Summary
Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolation de la microglie du tissu du SNC est un puissant outil d'enquête utilisé pour étudier la biologie de la microglie ex vivo. La présente méthode décrit en détail une procédure d'isolement de la microglie à partir de cortex de souris néonatales par agitation mécanique avec un agitateur rotatif. Cet isolement de la microglie méthode donne de la microglie corticales très pures qui présentent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles indicatifs de la microglie de repos dans des conditions normales non pathologiques in vivo. Cette procédure préserve aussi l'immunophénotype de la microglie et la fonctionnalité biochimique tel que démontré par l'induction de changements morphologiques, la translocation nucléaire de la sous-unité p65 de NF-kB (p65), et la sécrétion de la cytokine marque de pro-inflammatoire, facteur de nécrose tumorale α (TNF-α ), sur le lipopolysaccharide (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam) défis. Par conséquent, la procédure d'isolement présente préserve l'immunophénotype de repos et deux actimicroglie vée, en fournissant une méthode expérimentale d'enquêter sur la microglie biologie dans des conditions ex vivo.
Introduction
Cellules de la microglie, les macrophages de surveillance du parenchyme du système nerveux central, représentent environ 12% de la population cellulaire totale du cerveau des mammifères adultes. Les microglies sont issus de la vésicule ombilicale myéloïdes cellules précurseurs et de modification de la densité cellulaire et de morphologie dans différentes régions cytoarchitecturales dans le SNC adulte 1-5. Dans un cerveau adulte en bonne santé, les microglies sont petites, ramifiées ou polaires cellules avec, des processus dynamiques fines. Contrairement aux périphériques macrophages morphologie, la microglie démontrent un repos, à profil bas phénotype dans les cerveaux sains qui peuvent apparaître comme l'inactivité cellulaire, mais des études in vivo d'imagerie montrent que les processus microgliales s'étendent dynamiquement et se rétractent pour surveiller leur microenvironnement dans une manière qui rappelle " l'échantillonnage et l'arpentage "6,7.
Les microglies sont fortement et de manière différentielle en réponse à des modifications environnementales et physiopathologiques dans le cerveau, de commutationd'un surveillant à un pays considéré comme leur repos et activées couramment étatiques effectrices, respectivement. Ce commutateur dans l'activation peut être médiée par l'engagement des récepteurs membranaires reconnaissance de formes (PRR), tels que les récepteurs Toll-like (TLR), qui répondent aux motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP), les lipoprotéines à savoir bactériennes et virales dérivés , des acides nucléiques, des hydrates de carbone et 8-11. En plus de PAMP, PRR ont également été montré pour induire l'activation des microglies contre, des molécules stériles non pathogènes connus comme des modèles moléculaires danger / dommages-associé (atténue), qui représentent une perturbation dans l'homéostasie du système nerveux central, tels que les dommages cellulaires 12-16. Une fois engagé, PRR initier une intracellulaire cascade qui se traduit par des changements dans la morphologie des cellules et l'expression des gènes de la microglie de signalisation, plus précisément, les microglies activées adapter un phénotype de amoeboid-like, la translocation de la p65 de NF-kB sous-unité (p65) dans le noyau de la cellule, et réguler à la hausse l' production et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, tels que facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l'interleukine-1 β (IL-1β), et aussi d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) de 16 à 24. Bien intégré dans la réponse immunitaire innée du système nerveux central, ces molécules sécrétées ont également été trouvés à augmenter le stress oxydatif neuronale, induisant de ce fait et en exacerbant la neurodégénérescence dans les états malades telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer 25-29.
