Summary
Udarbejdelsen af høj kvalitet gær celleekstrakter er et nødvendigt første skridt i analysen af de enkelte proteiner eller hele proteomer. Her beskriver vi en hurtig, effektiv og pålidelig homogenisering protokol for spirende gærceller, der er blevet optimeret til at bevare protein funktioner, interaktioner og post-translationelle modifikationer.
Abstract
Homogenisering af perle slag er en hurtig og effektiv måde at frigive DNA, RNA, proteiner og metabolitter fra spirende gærceller, som er notorisk svære at forstyrre. Her beskriver vi anvendelsen af en kuglemølle homogenisator til udvinding af proteiner i buffere optimeret til at opretholde de funktioner, interaktioner og post-translationelle modifikationer af proteiner. Logaritmisk voksende celler, der udtrykker proteinet af interesse dyrkes i et flydende vækstmedium af valg. Vækstmedierne kan suppleres med reagenser til at inducere proteinekspression fra inducerbare promotorer (fx galactose), synkronisere cellecyklus fase (f.eks nocodazol), eller inhibere proteasom funktion (f.eks MG132). Celler er pelleteres derefter og resuspenderes i en egnet puffer indeholdende protease og / eller phosphataseinhibitorer og enten forarbejdes straks eller frosset i flydende nitrogen til senere brug. Homogenisering opnås ved seks cyklusser af 20 sek bead-slå (5,5 m / sek), hver efterfulgt af et minutters inkubering på is. Den resulterende homogenat klaret ved centrifugering og små partikler kan fjernes ved filtrering. Den resulterende blokerede hele celleekstrakt (WCE) udfældes med 20% TCA til direkte analyse af totale proteiner ved SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting. Ekstrakter er også egnet til affinitetsoprensning af specifikke proteiner, påvisning af post-translationelle modifikationer, eller analyse af co-rensende proteiner. Som det er tilfældet for de fleste proteinoprensningsmetoder protokoller, kan nogle enzymer og proteiner kræver unikke betingelser eller puffersammensætninger for deres rensning og andre kan være ustabil eller uopløselig under de angivne betingelser. I sidstnævnte tilfælde kan det fremlagte protokol giver et nyttigt udgangspunkt for empirisk bestemme den bedste perle-bankende strategi for protein ekstraktion og oprensning. Vi viser udvinding og oprensning af en epitop-tagget SUMO E3 ligase, Siz1, en cellecyklusreguleret protein, der både bliver sumoylated og phosphoryleret, samt en SUMO målrettet ubiquitinligase subunit Slx5.
Introduction
Den overvældende strøm af gær genetik er legendarisk, men forberedelse og analyse af native proteiner fra spirende gær, Saccharomyces cerevisiae, er ofte fyldt med problemer. Sidstnævnte skyldes den betydelige mekanisk styrke og elasticitet af gærcellevæggen 1.. Forskellige midler er blevet beskrevet til enzymatisk, kemisk, mekanisk og trykbaseret afbrydelse af gærceller at opnå helcelle proteinekstrakt 2-6. Disse teknikker varierer meget i deres effektivitet til at give celle-repræsentative, indfødte proteinekstrakter, der kan bruges til efterfølgende analyser eller oprensningstrin. For eksempel kan gærcellevæggen fjernes med lytiske enzymer (f.eks Zymolyase) og deraf spheroblasts kan forstyrres af forskydning, rengøringsmidler eller osmotisk lysis at frigive proteiner. Denne fremgangsmåde er med held blevet anvendt som udgangspunkt for mange subcellulære fraktioneringer men det kræver langvarige inkubationerder ikke er forenelige med stabiliteten af nogle proteiner 7.
