Summary
高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。
Abstract
ビーズ打つことによって均質化は、悪名高い混乱させるのは難しいです出芽酵母の細胞からDNA、RNA、タンパク質、代謝物を解放するために、高速かつ効率的な方法です。ここでは、機能的相互作用およびタンパク質の翻訳後修飾を維持するために最適化されたバッファーにタンパク質を抽出するためのビーズミル、ホモジナイザーの使用を記載している。目的のタンパク質を発現する対数的に増殖している細胞は、選択した液体増殖培地で増殖させる。増殖培地は、誘導性プロモーター（ 例えば、ガラクトース）からのタンパク質発現を誘導するための試薬 を補充することができる（ 例えば 、ノコダゾール）の細胞周期段階を同期させる、または（ 例えば、MG132）プロテアソーム機能を阻害する。次に細胞をペレット化し、プロテアーゼおよび/またはホスファターゼ阻害剤を含有する適当な緩衝液中に再懸濁しており、すぐに処理されるか、後で使用するために液体窒素中で凍結される。均質化は20秒BEAの6サイクルによって達成されるD-鼓動（5.5メートル/秒）、氷上で1分間インキュベートした各。得られたホモジネートを遠心分離によってクリアされ、小さな微粒子を濾過により除去することができる。結果クリア全細胞抽出物（WCE）はウェスタンブロッティング続いSDS-PAGEによる全タンパク質の直接分析のためにTCA 20％を使用して沈殿させる。抽出物はまた、特定のタンパク質のアフィニティー精製、翻訳後修飾、または共精製タンパク質の分析の検出に適している。ほとんどのタンパク質精製プロトコルの場合と同様に、いくつかの酵素やタンパク質は、それらの精製および他のためのユニークな条件やバッファー組成物が記載された条件の下で不安定になったり、不溶性のかもしれませんが必要な場合があります。後者の場合、提示プロトコルは、経験的にタンパク質抽出および精製のための最良のビード打ち戦略を決定するために有用な出発点を提供することができる。私たちは、エピトープタグSUMO E3リガーゼ、SIZ1、細胞周期の抽出と精製を示すSlx5、SUMO化およびリン酸化と同様、SUMO-ターゲットユビキチンリガーゼのサブユニットの両方になるタンパク質を規制。
Introduction
酵母遺伝学の素晴らしいパワーは伝説ですが、出芽酵母、 サッカロマイセス·セレビシエ、から天然タンパク質の調製及び分析は、多くの場合、問題をはらんでいます。後者は、酵母細胞壁1のかなりの機械的強度及び弾性のためである。別の手段は、酵素的、化学的、機械的、圧力ベースの全細胞タンパク質抽出物2-6を得るために、酵母細胞の破壊のために記載されている。これらの技術は、その後の分析または精製工程に使用することができる細胞代表、天然のタンパク質抽出物を得るためにそれらの効力が大きく異なる。例えば、酵母細胞壁溶解酵素（ 例えばザイモリアーゼ）、得フェロブラストで除去することができるが、剪断、界面活性剤、またはタンパク質を放出する浸透溶解によって破壊することができる。このアプローチは成功し、多くの細胞下分画するための出発点として使用されるが、それは長いインキュベーションを必要とされていますそれはいくつかのタンパク質7の安定性と互換性がありません。
酵母細胞のタンパク質の化学的抽出のための独自の酵母溶解試薬 （例えば、界面活性剤など）、市販されているが、これらのタンパク質抽出における試薬およびタンパク質のその後の生化学的特徴付けに対する効果の有効性は必ずしも明らかではない8。高圧ホモジナイザーは、しばしばフランス語押下と呼ばれる、効果的に第1高圧にそれらを施し、次いで圧力セル内の小さな開口部を介してそれらを押し出すことによって酵母細胞を破壊する。この技術は、高品質の抽出物を生成したが装置は非常に高価であり、細胞または複数のサンプル9少量のに適しているわけではない。したがって、ビーズミルで酵母細胞の機械的破壊は、しばしば、天然の酵母タンパク質調製物10を選択する方法である。この技術は、酸のWAを有する酵母細胞壁の機械的破壊を伴うシェーカー、vortexersまたはビーズミルの様々行うことができるガラスビーズを流した。特に、この方法は、同時に複数のより小さな試料（1 mlの細胞以下）を処理するために使用することができる。さまざまなビーズやビーズミル混乱行列は今や2 mlのチューブに細胞型のほとんどすべての種類を妨害するために市販されている。他の技術と設備を考慮し、ビーズミル、プロテアーゼおよび/またはプロテアソーム阻害剤と適切なバッファが利用される場合は特に、例えばSUMO化などの翻訳後修飾を維持するのに役立ち、これ酵母細胞の破壊は非常に速く起こるという利点を有しているそして抽出物の温度が制御される。