Cependant, les mécanismes d'activation de la microglie dans les états pathologiques ne sont pas complètement compris. Par conséquent, l'isolement de la microglie est un puissant outil d'enquête dans ces processus biologiques, comme beaucoup de caractéristiques in vivo de l'activation de la microglie peut être récapitulé dans la culture. Plusieurs méthodes sont disponibles pour isoler les microglies, y compris l'isolement par un gradient de Percoll après digestion enzymatique de tissu du SNC 30,31. Cependant, une digestion enzymatique peut modifierl'immunophénotype des cellules en réduisant la surface cellulaire antigène expression 32, et les résultats dans le rendement de la cellule par animal inférieur que le procédé décrit ici. Plus précisément, nous présentons un rendement de microglies moyenne par chiot cortex de 7,5 x 10 5 cellules, alors que précédemment rapporté méthodes de l'ensemble du système nerveux central d'isolement par un rendement de gradient de Percoll 3-5 x 10 5 cellules 30,33,34. La présente procédure contourne l'utilisation d'enzymes de digestion en isolant la microglie en fonction de leurs propriétés de faible adhérence, préservant ainsi l'immunophénotype des microglies et la fonctionnalité.
Dans la présente étude, nous décrivons l'isolement des cellules microgliales de cultures gliales mixtes issus de hétérozygotes CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), néonatale et C57BL / 6 cortex de souris par agitation mécanique sur un agitateur rotatif, une extension de déjà Procédé publiée 24,35. Nous utilisons la souche de souris ancien pour une visualisation facile des microglies, commeCes souris expriment la GFP sous le contrôle du locus endogène CX3CR1 - un promoteur spécifique des monocytes de 36 à 38. Cette méthode produit des cultures microgliales très pur avec un immunophénotype conservés ex vivo comme démontré par des changements morphologiques, la translocation nucléaire de p65, ainsi que la sécrétion de TNF-α en cas de contestation par le lipopolysaccharide bactérien (LPS) ou Pam 3 CSK 4, TLR4 et TLR1 / 2 agonistes , respectivement.
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Protocol
Avant de commencer ce protocole, recueillir des souriceaux nouveau-nés à jour postnatal 1-3 (P1-3) dans un récipient stérile imbriquée avec literie de cage d'origine pour la protection et la chaleur. Il est important de travailler rapidement et efficacement à travers ce protocole pour optimiser le rendement de la microglie. S'il vous plaît voir le tableau 1 pour la liste complète des réactifs.
Une. Préparation d'instruments, Culture Media, et plats
- Préparer 10 ml / pup microglie complet Support (MCM; 1x Minimal Essential Medium Earle [MEM] supplémenté avec 1 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 0,6% v / v de D-(+)-glucose, 100 pg / ml pénicilline / streptomycine (P / S), 4% v / v de sérum bovin fœtal (FBS), 6% v / v de sérum de cheval), et ajouter à chaque flacon T-75 (1 flacon / chiot); bouchon et le lieu horizontalement dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) à s'équilibrer pendant 1 heure. Il est indispensable à l'équilibre de ce support dans la fiole (s) avant de commencer la dissection.
- Prepare, aliquote, et chaude en 37 ° C MCM bain d'eau pour la dissection (6 ml / chiot) et dans un tube conique de MCM distinct pour la remise en suspension de cellules (2 ml / chiot). Préparer, aliquote, et le froid sur la glace Mincing Media (MM; HBSS complété par: 100 pg / ml P / S, 0,01 M HEPES; 3 ml / chiot), et de dissection Media (DM; MEM supplémenté avec 100 pg / ml P / S; 2 ml / chiot).
- Stériliser les instruments chirurgicaux suivants par immersion dans de l'éthanol à 70% pendant 10 min: ciseaux # 1 (1; décapiter), pince # 1 (2; d'assurer le nez et supprimer cortex), ciseaux # 2 (1; non en biais; d'ouvrir cuir chevelu ), pince # 2 (1; d'enlever le cuir chevelu), pince # 3 (1; d'enlever crâne), pince # 4 (2; d'enlever méninges), ciseaux # 3 (1; pour hacher le tissu cérébral). Laisser sécher à l'air sur une compresse stérile.
- Essuyez l'horizontale aéré poste de travail et la dissection microscope avec 70% d'éthanol.
