Summary
En af nøglerne til en vellykket efterforskning af microglial biologi er bevarelsen af microglial immunofunction ex vivo under isolation fra CNS-væv. Isolerende microglia via roterende rystning resulterer i stærkt rene og immunofunktionel cellekulturer som vurderet af fluorescerende billeddannelse, immuncytokemi, og ELISA efter mikroglia aktivering med det proinflammatoriske stimuli (LPS) og Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolering af mikroglia fra CNS væv er et kraftfuldt efterforskningsmæssige værktøj, der anvendes til at studere microglial biologi ex vivo. Den nuværende metode beskriver en procedure til isolering af mikroglia fra neonatale murine cortex ved mekanisk omrøring med en orbitalryster. Denne microglia isolation metode giver meget rene kortikale mikrogliaceller der udviser morfologiske og funktionelle egenskaber indikerer hvilende microglia i normale nonpathological forhold in vivo. Denne procedure bevarer også microglial immunofænotype og biokemisk funktionalitet som påvist ved induktion af morfologiske ændringer, nuklear translokation af p65-underenheden af NF-KB (p65) og sekretion af kendetegnende proinflammatorisk cytokin, tumornekrosefaktor-α (TNF-α ) efter lipopolysaccharid (LPS) og Pam 3 CSK 4 (Pam) udfordringer. Den foreliggende isoleringsprocedure bevarer immunofænotype både hvilende og aktiverede microglia, hvilket giver en eksperimentel metode til at undersøge mikroglia biologi i ex vivo.
Introduction
Mikrogliaceller, overvågnings makrofager i CNS parenkym omfatte omkring 12% af den samlede cellepopulation pattedyrhjernen voksen. Mikroglia er afledt fra blommesækken myeloide precursorceller og varierer i celledensitet og morfologi i forskellige cytoarchitectural regioner i den voksne CNS 1-5. I en sund voksen hjerne, microglia er små, forgrenede eller polære celler med fine, dynamiske processer. I modsætning til perifer makrofag morfologi, mikroglia demonstrere en hvilende, lavprofil fænotype hos raske hjerner, der kan fremstå som cellulær inaktivitet, men in vivo billeddiagnostiske undersøgelser viser, at microglial processer dynamisk udvide og trække for at overvåge deres mikromiljø på en måde, der minder om " prøveudtagning og landmåling "6,7.
Microglia er meget og forskelligt lydhøre over for miljø-og patofysiologiske forandringer i hjernen, skiftefra en surveillant til en effektor statslige almindeligvis betragtes som deres hvilende og aktiverede tilstande, hhv. Denne kontakt vil i aktivering kan medieres ved indgreb af membranbundne mønstergenkendelse receptorer (PRRS), såsom toll-lignende receptorer (TLRs), som svarer til patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs), nemlig bakterielle-og viral-afledte lipoproteiner , nukleinsyrer og kulhydrater 8-11. Udover PAMPs har PRRs også vist sig at inducere microglial aktivering mod sterile, nonpathogenic molekyler kaldet fare / skade-associeret molekylære mønstre (dæmper), som repræsenterer en perturbation i CNS homeostase, såsom cellulære skader 12-16. Når det er aktiveret, PRRs indlede en intracellulær signalering kaskade, der resulterer i ændringer i mikroglial celle morfologi og genekspression, specifikt aktiverede mikroglia tilpasse et amoeboid-lignende fænotype translokere den p65 NF-KB-underenhed (p65) til cellekernen og opregulere produIndsatsen og sekretion af proinflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1 β (IL-1β), sammen med reaktive oxygenarter (ROS) 16-24. Selv integreret i immunresponset i CNS medfødte har disse secernerede molekyler også fundet at øge neuronal oxidativ stress, for derved at inducere og forværrer neurodegeneration i sygdomstilstande såsom Parkinsons og Alzheimers sygdom 25-29.