このプロトコルは、内因性および過剰発現タンパク質の機能を維持するために究極の目標と穏やかな条件の下でタンパク質相互作用、および翻訳後修飾の、高速で効果的、かつ信頼性の高い抽出に焦点を当てています。増殖培地、細胞溶解バッファー組成物、及びビーズミルの設定は、タンパク質間相互作用、例えばSUMO化とユビキチン化などの翻訳後修飾を維持するために最適化される。
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Protocol
変性条件下で出芽酵母細胞で発現6xHisタグタンパク質の精製
1。タンパク質発現の酵母細胞と誘導の成長
（2から変更）
オプション：関心の代わりに後述のガラクトース誘導性の文化のタンパク質を発現対数的に成長している酵母培養を使用してください。
- ギャル+コードするプラスミドで酵母株の選択のガラクトース誘導性6xHisタグタンパク質の細胞を形質転換する。例えば、試薬のリストを参照してください。
- 2％ショ糖を含む適切な選択培地（ 例えば SD-ウラシル）5ml中の形質転換体を植菌。 30°CO / N、回転でインキュベートする。
- 600nmでの光学密度が2％ショ糖と選択培地33 mlの0.3（= 0.3 OD 600）を測定するようにO / N文化を希釈します。 （Δ150rpm）で揺れ、30℃で成長する。
- 文化は、OD 600 = 0.8に達したとき-1.5、2％ガラクトースの1x YEPの最終濃度が、6％ガラクトース（ 表1のレシピ）で3回17mlのYEPを添加することにより、所望のタンパク質の発現を誘導する。合計培養液量は現在50ミリリットルです。インキュベートし、追加の5-6時間、30℃で、揺れ。
注：培養液量を変化させることができる。ステップ1.3で、希薄所望の最終体積の三分の二に。ステップ1.4では、3倍YEP / 6％ガラクトースの三分の一、最終容量を追加します。 - 4℃で5,000 rpmで5分間誘発文化や遠心分離機、細胞のΔ150-200 OD 600単位のOD 600を測定します
- 1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと2 mlのスクリューキャップチューブに移すと1ミリリットルの氷冷1X PBSで再懸濁し、細胞ペレット。
- 4℃で15,000 rpmで1分間遠心し℃で上清をデカント。
- -80℃で即時細胞溶解またはストレージが続く液体窒素、℃でさらに使用するまで、Cで凍結細胞ペレットをスナップ。
- 前のステップからの凍結細胞ペレットに、酸洗浄ガラスビーズと氷冷溶解バッファー（ 表1のレシピや、選択した細胞溶解バッファーを使用します）500μlの200μlのを追加します。
- 簡単に言うとペッティング上下。これは完全に細胞ペレットを再懸濁する必要はない。すべての回で氷の上にチューブを保管してください。
注：ピペットチップの先端が上下にピペッティング前に切断されることがあります。 - 4℃で、場所ビーズミル、バランス、ロック、そして当たり製造元の指示としてマシンを実行中に細胞とチューブ（秒）。
- 5.5で20秒間チューブ（s）を含むビーズビーターメートル/秒、その後1分間ぬかるみ氷上に置きを実行します。合計で6倍を繰り返します。
- 4℃15,000 rpmで15分間、℃で遠心分離により抽出したタンパク質をクリアオプション：SpinXフィルターを通して遠心分離により小さな微粒子を除去。
- 全細胞eのサンプルを準備しますウェスタンブロットによって目的のタンパク質の存在を確認する（WCE）xtract：
- 800μlの20％トリクロロ酢酸（TCA）への細胞の2 OD 600台（クリアエキス例えば 、5μlの細胞の200 OD 600台が収穫されている場合）に対応するWCE追加。ミックスする渦。