Farmaceutiske gær lysis reagenser (såsom detergenter) for kemisk ekstraktion af proteiner af gærceller er kommercielt tilgængelig, men effekten af disse reagenser i proteinekstraktion og deres virkning på efterfølgende biokemisk karakterisering af proteiner er ikke altid klart 8. Højt tryk homogenisatorer, der ofte omtales som franske presser, effektivt bryde gærceller ved først at udsætte dem for højt tryk og derefter ekstrudere dem gennem en lille åbning i en trykcelle. Denne teknik producerer høj kvalitet ekstrakter men udstyret er meget dyrt og kan ikke være egnet til små mængder af celler eller flere prøver 9. Derfor, mekanisk afbrydelse af gærceller i en kuglemølle er ofte den foretrukne metode til native gær proteinpræparater 10. Denne teknik indebærer mekanisk forstyrrelse af gærcellevæggen med syre-wakaste glasperler, som kan udføres med en række forskellige rystere, vortexers eller perle møller. Især kan denne fremgangsmåde anvendes til samtidigt behandle flere mindre prøver (1 ml celler eller mindre). Mange forskellige perler eller kuglemølle disruption matricer er nu kommercielt tilgængelige at forstyrre næsten enhver form for celletype i 2 ml rør. Betragtning af de andre teknikker og udstyr, en kuglemølle har den fordel, at afbrydelsen af gærceller sker meget hurtigt, hvilket bidrager til at bevare posttranslationelle modifikationer såsom sumoylation, især når de relevante buffere med protease og / eller proteasomhæmmere udnyttes og temperaturen af ekstrakter styres.
Denne protokol fokuserer på hurtig, effektiv og pålidelig udvinding af endogene og over-udtrykte proteiner under blide forhold med det ultimative mål at bevare protein funktion, interaktioner, og post-translationelle modifikationer. Vækstmedier, cellelyse bufferkompositioner og perlemølle indstillinger er optimeret til at bevare protein interaktioner og post-translationelle modifikationer såsom sumoylation og ubiquitylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Oprensning af 6xHis-mærkede proteiner udtrykt i spirende gærceller under native betingelser
1.. Vækst af Gærcellers og induktion af Protein Expression
(Modificeret fra 2)
EKSTRA: Brug logaritmisk voksende gærkulturer udtrykker proteinet af interesse i stedet for de galactose-inducerede kulturer beskrevet nedenfor.
- Transformere celler af en Gal + gærstamme med et plasmid, der koder et galactose-inducerbare 6xHis-taggede protein valg. Se for eksempel reagenser listen.
- Inokulere transformanter i 5 ml passende selektive medier (f.eks SD-uracil) indeholdende 2% sukrose. Inkuber ved 30 ° CO / N, roterende.
- Fortynd O / N-kulturen, således at den optiske densitet ved 600 nm måler 0,3 (OD600 = 0,3) i 33 ml selektive medier med 2% saccharose. Grow ved 30 ° C, rysten (Δ150 rpm).
- Når kulturen har nået OD600 = 0,8-1.5, Inducere ekspression af det ønskede protein ved tilsætning af 17 ml 3x YEP med 6% galactose (Opskrift i tabel 1), for en endelig koncentration på 1x YEP med 2% galactose. Samlet kultur volumen er nu 50 ml. Inkuber omrystning ved 30 ° C i yderligere 5-6 timer.
Bemærk: kulturen volumen kan varieres. I trin 1.3, fortyndet i to tredjedele af det ønskede slutvolumen. I trin 1.4, tilsættes en tredjedel slutvolumenet på 3x YEP / 6% galactose. - Måle OD600 af den inducerede kultur og centrifuger Δ150-200 OD 600 enheder af celler i 5 minutter ved 5.000 rpm ved 4 ° C.
- Resuspender cellepelleten med 1 ml iskold 1x PBS med 1x proteasehæmmer cocktail og overføres til en 2 ml rør med skruelåg.
- Centrifuger cellerne i 1 minut ved 15.000 rpm ved 4 ° C. Dekanteres supernatant.