Dog er mekanismerne for microglial aktivering i patologiske tilstande ikke helt forstået. Derfor isolering af mikroglia er et kraftfuldt undersøgende værktøj ind i disse biologiske processer, som mange in vivo funktioner i microglial aktivering kan sammenfattet i kultur. Der findes flere metoder til isolering af mikroglia, herunder isolering via en Percoll-gradient efter enzymatisk fordøjelse af CNS-væv 30,31. Dog kan enzymatisk fordøjelse ændreden immunofænotype af cellerne ved at reducere celleoverfladeantigen ekspression 32, og resulterer i lavere celleudbytte per dyr end den heri beskrevne fremgangsmåde. Konkret rapporterer vi en gennemsnitlig microglia udbytte pr hvalp cortex på 7,5 x 10 5 celler, mens tidligere rapporteret isolation metoder fra hele CNS via en Percoll gradient udbytte 3-5 x 10 5 celler 30,33,34. Den nuværende procedure omgår brug af fordøjelsesenzymer ved at isolere microglia baseret på deres lave adhærensegenskaber og dermed bevare den microglial immunofænotype og funktionalitet.
I den foreliggende undersøgelse beskriver vi isolering af mikrogliaceller fra blandede gliaceller kulturer stammer fra neonatale heterozygote CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) og C57BL / 6 murine cortex via mekanisk agitation på en rotationsryster, en udvidelse af tidligere publiceret metode 24,35. Vi udnytter den tidligere musestamme til nem visualisering af mikroglia somdisse mus udtrykker GFP under kontrol af den endogene CX3CR1 locus - en monocyt promotor 36-38. Denne metode frembringer meget rene microgliale kulturer med et konserveret immunofænotype ex vivo som påvist ved morfologiske ændringer, nuklear translokation af p65, og sekretion af TNF-α når udfordret med bakterielt lipopolysaccharid (LPS) eller Pam 3 CSK 4, TLR4 og TLR1 / 2 agonister hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før du starter denne protokol, indsamle neonatale mus på postnatal dag 1-3 (P1-3) i en steril beholder indlejret med originale bur strøelse til beskyttelse og varme. Det er vigtigt at arbejde hurtigt og effektivt gennem denne protokol at optimere microglial udbytte. Se Tabel 1 for komplet liste over reagenser.
1.. Udarbejdelse af instrumenter, Kultur Medier og skåle
- Forbered 10 ml / pup Mikroglia Complete Media (MCM, 1x Minimal Essential Medium Earles [MEM] suppleret med: 1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 0,6% v / v D-(+)-glucose, 100 ug / ml Penicillin / streptomycin (P / S), 4% v / v føtalt bovint serum (FBS), 6% v / v Horse Serum), og tilføje til hver T-75 kolbe (1 kolbe / pup), hætte og sted vandret ind en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) at ækvilibrere i 1 time. Det er vigtigt at ækvilibrere dette medie i kolben (r) før start dissektion.
- Forbere, portion, og varm i 37 ° C vandbad MCM for dissektion (6 ml / pup) og i en særskilt konisk rør MCM for celle resuspension (2 ml / pup). Forbered, portion, og chill på is Mincing Medier (MM, HBSS suppleret med: 100 ug / ml P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / pup), og Dissecting Medier (DM MEM suppleret med 100 ug / ml P / S, 2 ml / pup).
- Sterilisere følgende kirurgiske redskaber ved nedsænkning i 70% ethanol i 10 min: saks # 1 (1; at halshugge) Forcep # 1 (2; at sikre næse og fjerne cortex), saks # 2 (1; nonangled, at åbne hovedbund ), Forcep # 2 (1; at fjerne hovedbunden), Forcep # 3 (1; at fjerne kraniet), Forcep # 4 (2; at fjerne meninges), saks # 3 (1; at hakke hjernevæv). Lad lufttørre på en steril pad.
- Tør den vandrette luftgennemstrømning arbejdsstation og dissektion mikroskop med 70% ethanol.
- Doser DM i 2 sterile, 100 mm petriskåle til at opfange hoved (3 ml, 1 fad / 3 hvalpe) og dissektion (1 ml;1 fad / pup, afkølet på is før dissektion). Doser MM i 1 steril, 100 mm petriskål til hakning hjernevæv (1 ml, 1 fad / pup).
2. Brain Tissue Dissektion
- Forud for eutanasi, sanitize blidt hals og hoved af hvalp med 70% ethanol ved hjælp af en lab væv. Med saks # 1, hurtigt aflive hvalpen ved at fjerne hovedet, capture hoved i tidligere forberedt petriskål. Aflive og fuldføre dissektion af en hvalp, før du går videre til næste dyr.