- Distribuer DM en 2, 100 mm boîtes de Pétri stériles pour capturer la tête (3 ml; 1 plat / 3 chiots) et la dissection (1 ml;1 plat / chiot; refroidi sur la glace avant la dissection). Distribuer MM dans une stérile, 100 mm boîte de Petri pour hacher le tissu cérébral (1 ml; 1 plat / chiot).
2. Dissection de tissu cérébral
- Avant l'euthanasie, désinfecter doucement le cou et la tête du chiot avec 70% d'éthanol en utilisant un tissu de laboratoire. Avec des ciseaux # 1, euthanasier rapidement chiot en enlevant la tête; tête de capture en boîte de Pétri préalablement préparé. Euthanasier et compléter la dissection d'un chiot avant de procéder à l'animal suivant.
- Transférer la tête dans le plat de dissection froide; sous microscope de dissection fixer la tête en pinçant le nez à l'aide pince # 1 (sinon, la tête peut être fixée en perçant la pince à travers la cavité de l'œil); cuir chevelu ouvert à l'aide de ciseaux # 2 par la création d'un Y-cut: commencer à partir de base de la tête et à un angle vers les yeux. Utilisez pince # 3 pour enlever délicatement le cuir chevelu en enlevant latéralement, exposer le crâne.
- Utilisation pince # 3, retirez délicatement le tissu conjonctif à la base detête. Lorsque la base du crâne est exposé crâne soigneusement ouvert en enfilant un bras de pince entre le cerveau et le crâne (la suite de la fissure interhémisphérique); adhérence; tirez doucement vers le haut du crâne à déchirer.
- Broyer le tissu conjonctif sous la face ventrale du cerveau à l'aide pince n ° 1, puis retirez cerveau en utilisant le même outil. Soulevez le cerveau de crâne à l'aide d'une force vers le haut sous la partie ventrale du cerveau.
- Gardez le cerveau dans sa position anatomique: la face dorsale vers le haut pour visualiser les cortex sous le microscope de dissection; garantir le cerveau en place en insérant des conseils de pince à l'intersection du mésencéphale et du cortex; supprimer complètement méninges corticales avec pince n ° 4, puis passez à supprimer les méninges ventrales. Une fois les méninges ont été complètement enlevés, séparer les cortex du reste du cerveau à l'aide pince # 4., Il est essentiel d'éliminer complètement tissu méningé pour maximiser la pureté de la microglie et yield.
3. Brain Tissue Mincing
- cortex de transfert précédemment préparés hacher plat; continuer à hacher étape utilisant une technique stérile au Cabinet de classe II de sécurité biologique.
- Tissu Mince de cerveau à l'aide de ciseaux # 3; transfert tissu haché dans un tube de 15 ml conique;. Rincer ciseaux et hacher plat avec 1 ml de MM chacun, recueillir et distribuer des rinçages dans le tube de 15 ml conique contenant le tissu haché Cette étape de rinçage maximiser le rendement de la microglie en s'assurant que tout le tissu résiduel est transféré dans le tube conique. Laissez suspension de tissu non perturbée pendant 1-2 min, permettant tissu haché de régler au fond du tube. Ne pas dépasser 2 min que MM ne contient pas de nutriments essentiels.
- Retirez délicatement et jeter 2 ml de surnageant avec générique 1000 pi micropipette avec une pointe de pipette standard, veillant à ne pas perturber le haché tissu réglé. Ajouter 3 ml de MCM au-tissu haché; triturer le tissu avec force en utilisant un générique 1000 pi micropipette avec une pointe de pipette la norme n ° discernable tissu solide doit rester quand trituration est terminée.. Ajouter un autre 3 ml de MCM avec la même pointe de la pipette, la collecte de l'échantillon trituré résiduelle de la pointe de la pipette.
4. La culture de cellules corticales
- Centrifugeuse le tissu haché pour sédimenter les cellules (215 xg, 5 min; RT; centrifugeuse clinique avec balancement seau rotor). Retour culot de cellules de l'enceinte de sécurité biologique, enlever et jeter le surnageant; remettre en suspension doucement le culot cellulaire (2 ml / tube; MCM), ajouter la remise en suspension des cellules de la préalablement préparé flacon T-75; plafonner le ballon et le placer horizontalement dans un humidifiée, norme incubateur de culture de tissu (à 37 ° C, 5% CO 2). Laisser les cellules incuber pendant 24 heures.