- 4℃で15,000 rpmで2.5分間遠心上清をデカントしたが、ペレットを保持するように注意してください。
- 4℃15,000 rpmで2.5分間遠心分離し、ペレットとボルテックスチューブにTCA 2％800μlの、℃までを追加上清をデカントしたが、ペレットを保持するように注意してください。
- TCAサンプルバッファー100μlの（ 表1のレシピ）、ペレットを溶解するために渦を追加します。注意：サンプルバッファがペレットに添加した後（黄色に変わります）、酸性になった場合、Δ10μlのトリス塩基のアリコートを追加[1M]サンプルは再び青になるまで。
- 2-5分間100℃のヒートブロックでインキュベートする。
- 渦AGAINペレットの残党がまだ存在する場合は、完全に溶解する。この方法で調製したペレットは、完全に溶解するの難しいことで知られています。それは完全にペレットを溶解するためにボルテックスのΔ10分かかる場合があります。
- -80 Storeサンプル°C、さらに使用するまで。
- さらに使用するまで-80℃で液体窒素や店舗内の残りのクリアWCE°Cのアリコートを凍結スナップ。
3。酵母細胞ホモジネートからのタンパク質のバッチ精製
注：この精製法は、Co 2 +金属アフィニティー樹脂に6xHisタグタンパク質の精製の ために最適化されました。
- レジン平衡
- 細胞のΔ20-40 OD 600台から調製クリアWCEのサンプルについては、マイクロ遠心チューブに親和性樹脂の50〜100μLを加える。例えば、アミロース、所望のタンパク質または非特異性樹脂を発現しない細胞から抽出したタンパク質を、コントロールとして使用することができる非特異的結合のための。
- 洗浄緩衝液1mlで5倍の樹脂を洗う：トップオーバーボトム反転樹脂を再懸濁させた後、4℃で5,000 rpmで1分間スピンするまで℃に上清を吸引。
注：同じ日に抽出·精製を行う場合は、樹脂平衡化、抽出の前に行うことができる。
- アフィニティー精製の ためのタンパク結合
- 50〜100μlの洗浄したビーズにクリアライセート100-200液（Δ20-40 OD 600単位）を追加し、溶解緩衝液で1ミリリットルの合計容積をもたらす。
- 2-5時間で4章動またはロッキング°Cでインキュベートする。
- 4℃で5,000 rpmで1分間スピン
- 必要に応じて、非結合タンパク質のその後の分析のために残りの上清のサンプルを保存します。 TCAはWCE（ステップ2.6）については、上記の詳細として沈殿する。
- 5,000 rpmで少なくとも1分間スピンコートした後、洗浄緩衝液1mlで5倍の結合タンパク質で樹脂を洗浄4℃洗浄中にサンプルは冷やしておく。
- 結合したタンパク質の溶出
- 4で、樹脂にうなだれるを150μlの溶出バッファーを追加℃で5分間、4℃で5,000 rpmで1分間スピン℃、新しいチューブに上清を保存します。オプション：2倍とプール溶出を繰り返します。
- 、溶出したタンパク質の25μlに2μlのβ-メルカプトエタノール（BME）と25μlの2倍のリチウムドデシル硫酸塩（LDS）サンプルバッファーを加え、2分間100℃のヒートブロックでインキュベート：ウェスタンブロット用溶出サンプルを準備します。
注：標準2XのLaemmliサンプル緩衝液を用いてもよい。 - 液体窒素中で凍結過剰溶出タンパク質をスナップ。
オプション：65℃2倍LDSサンプルバッファー等量と樹脂からのストリップの残りのタンパク質は℃で5分間、新しいチューブにLDS-溶出タンパク質を除去し、ではない樹脂に、溶出したタンパク質に2μlのBMEを追加します。この順序は、抱合あるあらゆるイオンまたは抗体の除去を防止するためであるビーズにテッド。 - -80℃でさらに使用するまで、店舗のサンプル。
- タンパク質を可視化するための適切な抗体を用いたウェスタンブロットおよびプローブ 。
- 各サンプルの10〜20μL（Δ1-3 OD 600台）と、選択したSDS-PAGEゲル中のタンパク質ラダーの3-10μLをロードします。日常的にこのプロトコルに使用ゲルは4〜12％ビス - トリス、8％トリス - グリシンが含まれています。
- 50分間200 Vでゲルを実行します。
- 20〜30分（ 表1のレシピ）が19 Vでセミドライ転送によりゲルからPVDF膜にタンパク質を転送します。
