2B）和Siz1Δ440-HA（ 图2C）缺乏的6xHis表位，但在天然条件下仍与金属亲和力树脂咪唑敏感的方式。我们建议，SIZ1，并在较小程度上小号LX5，能够通过金属协调RING结构域结合的金属亲和力的树脂。虽然，就我们所知，这个特殊的现象还没有被报道，类似的情况中，已经描述了霍乱毒素B亚单位结合Ni 2 +的亲合树脂的方式介导的天然组氨酸残基11。重要的是，这一观察表明，WCE的蛋白质，至少在一部分，本身折叠。
特别是对于研究蛋白质的功能，重要的是要表明，蛋白质复合物的全细胞提取物中保持不变。我们的有代表性的数据显示，Siz1Δ440Slx5 PGK1（胞浆蛋白，作为负荷控制）是存在于WCEs中。 Siz1Δ440其固有的能力，结合金属亲和树脂（比较图2C）的基础上从这些提取物的纯化。当Slx5和SIZ1共表达在酵母细胞中，在洗脱液Slx5水平增加，提高的可能性，Slx5可以与SIZ1（ 图3）。
图1。存在下完好和SUMO化蛋白在酵母细胞裂解液提取后，除另有说明外，制备全细胞提取物，在这个协议中所描述的。分离样品通过SDS-PAGE和Western印迹后，用无论是HA，V5，或myc抗原表位的标记的抗体。酵母菌株被编译于表3。 WB：免疫印迹。 （A）的代表性样品的的TCA沉淀WCE（YOK 2514（两条车道上左）和YOK 2592（两条车道在右边），（Δ0.2OD /车道））的可视化染色凝胶染色（见材料部分）。 （B）巷1＆2：匀浆酵母菌株YOK 2510 YOK 2512含的半乳糖过度表达Siz1-V5/6xHIS的。请注意，不存在的部分降解的蛋白质片段。不知什么原因，这个特定的例子并没有透露SUMO化加合物时，用抗V5抗体。但是，SUMO化的，可以检测到与抗SUMO（抗-SMT3） 如图所示的抗体。 1D。 （C）3巷4：酵母菌株，YOK 2508 YOK 2509含半乳糖过量表达Siz1Δ440-HA的匀浆。 （D）5巷6＆7：半乳糖过度表达Siz1-V5/6xHIS的纯化，用CO 2 +金属亲和树脂，200 mM咪唑洗脱，并用抗V5（泳道5），抗SMT3（车道6）。泳道7是用抗V5抗体重新探测，泳道6。 SIZ1 SUMO化SIZ1加合物（SMT3Ń）。 （E）8巷：JD52野生型细胞含有内源性各级Myc标签SIZ1（YOK 2397）。澄清的裂解液制备哺乳动物裂解液。 9巷：LY沙爹上清液后2小时的孵化与抗V5琼脂糖。注意SIZ1 SUMO化加合物。 点击这里查看大图 。
图2。过度表达纯化环域TALON金属亲和树脂含有蛋白质。半乳糖诱导蛋白质的提取和纯化在这个协议中进行了描述。在天然条件下和变性条件下进行纯化，盐酸胍向样品中加入6M的孵育前，用树脂。裂解液与直链淀粉树脂（A）和TALON金属亲和树脂（T）旋转。用200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。样品通过SDS-PAGE分离和Western印迹（WB）到相应的抗原标记的抗体。）半乳糖诱导的Slx5-V5/6xHIS（YOK 2096）TALON树脂纯化天然和变性条件下B）半乳糖诱导的Slx5 GST（YOK 2071）纯化TALON树脂在本地，但不变性条件。据推测，金属协调RING结构域与TALON树脂时正确折叠。C）半乳糖诱导的Siz1Δ440HA（YOK 2353）也被本地TALON树脂纯化，但没有变性的条件。这些蛋白质不包含6个组氨酸标签，但每含有RING结构域，这自然坐标锌2 +离子和可能赋予的能力TALON金属亲和树脂本质绑定正确折叠时， 点击这里查看大图 。
图3。 TALON金属亲和树脂纯化过表达蛋白。
表达Slx5-GST和Siz1Δ440的HA JD52细胞（株YOKs 2353，2402，2224）的单独或合并（+ / - ）。提取蛋白质的描述（WCE），并用TALON金属亲和树脂（参见图2）的溶胞产物，章动。用200mM咪唑的洗脱缓冲液（洗脱液）从树脂上洗脱蛋白质，LDS样品缓冲液中制备。分离蛋白质通过SDS-PAGE和Western印迹后，用HA标记的抗体，该抗体或（如适用），GST标签。平等装载的蛋白质作为负荷控制与PGK证实。需要注意的是加强中存在Siz1Δ440。Slx5净化点击这里查看大图 。
| 解 | 组件 | 评论 |
|---|---|---|
| 3倍YEP | 30 g酵母提取物60克蛋白胨700毫升DDH 2 O的 | 混合成分和高压灭菌消毒。添加过滤消毒半乳糖6％至3倍YEP个别等分准备使用时 |
| TCA样品缓冲 | 15％甘油80毫米的Tris基地（非pH'd）的3.5％SDS溴酚蓝“的味道。”把音量25毫升DDH 2 O的 | 使用前：1毫升TCA样缓冲液加入40μl的β-巯基乙醇（BME） |
| 洗涤液 | 50毫米HEPES pH值7.3 200毫米氯化钠1％的Triton X-100 20毫米咪唑 | 咪唑用于镍2 +或Co 2 +金属亲和纯化 |