- Snap fryse cellepellet i flydende nitrogen, efterfulgt af øjeblikkelig cellelysis eller opbevaring ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Til den frosne cellepellet fra det foregående trin, 200 pi syre-vaskede glasperler og 500 pi iskold lysepuffer (Opskrift i tabel 1 eller bruger cell lysisbuffer valg) tilsættes.
- Kortvarigt pipette op og ned. Det er ikke nødvendigt for fuldt ud at resuspendere cellepelleten. Hold rør på is på alle tidspunkter.
Bemærk: Den ende af pipettespidsen kan blive skåret inden pipettering op og ned. - Ved 4 ° C, sted røret (r) med celler i perlemølle, balance, lås, og kør maskinen ifølge producentens anvisninger.
- Kør perlen beater indeholdende røret (rørene) i 20 sekunder ved 5,5 m / sek, og derefter placere på sjappet is i 1 min. Gentag 6x i alt.
- Rydde ekstraherede proteiner ved centrifugering i 15 minutter ved 15.000 rpm ved 4 ° C. VALGFRIT: fjerne små partikler ved centrifugering gennem et Spinx filter.
- Forbered en prøve af hele cellen eXtract (WCE) for at bekræfte tilstedeværelsen af proteinet af interesse ved Western Blot:
- Tilføj WCE tilsvarende med 2 OD 600 enheder af celler (fx 5 pi blokerede ekstrakt hvis 200 OD 600 enheder af celler blev høstet) til 800 pi 20% trichloreddikesyre (TCA). Vortex at blande.
- Centrifuger i 2,5 minutter ved 15.000 rpm ved 4 ° C. Dekanteres supernatanten, men vær omhyggelig med at bevare pellet.
- Tilføj 800 pi 2% TCA til pelleten og vortex røret, efterfulgt af centrifugering i 2,5 minutter ved 15.000 rpm ved 4 ° C. Dekanteres supernatanten, men vær omhyggelig med at bevare pellet.
- Tilføj 100 ul TCA prøvebuffer (Opskrift i tabel 1), vortex at opløse pellet. Bemærk: Hvis prøven buffer bliver sur (bliver gult) efter tilsætning til pelleten, tilsættes portioner af Δ10 pi Tris-base [1M], indtil prøven er blå igen.
- Inkuber i en 100 ° C varmeblok i 2-5 min.
- Vortex again at opløses fuldstændigt, hvis rester af pellet er stadig til stede. Pellets fremstillet ved denne metode er notorisk svære at opløses fuldstændigt. Det kan tage Δ10 min for vortexing at opløse pellets.
- Opbevar prøven ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Snap fryse portioner af de resterende ryddet WCE i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C indtil videre anvendelse.
3.. Batch Oprensning af proteiner fra gær Cell Homogenater
Bemærk: Denne oprensningsmetode er optimeret til oprensning af 6xHis-mærkede proteiner på Co 2 + metal affinitetsharpiks.
- Resin Ækvilibrering
- For en prøve af ryddet WCE fremstillet af Δ20-40 OD 600 enheder af celler, tilsættes 50-100 ul affinitetsharpiks til et mikrocentrifugerør. Proteiner ekstraheret fra celler, der ikke udtrykker det ønskede protein eller en uspecifik harpiks, såsom amylose, kan anvendes som kontrols for uspecifik binding.
- Vask af resin 5x med 1 ml vaskebuffer: invertsukker top-over-bund indtil harpiksen resuspenderes, og derefter spinde i 1 min ved 5000 rpm ved 4 ° C. Aspirere supernatanten.
Bemærk: Hvis der udføres ekstraktion og oprensning på samme dag, kan harpiks ligevægt udføres før ekstraktion.
- Proteinbinding til affinitetsoprensning
- Tilføj 100-200 ml klaret lysat (Δ20-40 OD 600 enheder) til 50-100 pi vaskede perler, og bringe det totale volumen til 1 ml med lysisbuffer.
- Inkuber med nutationen eller rokkende ved 4 ° C i 2-5 timer.
- Spin i 1 min ved 5.000 rpm ved 4 ° C.