- 4％milk/1xトリスのブロック膜は、4℃（ 表1のレシピ）でRTまたはO / Nで1時間食塩水TWEEN（TBST）をバッファリング。
- 4℃でRTまたはO / Nで1-3時間、4％milk/1xのTBSTの関心のエピトープタグタンパク質に一次抗体を有する膜をインキュベート
- 1×TBSTで5分間ごとに、3倍の膜を洗浄します。
- 適切なメンブレンをインキュベート二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合室温で1-3時間、抗体。
- 1×TBST大容量で15分ごとに、3倍の膜を洗浄します。
- サランラップでECL基質とラップでメンブレンをカバーしています。
- フィルムに膜を露出させ、タンパク質を可視化するために開発しています。
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Representative Results
我々の代表的な結果について説明ビード打ちおよびタンパク質抽出プロトコルは、ダウンストリーム·アプリケーション（ 表2に要約）の様々なタンパク質の再現可能な製造のために有用であることを明らかにした。 WCEsのクーマシー染色したSDS-PAGEでタンパク質（〜12〜> 250 kDaの）広範囲の再現性酵母細胞（ 図1A）から抽出することができることを示している。分子量の範囲にわたる離散的なバンドは、高品質のタンパク質抽出物を示す。抽出物の品質は、ウエスタン特異的エピトープタグ融合タンパク質のためのブロッティングにより確認することができる。示さΔ120kDa（ 図1B）に移行ガラクトース過剰発現、V5タグ付きSUMOリガーゼSIZ1ための代表的な結果である。一般的には、部分的に分解されたタンパク質は、予想体重以下複数の断片として実行しますが、ここでの唯一の全長タンパク質が観察される。所与のタンパク質さらに、高分子量の付加物翻訳後修飾を示すことがあります。例えば、私たちはガラクトース過剰SUMO化Siz1Δ440と全長SIZ1（ 図1Cおよび図1Dの ） を示す。修正はまた、内因的に発現SIZ1（ 図1E）上に保存することができます。
我々は2つの核濃縮されたタンパク質、Slx5とSiz1Δ440が正常達のWCEs（ 図2A、2B、および2C）から精製されたことを代表的な結果を提供する。両方のネイティブと変性条件下で当社WCEsからアフィニティー精製することができ、特に、我々は6xHisタグタンパク質（Slx5図2A）があることを示している。これとは対照的に、Slx5-GST（ 図2B）とSiz1Δ440-HA（ 図2C）は 6×エピトープを欠いているが、ネイティブの条件の下にまだイミダゾール敏感な方法で金属親和性樹脂との対話。我々はそのSIZ1を提案し、より少ない程度にSLX5は、それらの金属配位RINGドメインを介して金属アフィニティー樹脂を結合することができる。我々の知る限りでは、この特定の現象はまだ報告されていないが、同様の状況は、コレラ毒素のBサブユニットは、Ni 2その天然のヒスチジン残基11によって媒介される方法で、+親和性樹脂を結合するに記載されている。重要なのは、この観察は、WCE中のタンパク質は、少なくとも部分的に、ネイティブに折り畳まれていることを示唆している。
特に、タンパク質機能の研究のためには、タンパク質複合体は、全細胞抽出物中で無傷のままであることを示すことが重要である。当社の代表的なデータはSiz1Δ440、Slx5、及びPGK1が（ローディングコントロールとして細胞質タンパク質）WCEsに存在していたことを明らかにした。 Siz1Δ440は、金属アフィニティー樹脂（ 図2Cを比較）に結合するその固有の能力に基づいて、これらの抽出物から精製した。 Slx5とSIZ1が酵母細胞で共発現させたときに、溶出液中のSlx5レベルが増加し、Slx5がSIZ1（ 図3）と相互作用する可能性を上げる。