- Après 24 h, tapotez doucement ballon contre paume de la main pour perturberdébris de tissu. Voir les cellules avant et après tapotement pour assurer une élimination complète du débris. Set ballon vertical; enlever et jeter les médias; ajouter MCM frais au fond du flacon (12 ml; 37 ° C); bouchon et remettez-les dans l'incubateur, horizontalement.
- Vérifiez cellules quotidien de contamination et pour surveiller la croissance.
- A environ 17-21 jours in vitro (DIV), les cellules microgliales seront prêts pour la récolte de la culture des cellules gliales mixtes. Pour déterminer si les cellules sont prêtes, examiner les cellules sous un microscope à contraste de phase inversée. Microglies sont prêtes pour la récolte quand à ~ 40% de confluence. Ils apparaissent comme de petites cellules, lumineux, sphériques, de plus en plus comme une monocouche sur d'autres cellules gliales.
5. Isolation des microglies de mixte gliales Culture
- Pour isoler la microglie, frappez vigoureusement ballon contre un banc de laboratoire. Cette agitation permet la microglie séparées des autres cellules gliales en raison des propriétés de faible adhérence de la microglie.
- Recueillir milieu surnageant contenant la microglie dans un tube à centrifuger conique stérile; microglie de granulés (215 xg, 5 min; balancer seau rotor).
- Remettre en suspension le culot de la microglie dans chaud microglie du milieu de croissance (MGM; MEM supplémenté avec: pyruvate 1 mM de sodium, 0,6% v / vglucose, 1 mM de L-glutamine, 100 pg / ml de P / S, 5% v / v de FBS; ~ 2 ml / flacon), déterminer la concentration des cellules en utilisant un hémocytomètre, et la plaque 1 x 10 5 cellules / puits dans un format de plaque à 24 puits surplastique ou bordereaux stériles de couverture de verre (500 pl / puits; MGM). le rendement de la microglie moyenne utilisant cette procédure est de 7,5 x 10 5 cellules / chiot cortex.
- 24 heures après placage, supprimer tous les médias et les cellules réalimentation avec frais MGM (37 ° C) pour éliminer les cellules et les débris flottants. Cette étape est essentielle à la survie cellulaire et de maintenir la microglie au repos. Les cellules peuvent être utilisés pour l'expérimentation immédiatement après réalimentation.
6. Exemple Traitements
- Exposer les cellules à 10 ng / ml de Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml de lipopolysaccharide (LPS) ou le contrôle du véhicule; incuber pendant 2 ou 24 heures dans un incubateur humidifié (37 ° C, 5% de CO 2).
7. Analyser microglies pour la fonctionnalité Ex vivo par immunofluorescence imagerie et Immunocytochemistry
- Après traitement, on récolte les cellules des milieux de culture dans des tubes de microcentrifugation (1,5 ml) et centrifuge utilisant une micro de table (2 min; 900 xg) pour effacer les médias. Transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse propre; dosage immédiatement, ou conserver à -20 ° C jusqu'au moment de servir. Analyser la concentration de TNF-α dans les cellules du surnageant de culture par ELISA kit disponible dans le commerce de la souris de TNF-α.
- Laver les cellules avec du tampon phosphate salin (PBS), et fixer les cellules avec 4% (p / v) de paraformaldéhyde / 4% (p / v) de sucrose / PBS pH 7,4 (PFA 4%, 15 min; RT). Après la fixation, laver les cellules avec du PBS pendant 5 min en agitant doucement sur un agitateur orbital.