- Hvis det ønskes, gemme en prøve af det resterende supernatant til efterfølgende analyse af ubundne proteiner. TCA udfældes som beskrevet ovenfor for WCE (trin 2.6).
- Vask af resin med bundne proteiner 5x med 1 ml vaskebuffer, efterfulgt af en centrifugering i 1 min ved 5000 rpm ved4 ° C. Opbevare prøver koldt under vask.
- Eluering af bundne proteiner
- Tilsæt 150 pi elueringspuffer til harpiks, nutate ved 4 ° C i 5 min, centrifugering i 1 min ved 5000 rpm ved 4 ° C og gemme supernatanten i et nyt rør. VALGFRIT: Gentag 2x og pool elueringer.
- Forbered eluerede prøve til Western blot: Til 25 pi eluerede proteiner, 25 ul 2x lithium dodecylsulfat (LDS) prøvebuffer tilsættes med 2 pi β-mercaptoethanol (BME) og inkuberes i en 100 ° C varmeblok i 2 min.
Bemærk: Standard 2X Laemmli prøvepuffer kan også anvendes. - Snap fryse overskydende eluerede protein i flydende nitrogen.
EKSTRA: bånd resterende proteiner fra harpiks med et tilsvarende volumen 2x LDS prøvebuffer ved 65 ° C i 5 minutter, fjerne SDH-eluerede proteiner til et nyt rør, hvorefter der tilsættes 2 pi BME til de eluerede proteiner ikke til harpiksen. Denne ordre er at forhindre fjernelse af alle ioner eller antistoffer, der er ConjugaTed til perlerne. - Opbevar prøver ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Western Blot og probe med passende antistoffer for at visualisere proteiner.
- Load 10-20 pi (Δ1-3 OD 600 enheder) af hver prøve og 3-10 ul af et protein stige i en SDS-PAGE-gel af valg. Geler rutinemæssigt anvendes til denne protokol omfatter 4-12% Bis-Tris og 8% Tris-glycin.
- Kør gel ved 200 V i 50 min.
- Overføre proteiner fra gelen til en PVDF-membran ved halvtør overførsel ved 19 V i 20-30 min (opskrift i tabel 1).
- Blok membran i 4% milk/1x Tris pufret saltvand-Tween (TBST) i 1 time ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C (opskrift i tabel 1).
- Inkuber membranen med primært antistof til epitop-taggede protein af interesse i 4% milk/1x TBST i 1-3 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C.
- Vask membran 3x i 5 min hver med 1x TBST.
- Inkuber membranen med passendesekundær peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret antistof i 1-3 timer ved stuetemperatur.
- Vask membran 3x i 15 minutter hver i et stort volumen af 1x TBST.
- Dæk membran med ECL substrat og wrap i Saran wrap.
- Eksponere membran til film og udvikle at visualisere proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores repræsentative resultater viser, at den beskrevne perle-slået og proteinekstraktion protokol er nyttig til reproducerbar fremstilling af proteiner til en række efterfølgende anvendelser (opsummeret i tabel 2). SDS-PAGE efterfulgt af Coomassie-farvning af WCEs viser, at en lang række proteiner (~ 12 til> 250 kDa) kan reproducerbart udvindes fra gærceller (figur 1A). Adskilte bånd over en række molekylvægte er vejledende af høj kvalitet proteinekstrakter. Kvaliteten af ekstrakter kan bekræftes ved western blotting specifikke epitop-mærkede proteiner. Vist er et repræsentativt resultat for galactose-overudtrykt, V5-tagged SUMO ligase Siz1 der migrerer på Δ120kDa (figur 1B). Generelt vil delvis nedbrudte proteiner køre som flere fragmenter under den forventede vægt, men her kun protein i fuld længde observeres. Derudover højmolekylære addukter af et givet proteinkan indikere post-translationelle modifikationer. For eksempel viser vi galactose-overudtrykt sumoylated Siz1Δ440 og fuld længde Siz1 (fig. 1C og figur 1D). Ændringer kan også bevaret på endogent udtrykt Siz1 (figur 1E).