図1。抽出後の酵母細胞溶解物中の無傷とSUMO化タンパク質の存在。このプロトコルで説明されているように、特に明記全細胞抽出物を調製した場合を除き。サンプルを、SDS-PAGEによって分離し、ウエスタンブロッティングの後にHA、V5、またはmycのエピトープタグのいずれかに対する抗体でプローブした。酵母株を表3にまとめる。 WB：ウェスタンブロット。 （A）TCA-沈殿WCEの代表的なサンプルは、（YOK 2514（左側2レーン）とYOK 2592（右側2車線）、（Δ0.2OD /レーン）から）染色ゲルを染色することにより可視化した（ ）材料の項を参照してください。 （B）レーン1＆2：酵母菌株YOK 2510とYOK 251のホモジネート2含有のガラクトース過剰Siz1-V5/6xHIS。部分的に分解タンパク質断片が存在しないことに注意してください。抗V5抗体でプローブしたときに未知の理由のために、この特定のサンプルでは、SUMO化付加物を明らかにしていません。しかし、SUMO化は、 図1に示すように、抗SUMO（抗SMT3）抗体を用いて検出することができる。 1D。 （C）レーン3＆4：ガラクトース過剰Siz1Δ440-HAを含む酵母菌株YOK 2508とYOK 2509のホモジネート。 （D）レーン5、6および7：ガラクトース過剰発現Siz1-V5/6xHISは、CO 2を用いて精製した+金属アフィニティー200mMのイミダゾールで溶出樹脂、および抗V5（レーン5）、抗SMT3（レーンでプローブ6）。レーン7は、抗V5抗体とレーン6の再調査である。とSIZ1とSUMO化SIZ1付加物（SMT3 n）の両方が表示されます。 （E）レーン8：mycタグSIZ1（YOK 2397）の内在性レベルを含むJD52野生型細胞。清澄は、哺乳動物の溶解緩衝液を用いて調製した。レーン9：Lyの抗V5アガロースで2時間インキュベートした後、上清を十分に満足させる。 SIZ1のSUMO化付加物に注意してください。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。精製の 過剰発現TALON金属アフィニティ樹脂を含有タンパク質RINGドメイン。このプロトコルで説明したようにガラクトース誘導、タンパク質抽出および精製を行った。精製はグアニジニウム塩酸塩を樹脂とのインキュベーションの前に6 Mを試料に添加した、天然の条件および変性条件で行った。溶解物は、両方のアミロース制御樹脂（A）とTALON金属アフィニティー樹脂（T）で回転させた。タンパク質は、溶出緩衝液中200mMのイミダゾールで溶出した。サンプルを、SDS-PAGEによって分離し、ウエスタンブロットした（WB）は、適切なエピトープタグに対する抗体を持つ。）ガラクトース誘起Slx5-V5/6xHIS（YOK 2096）はネイティブと変性条件下の両方でTALON樹脂で精製したB）ガラクトース誘起Slx5-GST（YOK 2071）であったネイティブでTALON樹脂で精製したが、変性条件ではない。適切に折り畳まれたときにおそらく、金属配位RINGドメインはTALON樹脂と対話します。C）ガラクトース誘起Siz1Δ440-HA（YOK 2353）もネイティブでTALON樹脂で精製したが、条件を変性されていません。これらのタンパク質は、6×タグが含まれていませんが、それぞれが自然のZn 2 +イオンを調整し、適切に折り畳まれたときに本質的にTALON金属アフィニティー樹脂に結合する能力を与えることがRINGドメインが含まれていません。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 TALON金属アフィニティー樹脂に過剰発現されたタンパク質の共精製。
JD52細胞（株YOKs 2353、2402、2224のそれぞれ）に（+ / - ）Slx5-GSTおよびSiz1Δ440-HAは、それ自体で、または組み合わせて発現させた。タンパク質は前述のように抽出した（WCE）および溶解物をTALON金属アフィニティー樹脂（ 図2を参照）nutatedた。タンパク質は、溶出緩衝液（溶出液）中の200mMのイミダゾールを有する樹脂から溶出し、LDSサンプル緩衝液中で調製した。タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、ウエスタンブロッティングの後に必要に応じてHAタグ又はGSTタグに対する抗体でプローブした。タンパク質の等しいローディングはローディングコントロールとしてPGKで確認されています。 Slx5精製Siz1Δ440の存在下で増強されることに注意してください。 大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