| 裂解缓冲液 | 50毫米HEPES pH值7.3 200毫米氯化钠1％的Triton X-100 10毫米咪唑1个蛋白酶抑制剂的鸡尾酒在使用之前，添加蛋白酶抑制剂。咪唑用于镍2 +或Co 2 +金属亲和纯化。可选的25mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺（半胱氨酸蛋白酶抑制剂，以维护SUMO化的），1 mM的原钒酸钠（蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂），和/或其他经验确定蛋白酶抑制剂研究的基础上特定区域的 | |
| 洗脱缓冲 | 50毫米HEPES pH值7.3 200 mM氯化钠200 mM咪唑 | 咪唑用于组氨酸结合位点竞争在Ni 2 +或Co 2 +金属亲和纯化。其他方法可用于不同的亲和树脂洗脱。 |
| 半干转移缓冲液（10倍） | 1升DDH 2 O：三58克29.3克甘氨酸18.75毫升20％SDS | 为了使1X半干转移缓冲液：混合100毫升10倍半干转移缓冲液用200毫升甲醇和700毫升DDH 2 OS |
| Tris缓冲液（TBS，10倍） | 50毫升1 M的Tris-HCl，pH值8.0 150毫升5 M氯化钠300毫升双蒸2 O | 为了使1X TBST，混合100毫升与900毫升DDH 2 O的10倍TBS，并添加1毫升吐温20 |
表1中。解决方案和缓冲器。
| 应用 | 细胞数量 | 下一步 |
|---|---|---|
| 细胞裂解 | 150-200 ODS收获细胞沉淀 | 胎圈的跳动，如在步骤2中所述 |
| Western Blot检测WCE | 2消耗臭氧层物质的溶解细胞的准备 | 准备在步骤2.6中所描述的TCA沉淀Western印迹。 Δ0.3OD单位（Δ15微升）凝胶用完 |
| 亲和纯化和/或下拉 | 30消耗臭氧层物质的溶解细胞 | 绑定，洗脱，并准备中所描述的步骤3.2和3.3的蛋白质 |
| 约1-2 ODS（若拟在步骤3.3） | 在步骤3.4中所描述的Western blot分析 |
表2中。本议定书的应用概要。
| 名 | 相关的基因型或家长应变 | 质粒（S）或盒式插入 | 参考 |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | 马塔URA3-52 HIS3-Δ200LEU2-3，112 TRP1-Δ63LYS2-801 | 多曼等人 ，1995年 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5（BOK 629 OpenBiosystems酵母GST收集YSC4515 202484078） | 本研究 |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO（BOK 390） | 本研究 |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10GST-Slx5（BOK 629 OpenBiosystems的酵母GST收集YSC4515-202484078）; pRS425（BOK 343） | 本研究 |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425 GAL1 CCDBSiz1Δ440-HA（BOK 795） | 本研究 |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5（内源性标签） | 本研究 |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5（BOK 629 OpenBiosystems的酵母GST收集YSC4515-202484078）; pAG425 GAL1 CCDBSiz1Δ440-HA（BOK 795） | 本研究 |
| YOK 2501 | MHY3765，阿尔法交配型，URA3-52，LYS2-801，TRP1-Δ63，HIS3Δ200，LEU2-Δ1 | ubc4Δ:: HIS3ubc6Δ:: TRP1垫alpha2Δ:: kanMX | 谢等人 ，2010年 |
| YOK 2508 | ubc4Δ:: HIS3;ubc6Δ:: TRP1 MAT-alpha2Δ:: kanMX（YOK 2501） | pAG425 GAL1 CCDBSiz1Δ440-HA（BOK 795） | 本研究 |
| YOK 2509 | ubc4Δ:: HIS3ubc6Δ:: TRP1垫alpha2Δ:: kanMX（YOK 2501） | GAL1/10-GST-Slx5（BOK 629 OpenBiosystems的酵母GST收集YSC4515-202484078）; pAG425 GAL1 CCDBSiz1Δ440-HA（BOK 795） | 本研究 |