Vi giver repræsentative resultater, at to nukleare berigede proteiner, Slx5 og Siz1Δ440, held blev oprenset fra vores WCEs (figur 2A, 2B og 2C). Især viser vi, at en 6xHis-tagget protein (figur 2A, Slx5) kan være affinitetsoprenset fra vores WCEs både under native og denaturerende betingelser. I modsætning hertil mangler Slx5-GST (fig. 2B) og Siz1Δ440-HA (figur 2C) en 6xHis epitop men under native betingelser stadig interagere med metal-affinitetsharpiks i en imidazol-følsom måde. Vi foreslår, at Siz1, og i mindre grad SLX5, er i stand til at binde metal-affinitetsharpiks via deres metal-koordinerende RING domæne. Mens vores viden, har denne særlige fænomen endnu ikke blevet rapporteret, har en lignende situation er blevet beskrevet som koleratoksin B-subunit binder Ni2 + affinitetsharpiks på en måde medieret af dens naturlige histidinrester 11. Vigtigere er det, denne observation tyder på, at proteiner i WCE er, i det mindste delvist, indbygget foldet.
Især for studiet af protein funktion er det vigtigt at vise, at protein-komplekser forbliver intakt i hele celleekstrakter. Vores repræsentative data afslører, at Siz1Δ440, Slx5 og PGK1 (cytosolprotein der fungerer som en belastning kontrol) var til stede i WCEs. Siz1Δ440 blev oprenset fra disse ekstrakter baseret på dets iboende evne til at binde til metal affinitet harpiks (sammenlign figur 2C). Når Slx5 og Siz1 blev co-udtrykt i gærceller blev Slx5 niveauer i eluaterne steget,øge muligheden for, at Slx5 kan interagere med Siz1 (figur 3).
Figur 1. Tilstedeværelse af intakte og sumoylated proteiner i gær cellelysatet efter ekstraktion. Medmindre andet er angivet helcelleekstrakter blev fremstillet som beskrevet i denne protokol. Prøver blev separeret ved SDS-PAGE og efter Western blotting blev probet med antistoffer til enten HA, V5, eller myc epitopmærker. Gærstammer er opgjort i tabel 3.. WB: western blot. (A) Repræsentative prøver af TCA-udfældet WCE (fra YOK 2514 (to baner på venstre) og YOK 2592 (to baner til højre), (Δ0.2 OD / bane)) blev visualiseret ved farvning med en gel plet ( se Materialer afsnit). (B) Bane 1 & 2: homogenater af gærstamme YOK 2510 og YOK 2512 indeholdende galactose-overudtrykte Siz1-V5/6xHIS. Bemærk fraværet af delvis nedbrudte proteinfragmenter. Af ukendte årsager er dette bestemt prøve ikke afsløre sumoylated addukter når probes med et anti-V5-antistof. Dog kan sumoylation påvises med et anti SUMO (anti-Smt3) antistof som vist i fig. 1D. (C) Bane 3 og 4: homogenater af gærstamme YOK 2508 og YOK 2509 indeholdende galactose-overudtrykt Siz1Δ440-HA. (D) Bane 5, 6 & 7: galactose-overudtrykte Siz1-V5/6xHIS blev oprenset ved hjælp af Co2 + metal affinitetsharpiks, elueret med 200 mM imidazol og probet med anti-V5 (bane 5), anti-Smt3 (bane 6). Bane 7 er et reprobe af bane 6 med anti-V5-antistof. og viser både Siz1 og sumoylated Siz1 addukter (Smt3 n). (E) Lane 8: JD52 vildtypeceller indeholdende endogene niveauer af myc-tagget Siz1 (YOK 2397). Klaret lysat fremstillet under anvendelse af en mammal lysisbuffer. Bane 9: Lykompensere supernatanten efter en 2 timers inkubation med anti-V5 agarose. Bemærk sumoylated addukter af Siz1. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Oprensning af overudtrykt RING-domæne indeholdende proteiner med TALON Metal Affinity harpiks. Galaktose induktion, protein ekstraktion og oprensning blev udført som beskrevet i denne protokol. Oprensning blev udført under native betingelser og denaturerende betingelser, som guanidiniumhydrochlorid blev tilsat til prøven til 6 M før inkubering med harpiks. Lysat blev roteret med både amylose kontrol harpiks (A) og TALON Metal Affinity resin (T). Proteiner blev elueret med 200 mM imidazol i elueringsbuffer. Prøver blev separeret ved SDS-PAGE og western blottet(WB) med et antistof til den relevante epitopmærke. A) Galactose-induceret Slx5-V5/6xHIS (YOK 2096) blev oprenset med TALON harpiks under både native og denaturerende betingelser B) Galactose-induceret Slx5-GST (YOK 2071) var oprenset med TALON harpiks i nativ, men ikke denaturerende betingelser. Formentlig metallet koordinerende RING domæne interagerer med TALON harpiks når foldet korrekt. C) Galactose-induceret Siz1Δ440-HA (YOK 2353) blev også oprenset med TALON harpiks i nativ, men ikke denaturerende betingelser. Disse proteiner indeholder ikke 6xhis tags, men hver indeholder dog en RING domæne, hvilket naturligvis koordinerer Zn 2 +-ioner og kan give mulighed for reelt binde TALON Metal affinitetsharpiks når foldet korrekt. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Co-oprensning af overudtrykt proteiner på TALON Metal Affinity harpiks.
Slx5-GST og Siz1Δ440-HA blev udtrykt sig selv eller i kombination (+ / -) i JD52 celler (stammerne YOKs 2353, 2402, 2224 henholdsvis). Proteiner blev ekstraheret som beskrevet (WCE) og lysater nuteres med TALON Metal Affinity resin (se figur 2). Proteiner blev elueret fra harpiksen med 200 mM imidazol i elueringsbuffer (Eluat) og fremstillet i SDH-prøvebuffer. Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og efter Western blotting blev probet med et antistof mod HA-mærket eller GST tag som passende. Lige belastning af proteiner bekræftes med PGK som loading kontrol. Bemærk at Slx5 rensning forstærkes ved tilstedeværelsen af Siz1Δ440. Klik her for at se større billede .
| Opløsning | Komponenter | Kommentarer |
|---|---|---|
| 3x YEP | 30 g gærekstrakt 60 g pepton i 700 ml ddH2O | Bland ingredienserne og autoklaveres for at sterilisere. Tilføj filtersteriliseret galactose til 6% til individuelle portioner af 3x YEP når de er klar til brug |
| TCA Sample Buffer | 15% glycerol 80 mM Tris Base (non-pH'd) 3,5% SDS bromphenolblåt "at smage." Bring volumen til 25 ml med ddH2O | Før brug: Tilsæt 40 ul β-mercaptoethanol (BME) til 1 ml TCA Sample Buffer |
| Wash Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 20 mM imidazol | Imidazol anvendes til Ni 2 + eller Co2 + metal affinitetsoprensning kun |
| Lysis Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCl 1% Triton X-100 10 mM imidazol 1x proteaseinhibitor cocktail Tilføj proteasehæmmer cocktail umiddelbart før brug. Imidazol anvendes til Ni 2 + eller Co2 + metal affinitetsoprensning alene. EKSTRA: 25 mM N-ethylmaleimid (cystein proteaseinhibitor at bevare sumoylation), 1 mM natriumorthovanadat (proteintyrosinphosphatase-inhibitor), og / eller andre empirisk bestemte proteasehæmmere baseret på specifikke område af undersøgelsen | |
| Elution Buffer | 50 mM HEPES pH 7,3 200 mM NaCI 200 mM imidazol | Imidazol bruges til at konkurrere om histidin bindingssteder i Ni 2 + eller Co 2 + metal affinitetsoprensnings alene. Andre metoder til eluering kan anvendes til forskellige affinitet harpikser. |
| Semi Dry Transfer Buffer (10x) | I 1 liter ddH2O: 58 g Tris 29.3 g Glycine 18.75 ml 20% SDS | For at gøre 1x Semi Dry Transfer Buffer: mix 100 ml 10x Semi Dry Transfer Buffer med 200 ml methanol og 700 ml Hedeselskabet 2 Os |
| Tris saltvand (TBS, 10x) | 50 ml 1 M Tris-HCI, pH 8,0 150 ml 5 M NaCl 300 ml ddH2O | For at gøre 1x TBST, bland 100 ml 10x TBS med 900 ml ddH2O og tilsæt 1 ml Tween-20 |
Tabel 1. Løsninger og buffere.