| ソリューション | コンポーネント | 注釈 |
|---|---|---|
| 3X YEP | のddH 2 Oを700ミリリットルで30グラム酵母エキス60グラムペプトン | 成分を混合し、滅菌するオートクレーブ。ときに使用する準備ができて6％から3倍YEPの個々のアリコートにフィルタ滅菌ガラクトースを追加 |
| TCAサンプルバッファー | 15％グリセロール80mMのトリスベース（非pH'd）3.5％SDSブロモフェノールブルー "味に。"のddH 2 Oで25ミリリットルにボリュームをもたらす | 1ミリリットルTCAサンプルバッファーにβ-メルカプトエタノール（BME）40μlのを追加し、使用する前に |
| バッファを洗う | 50mMのHEPES pH7.3の200mMのNaClで1％トリトンX-100、20mMのイミダゾール | イミダゾールは、Ni 2 +のために使用またはCo 2 +金属アフィニティー精製の み |
| 溶解バッファー | 50mMのHEPES pH7.3の200mMのNaClで1％トリトンX-100、10mMのイミダゾール1xのプロテアーゼ阻害剤カクテル使用直前にプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加します。イミダゾールは、+またはCo 2 +金属アフィニティ精製の みにNi 2に使用。オプション：25mMのN-エチルマレイミド（システインプロテアーゼ阻害剤、SUMO化を維持する）、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム（プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤）、及び/又は研究の特定領域に基づいて、他の経験的に決定さプロテアーゼインヒビター | |
| 溶出緩衝液 | 50mMのHEPES pH7.3の200mMのNaClを200 mMイミダゾール | イミダゾールは、+またはCo 2 +金属アフィニティ精製の みにNi 2でヒスチジン結合部位に対して競合するために使用。溶出する他の方法は、異なる親和性樹脂を用いてもよい。 |
| セミドライトランスファーバッファー（10倍） | 58グラムトリス29.3グラムグリシン18.75ミリリットル20％SDS：のddH 2 O 1Lに | ミックス200ミリリットルのメタノールと700ミリリットルのddH 2 Oを100ミリリットル10倍セミドライトランスファーバッファー：1×セミドライトランスファーバッファーを作成するには |
| トリス（TBS、10倍）緩衝生理食塩水 | 50ミリリットルの1Mトリス-HCl、pH8.0の150ミリリットル5 M NaClを300ミリリットルのddH 2 O | 1×TBSTを作成するには、900ミリリットルのddH 2 Oで100ミリリットル10倍TBSを混ぜるとのTween-20を1ml追加 |
表1。ソリューションおよびバッファ。
| アプリケーション | 細胞の量 | 次のステップ |
|---|---|---|
| 細胞溶解 | 収穫細胞ペレットの150-200 ODを | ステップ2で説明したように鼓動ビーズ |
| WCEのウェスタンブロット | 準備溶解細胞の2 ODを | ステップ2.6で説明したようにTCA沈殿によりウエスタンブロットのために準備します。ゲル上で使い果たしΔ0.3ODユニット（Δ15μL） |
| アフィニティ精製および/またはプルダウン | 溶解した細胞の30 ODを | バインド、溶出、およびステップ3.2と3.3で説明したようにタンパク質を準備 |
| 約1〜2 ODをする（ステップ3.3と同様にして調製した場合） | ステップ3.4で説明したようにウェスタンブロット |
表2。この議定書の申請の概要。
| 名前 | 関連する遺伝子型または親株 | プラスミド（s）またはカセット挿入 | リファレンス |
|---|---|---|---|
| YOK 2062 | MATA URA3-52 HIS3-Δ200LEU2-3、112 TRP1-Δ63LYS2-801 | ドーメンら 、1995 | |
| YOK 2071 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5（BOK 629、OpenBiosystems酵母GSTコレクションYSC4515-202484078） | この研究 |