- Immunofluorescence / immunocytochimie. Après fixation et de lavage PBS, processus microglies pour immunocytochimie. Toutes les étapes effectuées en agitant doucement. Perméabiliser les cellules dans PBS contenant 0,1% de triton X-100, des cellules de bloc dans PBS/10% de sérum de chèvre normal pendant une heure. Incuber les cellules O / N à 4 ° C avec des anticorps de lapin anti-NF-kB (sous-unité p65, 1/1, 250) ou de lapin anti-anticorps Iba-1 (1/750) dans du tampon de blocage. Visueliser complexe antigène: anticorps après incubation avec fluorescence chèvre anti-lapin conjugué anticorps IgG secondaire (1 h; 1/1, 000). Éliminer l'anticorps secondaire non lié par lavage avec du PBS contenant 0,1% de triton X-100 (3 x 5 min).
- Cellules contre des taches avec 4 ',6-Diamidino-2-phénylindole / PBS (DAPI; 0,1 pg / ml). Afin de visualiser le noyau de la cellule Tous les microglies provenant de CX3CR1-GFP + / - souris expriment la GFP. Utiliser un filtre de longueur d'onde de 350 nm pour visualiser le DAPI, un filtre de longueur d'onde 488 nm pour visualiser la GFP, et un filtre de longueur d'onde 594 nm pour visualiser p65 et Iba-1 immuns.
- Monter le couvercle glisse en utilisant une solution aqueuse de montage et de visualiser la microglie en utilisant la microscopie à fluorescence.
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Representative Results
Le maintien de l'immunophénotype et la fonctionnalité de la microglie ex vivo lors de l'isolement est essentiel d'être en mesure d'utiliser ces cellules comme un modèle d'enquête pour la biologie de la microglie. Afin de démontrer la préservation de la microglie immunofunctionality succès en utilisant la présente méthode, on a isolé à partir de la microglie corticales nouveau-nés (P3 CX3CR1-GFP + / - et des souris C57BL / 6) et des cultures traitées soit avec du LPS ou Pam.
Comme illustré sur la Figure 1A, l'isolement de la microglie par agitation rotative à travers une agitation préserve le phénotype quiescent attribué à la microglie dans des conditions normales in vivo. Afin d'évaluer la pureté de la microglie, + / CX3CR1-GFP - cultures de cellules ont été colorées pour l'antigène de macrophages Iba-1 et contre-colorées avec du DAPI afin de visualiser le noyau de la cellule. Comme le montrent les figures 1A et 1B, sous un faible grossissement, l'isolement de la microglie par la presently décrit méthode conduit dans une culture cellulaire à haute pureté, comme plus de 95% des cellules présentent co-localisation de la GFP, Iba-1, et DAPI.
Nous avons ensuite cherché à confirmer la réactivité de la microglie ex vivo en remettant en cause les cellules avec du LPS. Par rapport à un traitement de véhicule, LPS traité CX3CR1-GFP + / -. Microglie adapté un changement morphologique rigide à partir d'une petite phénotype bipolaire à une forme de amoeboid-like, comme le montre la Figure 1B Ce changement morphologique est également récapitulé dans la microglie corticales isolées à partir de souris C57BL / 6 traitées par le nouveau-né Pam (figure 2). Cette réponse morphologique conservée entre les microglies génétiquement distinctes, activé avec différents stimuli, souligne la reproductibilité et l'applicabilité du présent Protocole en ce qui concerne différents modèles expérimentaux.
Même si ce changement de morphologie est indicatif d'activation 39, il est nécessaire de déterminer si les microglies isolées par rotation secouant conservent leur capacité de translocation de p65 lors de l'activation, indiquant la préservation de la signalisation intracellulaire médiée par un TLR fonctionnelle. Pour confirmer cette cascade de signalisation, nous avons traité les microglies isolées à partir de souris C57BL / 6 nouveau-nés avec Pam. Comme illustré sur la figure 2, la coloration immunocytochimique pour p65 en évidence que, dans les conditions normales, p65 est localisée de manière diffuse dans le cytoplasme, tandis qu'après une stimulation de 2 heures avec Pam, p65 immunoréactivité considérablement décalée localisation dans le noyau cellulaire.