| Ansøgning | Mængden af celler | Næste trin |
|---|---|---|
| Cellelyse | 150-200 OD'erne af høstede cellepellet | Bead slå som beskrevet i trin 2 |
| Western blot af WCE | 2 OD'erne af lyserede forberedt celler | Forbered Western blot ved TCA fældning som beskrevet i trin 2.6. Δ0.3 OD enheder (Δ15 ul) løber ud på gel |
| Affinitetsoprensning og / eller pulldown | 30 OD af lyserede celler | Bind, elueres, og forberede proteiner som beskrevet i trin 3.2 og 3.3 |
| Ca. 1-2 OD (hvis fremstillet som i trin 3.3) | Western-blot som beskrevet i trin 3.4 |
Tabel 2. Oversigt over ansøgninger til denne protokol.
| Navn | Relevant genotype eller Parent Strain | Plasmid (r) eller kassette indsættelse | Henvisning |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATa ura3-52 his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ63 lys2-801 | Dohmen et al., 1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gær GST kollektion YSC4515-202.484.078) | denne undersøgelse |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO (BOK 390) | denne undersøgelse |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gær GST kollektion YSC4515-202.484.078), pRS425 (BOK 343) | denne undersøgelse |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denne undersøgelse |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5 (endogent tagget) | denne undersøgelse |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gær GST kollektion YSC4515-202.484.078) pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denne undersøgelse |
| YOK 2501 | MHY3765, alpha parring type ura3-52, lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: KanMX | Xie et al. 2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1 Mat-alpha2Δ :: KanMX (YOK 2501) | pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denne undersøgelse |
| YOK 2509 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: KanMX (YOK 2501) | GAL1/10-GST-Slx5 (BOK 629, OpenBiosystems Gær GST kollektion YSC4515-202.484.078) pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA (BOK 795) | denne undersøgelse |
| YOK 2510 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: KanMX (YOK 2501) | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898), pRS425 (BOK 343) | denne undersøgelse |
| YOK 2512 | ubc4Δ :: HIS3, ubc6Δ :: TRP1, mat-alpha2Δ :: KanMX (YOK 2501) | Slx5-Protein A (BOK 762), pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | denne undersøgelse |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5 (YOK 2397) | msn5Δ :: hygromycin | denne undersøgelse |
| YOK 2592 | msn5Δ :: hygromycin i JD52 (YOK 2514) | slx5Δ :: kanMX4 | denne undersøgelse |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO (BOK 898) | denne undersøgelse |
Tabel 3. Gærstammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol fokuserer på forberedelsen af intakt, indfødte og posttranslationelt modificerede proteiner fra spirende gærceller for down-stream-applikationer. Inden du forsøger denne protokol er det afgørende at fastslå, om proteinet af interesse kan let påvises i proteinekstrakter udarbejdet under denaturerende betingelser 12.. Hvis polyklonale antistoffer ikke er tilgængelige, kan det være fordelagtigt at epitopmærke proteinet af interesse, således at fusionsproteinet kan detekteres på Western blots. I den nuværende protokol, tagged vi SIZ1 med HA, 6xHis-V5 eller myc epitopmærker, og denne strategi tillod os til klart at identificere proteinet og dets sumoylated formularer på vestlige blots (Figur 1). Vi havde mindre succes påvisning GFP-mærkede proteiner, muligvis fordi høj affinitet anti-GFP-antistoffer er svære at opnå (data ikke vist). Et andet vigtigt