| YOK 2096 | JD52 | pYES2.1-GAL-Slx5-V5/His 6-TOPO（BOK 390） | この研究 |
| YOK 2224 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5（BOK 629、OpenBiosystems酵母GSTコレクションYSC4515-202484078）; pRS425（BOK 343） | この研究 |
| YOK 2353 | JD52 | pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA（BOK 795） | この研究 |
| YOK 2397 | JD52 | Siz1-13xmyc/HIS5（内因タグ付け） | この研究 |
| YOK 2402 | JD52 | GAL1/10-GST-Slx5（BOK 629、OpenBiosystems酵母GSTコレクションYSC4515-202484078）; pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA（BOK 795） | この研究 |
| YOK 2501 | MHY3765、アルファ交配型、URA3-52、LYS2-801、TRP1-Δ63、HIS3-Δ200、LEU2-Δ1 | ubc4Δ:: HIS3;ubc6Δ:: TRP1;マットalpha2Δ:: kanMX | 謝ら 、2010 |
| YOK 2508 | ubc4Δ:: HIS3;ubc6Δ:: TRP1 マットalpha2Δ:: kanMX（YOK 2501） | pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA（BOK 795） | この研究 |
| YOK 2509 | ubc4Δ:: HIS3;ubc6Δ:: TRP1;マットalpha2Δ:: kanMX（YOK 2501） | GAL1/10-GST-Slx5（BOK 629、OpenBiosystems酵母GSTコレクションYSC4515-202484078）; pAG425-GAL1-CCDB-Siz1Δ440-HA（BOK 795） | この研究 |
| YOK 2510 | ubc4Δ:: HIS3;ubc6Δ:: TRP1;マットalpha2Δ:: kanMX（YOK 2501） | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO（BOK 898）; pRS425（BOK 343） | この研究 |
| YOK 2512 | ubc4Δ:: HIS3;ubc6Δ:: TRP1;マットalpha2Δ:: kanMX（YOK 2501） | Slx5-プロテイン（BOK 762）; pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO（BOK 898） | この研究 |
| YOK 2514 | Siz1-13xmyc/HIS5（YOK 2397） | msn5Δ::ハイグロ | この研究 |
| YOK 2592 | msn5Δ:: JD52でハイグロ （YOK 2514） | slx5Δ:: kanMX4 | この研究 |
| YOK 2721 | JD52 | pYES2.1-GAL-Siz1-V5/His 6-TOPO（BOK 898） | この研究 |
表3。酵母株。
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Discussion