| YOK 2510 | ubc4Δ:: HIS3ubc6Δ:: TRP1垫alpha2Δ:: kanMX（YOK 2501） | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO（BOK 898）; pRS425（BOK 343） | 本研究 |
| YOK 2512 | ubc4Δ:: HIS3ubc6Δ:: TRP1垫alpha2Δ:: kanMX（YOK 2501） | Slx5蛋白A（BOK 762）; pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO（BOK 898） | 本研究 |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5（YOK 2397） | msn5Δ::潮 | 本研究 |
| YOK 2592 | msn5Δ:: JD52 潮 （YOK 2514） | slx5Δ:: kanMX4 | 本研究 |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO（BOK 898） | 本研究 |
表3中。酵母菌株。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议的重点编制完整的，原生的，和翻译后修饰的蛋白质从芽殖酵母细胞为下游应用。然后再尝试该协议，以确定是否可以很容易地在变性条件下12制备的蛋白提取物中检测到感兴趣的蛋白质，这是至关重要的。如果不可用多克隆抗体，它可能是有利的，使感兴趣的蛋白质的表位标记的融合蛋白的Western印迹上可检测到。在本协议中，我们标记SIZ1与医管局的6xHis-V5，或myc表位的标签，这一战略使我们能够清楚地识别蛋白质和SUMO化形式在西方墨点法（ 图1）。我们成功检测GFP标记的蛋白质，可能是因为很难得到的高亲和性抗GFP抗体（数据未示出）。另一个关键的问题是关于感兴趣的蛋白质的表达水平。个别水平蛋白质有很大的不同在出芽酵母细胞中，一些蛋白质过度，这样他们可以被检测和/或纯化的。半乳糖诱导的载体可用于感兴趣的2的酵母基因的高水平表达。 SIZ1的情况下，我们能够检测到的全长或截短的蛋白表达时的染色体标记的ORF的强烈诱导半乳糖启动子的控制下表达的质粒（ 图1）。使用截断的结构/功能分析中可能是有用的或全长分子时，难以表达的或不稳定的。半乳糖诱导表达增强蛋白的检测和纯化，研究潜在的细胞周期特异性的翻译后修饰和相互作用的生理相关性时，具有明显的局限性。例如，SIZ1 SUMO化修饰是最普遍的G2 / M期的细胞周期，并且修改或相互作用的高表达的蛋白质可能有其他的实验装置的确认。最后，加入特异性蛋白酶，磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂，在此协议中的成功是重要的考虑。一般情况下，获得最好的结果是通过添加这些抑制剂，细胞冷冻前和到提取和稀释缓冲液。 EDTA的加入，金属离子螯合剂有时存在的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒，是不可取的，因为它可能会干扰随后的金属亲和纯化。
蛋白提取物中，通过以下方式获得珠跳动非常适合作为起始材料的单个蛋白的纯化。具体来说，我们表明，携带6xHis亲标记可以净化的过度表达Slx5的从WCEs使用金属亲和树脂（ 图2A）。为了保持翻译后修饰，减少蛋白质的退化，往往纯化6xHis-tagged蛋白变性条件下5。但是，也有与纯化蛋白质在天然条件下的明显的优势。例如，这些蛋白质可共同纯化与结合配偶体，或可能被用于在随后的体外实验13,14。的情况下SIZ1 Slx5的，我们偶然发现，两种蛋白质表现出金属亲和树脂，独立的6xHis标签固有的亲和力，这种观察向我们提议，的假设两种蛋白质的原生确认。不幸的是，纯化蛋白质的正确折叠和生物活性情况的基础上的情况来确定。为此，在任的氨基或羧基末端的亲和力和表位标签的位置，可能会大大影响融合蛋白的活性或稳定性是一个重要的考虑在规划的蛋白质纯化策略。
今后的工作将重点放在如何提高翻译后修饰在纯化过程中，考试辉通过使用蛋白酶缺陷的酵母菌株，不同的蛋白酶抑制剂，或其他亲和标签。我们预测，这个协议在其当前或缓冲优化适用于可扩展的许多芽殖酵母蛋白的提取，纯化和后续研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢所有成员的Kerscher实验室的鼎力支持。我们感谢：马克Hochstrasser酵母菌株MHY3765的。这项工作是由NSF资助1051970（OK）和霍华德·休斯医学研究所授予本科旅游和梦露学者项目资助（ES）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al.
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