Ayant établi que la microglie isolés par l'intermédiaire de la méthode présentée ici conservent les mécanismes moléculaires de la translocation de p65 dans le noyau, nous avons ensuite souhaité pour confirmer que la microglie isolés conservent leur immunofunctionality biochimique en testant leur capacité à sécréter une cytokine pro-inflammatoire cachet, TNF-α, lors de l'activation . Comme le montre la figure 3, encomparaison de la microglie traité avec le véhicule, les cellules exposées au LPS ou Pam augmentent la sécrétion de TNF-α dans les milieux de culture (P <0,0001; ANOVA à une voie), indicatif d'fonctionnel TLR1 / 2 andTLR4 voies de signalisation, respectivement.
Par conséquent, pris ensemble, ces données établissent que l'isolement de la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté avec immunophénotype et la fonctionnalité préservée, ex vivo.
.. Cellules microgliales Figure 1 Rotary secouant les rendements des cultures de haute pureté microgliales avec immunophénotype conservés ont été isolés à partir de CX3CR1-GFP + / - souris néonatale à P3 et traités avec le véhicule (A), ou LPS bactériens (B) pendant 24 heures.Les cellules ont été fixées avec 4% de PFA, souillé par immunocytochimie pour Iba-1, et contre-colorées avec du DAPI. (A) Les cellules microgliales traitées avec du PBS présentent un bipolaire, le phénotype de repos. (B) À LPS, la microglie adapter un phénotype amiboïde comme, indicatif d'activation. Canal fusionné en panneaux (A) et (B) sous un grossissement 10X démontrent que> 95% des cellules sont des cellules positives GFP/Iba-1. 10X barre d'échelle: 100 um; 40X barre d'échelle: 20 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Microglies isolé par rotation secouant la translocation de NF-kB à la cellule noyau sur Pam challenge. cellules microgliales ont été isolés à partir de souris C57BL / 6 chez les nouveau-nés P3 et traités avec le véhicule ou Pam pendant 2 h. Les cellules ont été fixées avec 4% de PFA et colorées pour p65 par immunocytochimie. Les cellules ont été contre-colorées avec du DAPI pour visualiser le noyau de la cellule. Dans la microglie traité avec le véhicule, p65 est localisée dans le cytoplasme, alors que la stimulation avec Pam induit la translocation nucléaire de p65. 40X barre d'échelle: 20. Pm Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Microglie isolée avec rotatif secouant la libération de TNF-α lors de l'exposition à Pam ou LPS. Cellules microgliales ont été isolés à partir de souris C57BL / 6 néonatale à P3 et traités avec le véhicule, Pam, ou LPS pendant 2 heures. Les surnageants de culture cellulaire ont été recueillies et analysées par ELISA pour le TNF-α libération. *** P <0,0001 (n = 2; ANOVA à une voie). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD.
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Discussion
La présente procédure offre une méthode efficace pour l'isolement de la microglie corticaux de souris néonatales. Cette procédure a un double avantage de 1) la préservation immunophénotype microglie et la fonctionnalité, telle que déterminée par l'imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA, et 2) permettant la microglie à échéance à la présence d'autres cellules gliales (astrocytes et oligodentrocytes) avant l'isolement, ce qui peut faciliter les interactions cellule-cellule importantes pendant la période de maturation culture gliale. Surtout, cellules isolées présentaient une viabilité élevée et l'uniformité avec la fonctionnalité préservée et immunophénotype ex vivo.
Il ya plusieurs étapes qui doivent être effectuées avec une attention et une diligence particulière pour l'isolement succès de la microglie avec la plus grande pureté et le rendement. Ces étapes sont: 1) le maintien d'une saine culture stérile tout au long de la procédure d'expérimentation entier; 2) l'élimination de toutes les méninges du cortiques pendant microdissection; 3) bon lavage de hachage plaque et ciseaux après hachage cortex; 4) d'équilibrage MCM en flacons T-75 dans l'incubateur avant de commencer microdissection; 5) réalimentation 24 heures après l'isolement.