problem vedrører ekspressionsniveauet af proteinet af interesse. Niveauer af individuelleproteiner varierer meget i spirende gærceller 4 og nogle proteiner skal overudtrykt så de kan påvises og / eller oprenses. Galactose-inducerbare vektorer er til rådighed for højt niveau ekspression af gær genet af interesse 2.. I tilfælde af Siz1, var vi i stand til at detektere den fulde længde eller trunkeret protein, når udtrykt fra kromosomalt mærkede ORF'er eller når udtrykkes under kontrol af den stærke inducerbare galactose promotor fra et plasmid (figur 1). Brugen af trunkeringer kan være nyttige i struktur / funktion analyser, eller når den fulde længde molekylet er vanskeligt at udtrykke eller ustabil. Mens galactose-induceret overekspression øger protein detektering og oprensning, det har klare begrænsninger, når man studerer den fysiologiske relevans af potentielle cellecyklus-specifikke post-translationelle modifikationer og interaktioner. For eksempel er sumoylation af Siz1 mest udbredt på G2 / M fase af cellecyklus, og ændringer eller interaktionerDen overudtrykte protein kan have at blive bekræftet af andre eksperimentelle midler. Endelig tilsætning af specifikke protease, fosfatase og / eller proteasomhæmmere er en vigtig overvejelse for succes i denne protokol. Generelt er de bedste resultater opnået ved tilsætning disse inhibitorer før celler nedfryses og i udvinding og fortynding buffere. Tilføjelsen af EDTA, en metalion chelator undertiden til stede i proteasehæmmere, cocktails, er ikke tilrådeligt, da det kan forstyrre senere metal affinitet udrensninger.
Proteinekstrakter opnået ved perle-slå, er velegnet som udgangsmateriale til oprensning af individuelle proteiner. Konkret viser vi, at overudtrykte Slx5 bærer en 6xHis affinitetsmærke kan oprenses fra WCEs bruger metal affinitetsharpiks (figur 2A). At bevare post-translationelle modifikationer og reducere proteinnedbrydning, er 6xHis-mærkede proteiner ofte oprenset under denaturerende betingelser5.. Der er imidlertid tydelige fordele forbundet med oprensning af proteiner under native betingelser. For eksempel kan disse proteiner co-oprenses med bindingspartnere eller kan anvendes i efterfølgende in vitro 13,14. I tilfælde af Siz1 og Slx5 vi serendipitously fastslået, at begge proteiner udviser egentlig affinitet for metallet affinitetsharpiks, uafhængigt af 6xHis-tag, og denne observation foreslået os at begge proteiner antaget native bekræftelser. Desværre korrekt foldning og biologiske aktivitet oprensede proteiner skal afgøres fra sag til sag. Til dette formål, placering af affinitet og epitop tags ved enten amino-eller carboxyterminalen kan i høj grad påvirke aktiviteten eller stabiliteten af fusionsproteinet og er en vigtig overvejelse i planlægningen af et proteinoprensning strategi.
Det fremtidige arbejde vil fokusere på hvordan man kan styrke post-translationelle modifikationer under rensningen, til eksamenple gennem brug af protease deficiente gærstammer, forskellige proteaseinhibitorer eller andre affinity tags. Vi forudser, at denne protokol i dets nuværende eller buffer-optimeret formular der gælder for skalerbare ekstraktion, oprensning og efterfølgende undersøgelse af mange spirende gær proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af Kerscher laboratorium for deres støtte. Vi takker Mark Hochstrasser for gærstamme MHY3765. Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud 1051970 (til OK) og en Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Rejselegat og Monroe Scholars Program Grant (ES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al.
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