このプロトコルは、無傷の、ネイティブの準備に焦点を当て、翻訳後のダウンストリームアプリケーションのため出芽酵母細胞からタンパク質を変更しました。このプロトコルを試みる前に、目的のタンパク質を容易に変性条件下12で調製したタンパク質抽出物中で検出することができるかどうかを判断することが重要である。ポリクローナル抗体が利用できない場合、それは、融合タンパク質をウエスタンブロットで検出できるように、タグの目的のタンパク質のエピトープすることが有利であり得る。現在のプロトコルでは、我々はHA、6×-V5、またはMYCエピトープタグでSIZ1をタグ付けし、この戦略は、私たちが明らかにウエスタンブロット（ 図1）上のタンパク質とSUMO化の形態を識別することができました。高親和性抗GFP抗体が（データは示さず）を得ることが困難である可能性があるので、我々は、GFPタグ融合タンパク質を検出少ない成功を収めた。別の重要な問題は、目的のタンパク質の発現量に関するものである。個々のレベルタンパク質は、4出芽酵母細胞内で広く変化し、いくつかのタンパク質は、それらが検出および/ または精製することができるように、過剰発現されなければならない。ガラクトース誘導性ベクトルは関心2の酵母遺伝子の高レベル発現のために利用可能です。染色体-タグORFの又はより強力な誘導性ガラクトースプロモーターの制御下で発現された場合プラスミド（ 図1）。から発現されたときSIZ1の場合には、我々は、完全長又は短縮タンパク質を検出することができた切り捨ての使用は構造/機能解析や時全長分子を表現することは困難または不安定であるのに有用であり得る。ガラクトース誘導性の過剰発現は、タンパク質の検出および精製を高めながら、潜在的な細胞周期特異的な翻訳後修飾との相互作用の生理的な関連性を研究する場合には、明確な限界がある。例えば、SIZ1のSUMO化は、細胞周期のG2 / M段階で最も優勢であり、修正または相互作用過剰発現したタンパク質は、他の実験により確認されなければならないかもしれ。最終的に、特異的プロテアーゼ、ホスファターゼ、および/またはプロテアソーム阻害剤の添加は、このプロトコルの成功にとって重要な検討事項である。一般的には、最良の結果は、細胞が凍結される前にこれらの阻害剤を加えることにより、抽出および希釈バッファに得られる。それは、その後の金属アフィニティー精製を妨害する可能性があるEDTA、プロテアーゼインヒビターカクテル時々存在する金属イオンキレート剤の添加は、お勧めできません。
ビーズ打つことによって得られたタンパク質抽出物を十分に個々のタンパク質の精製のための出発物質として適している。具体的には、6×親和性タグを運ぶ過剰発現Slx5は、金属アフィニティー樹脂（ 図2A）を使用してWCEsから精製することができることを示している。翻訳後修飾を維持し、タンパク質分解を低減するために、6xHisタグタンパク質は、しばしば、変性条件下で精製される5。しかし、ネイティブの条件下でタンパク質の精製に関連付けられている明確な利点があります。例えば、これらのタンパク質は、結合パートナーと共精製することができるか、またはインビトロアッセイ 13,14 内の後続のに使用することができる。 SIZ1とSlx5のケースでは、偶然、両方のタンパク質が6×タグの独立した金属アフィニティー樹脂に対して本質的な親和性を示し、この観察は、両方のタンパク質は、ネイティブの確認を想定している私たちに示唆していると判断。残念ながら、精製されたタンパク質の正しいフォールディングおよび生物学的活性は、ケースごとにケースに決定されなければならない。この目的のために、いずれかのアミノ又はカルボキシ末端親和性およびエピトープタグの配置は、非常に融合タンパク質の活性または安定性に影響を及ぼし、タンパク質精製戦略を計画する際に重要な考慮事項でもよい。
今後の仕事は試験のため、精製中に翻訳後修飾を強化する方法に焦点を当てるプロテアーゼ欠損酵母株、異なるプロテアーゼ阻害剤、または他の親和性タグの使用を通してPLE。我々は、現在の、またはバッファに最適化された形で、このプロトコルは、多くの出芽酵母タンパク質のスケーラブルで抽出、精製およびその後の研究のために適当であると予測している。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は彼らのサポートのためにカーシャーラボのすべてのメンバーに感謝します。私たちは、酵母株MHY3765用マークHochstrasserに感謝します。この作品は、NSFの助成金1051970（OK）に、ハワードヒューズ医学研究所学部旅行助成とモンロー学者プログラムグラント（ESへ）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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