Depuis microglies sont les cellules immunitaires résidentes du SNC, ils sont très sensibles aux agressions de l'environnement. Par conséquent, éviter la contamination de la culture par des agents pathogènes est essentiel de préserver les attributs immunophénotypiques et fonctionnelles des cellules microgliales repos. Inspection quotidienne des cellules à surveiller la contamination et la croissance fait partie intégrante d'éviter les cultures de cellules compromis et d'acquérir une meilleure compréhension de la croissance du taux de la microglie. En outre, il est nécessaire de rafraîchir MGM 24 heures après le placage de la microglie, afin de maintenir la viabilité cellulaire et la fonctionnalité.
Un obstacle majeur à surmonter pour isoler la microglie est de s'assurer que le tissu du SNC hachée est exempte de cellules endothéliales, où,s'il est présent, peut entraver la prolifération microgliale en formant des colonies denses dans les cultures gliales. Pour cette raison, il est essentiel d'enlever complètement les méninges SNC pendant microdissection du cerveau. Dans notre expérience, les méninges des nouveau-nés P3 sont enlevées avec plus de facilité que les nouveau-nés P1, que le tissu est plus développée et plus facile à visualiser sous le microscope de dissection. En outre, il est important d'éviter de mouiller la face dorsale du cerveau avec DM après avoir enlevé le cerveau du crâne. Ceci peut être effectué en maintenant le cerveau en position anatomique (côté dorsal vers le haut) lors du transfert à DM. Garder la face dorsale du cerveau sec permet une meilleure visualisation et le retrait facile des méninges.
Nous avons trouvé que le moyen le plus efficace pour éliminer les méninges consiste à insérer la force n ° 4 à la partie la plus postérieure de la fissure interhémisphérique, et peler méninges off, latéralement. Une fois les méninges dorsales ont été défrichées, nous Remo puisve méninges ventrales en inversant le cerveau (côté ventral vers le haut), et de saisir délicatement les bulbes olfactifs et le pelage en arrière vers la partie postérieure du cerveau. Nous enlevons alors tout tissu méningé ventrale restant en douceur le peler et épilation dans un mouvement latéral. Séparation subséquente du cortex du reste du cerveau est crucial pour isoler seulement les microglies corticales. La procédure décrite dans ce document est également flexible en ce qu'il peut être utilisé pour isoler la microglie à partir de régions sous-corticales, ainsi. Cependant, il est important de noter que le rendement de la cellule peut être plus faible en raison de la variabilité des indifférents régions du cerveau cytoarchitecturales de densité de la microglie 40.
Nous avons trouvé que, pour maximiser le rendement final de la microglie, il est important de rincer et de recueillir le liquide de rinçage à partir de matériaux utilisés dans le processus de hachage. Ces rinçages assurer la collection complète de tous les tissus résiduelle qui peut être restée sur les ciseaux à hacher, boîte de Pétri, et la pipettepointe utilisé pour aliquoter le tissu haché dans le tube conique. Il est important que ces produits de rinçage ont lieu immédiatement après le transfert du tissu du SNC hachées au tube conique, afin d'optimiser la viabilité cellulaire. Il est également essentiel à la viabilité des cellules que les cellules ne restent pas dans MM pendant plus de 2 min depuis MM est dépourvu de nutriments essentiels.
Enfin, il est essentiel de préparer les flacons T-75 avec MCM et les placer dans l'incubateur humidifié (37 ° C, 5% CO 2) avant de commencer le protocole de microdissection. Thet-75 flacon a un revêtement poreux sous son capuchon qui permet l'échange de gaz, ce qui facilite l'équilibrage des médias avant l'addition de cultures mixtes gliales. Nous avons trouvé que le défaut de le faire en résulte une récolte optimale de la microglie. Il est également important pour sceller le flacon T-75 bouchon avec du Parafilm avant de placer le ballon sur un agitateur rotatif, afin de minimiser les échanges gazeux à l'intérieur et hors de la fiole tout en tournant.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l'absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d'intérêts potentiel.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
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