- Overfør hovedet til kølet dissektion skål; under dissektion mikroskop sikre hovedet ved at klemme næsen hjælp Forcep # 1 (alternativt kan hovedet være sikret ved piercing pincet gennem øjenhulen), åben hovedbund hjælp saks # 2 ved at oprette et Y-cut: begynde fra bunden af hovedet og i en vinkel mod øjnene. Brug Forcep # 3 til forsigtigt at fjerne hovedbunden ved skrælning sideværts, udsætter kraniet.
- Brug Forcep # 3, forsigtigt fjerne bindevæv ved bunden afhoved. Når bunden af kraniet er udsat for, omhyggeligt åbne kraniet ved at skrue den ene arm af Forcep i mellem hjernen og kraniet (efter interhemispheric revne), greb, træk forsigtigt kraniet opad for at rive åben.
- Svække bindevæv under ventrale side af hjernen ved hjælp Forcep # 1, og derefter fjerne hjerne ved hjælp af den samme værktøj. Løft hjernen ud af kraniet ved hjælp af en opadrettet kraft på den ventrale side af hjernen.
- Hold hjernen i sin anatomiske position: dorsalsiden opad for at visualisere cortex under dissektion mikroskop, sikre hjernen på plads ved at indsætte spidsen af tang i skæringspunktet mellem midthjernen og cortex, helt fjerne kortikale meninges med Forcep # 4, derefter gå videre til at fjerne de ventrale meninges. Når meninges er helt fjernet, skal du adskille cortex fra resten af hjernen ved hjælp Forcep # 4.. Det er vigtigt at helt at fjerne meningitis væv for at maksimere microglia renhed og yield..
3. Brain Tissue Mincing
- Overfør cortex til tidligere forberedt hakning skål; fortsætte hakning trin ved hjælp af steril teknik i klasse II biologisk sikkerhedsskab.
- Hakkekød hjernevæv hjælp saks # 3, overførsel hakket væv til en 15 ml konisk rør. Skylles saks og hakning fad med 1 ml MM hver, indsamle og dispensere skylninger i 15 ml koniske rør, der indeholder hakket væv vil Denne skylning trin maksimere udbyttet af mikroglia ved at sikre, at alle resterende væv overføres til koniske rør. Lad vævssuspension uforstyrret i 1-2 min, så hakket væv at bosætte sig i bunden af røret. Må ikke overstige 2 min som MM ikke indeholder vigtige næringsstoffer.
- Fjern forsigtigt og kassér 2 ml supernatant med generiske 1.000 pi mikropipette med en standard pipette spids, gør sikker på ikke at forstyrre den afgjort hakket-væv. Tilsæt 3 ml MCM til hakket væv tritureres vævet med fuld kraft ved hjælp af en generisk 1.000 pi mikropipette med en standard pipettespids nr. mærkbare fast væv bør forblive når triturering er færdig.. Tilføje yderligere 3 ml MCM med samme pipettespids, indsamling resterende tritureret prøve fra pipettespidsen.
4.. Voksende Corticale Cells
- Centrifuger hakket væv for at pelletere celler (215 xg, 5 min, RT; klinisk centrifuge med svingende spand rotor). Retur pelleterede celler til den biologiske sikkerhed fryser, fjerne og kassere supernatanten, forsigtigt resuspender cellepelleten (2 ml / rør, MCM), tilsæt cellen resuspension til den tidligere fremstillede T-75 kolbe, cap kolben og placere det vandret ind en befugtet, standard vævskultur inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Lade cellerne inkuberes i 24 timer.
- Efter 24 timer, skal du trykke forsigtigt kolbe mod håndfladen at forstyrrevævsrester. Check-celler før og efter at trykke for at sikre fuldstændig fjernelse af snavs. Set kolbe lodret, fjernes og kasseres medier tilføje frisk MCM til bunden af kolben (12 ml; 37 ° C), hætte og læg tilbage i inkubatoren, vandret.
- Tjek celler dagligt for forurening og til at overvåge vækst.
- På cirka 17 til 21 dage in vitro (DIV), vil mikrogliaceller være klar til høst fra den blandede glia kultur. At afgøre, om cellerne er klar, undersøge celler under en omvendt fase-kontrast mikroskop. Mikroglia er klar til høst når de er på ~ 40% konfluens. De fremstår som små, lyse, sfæriske celler, der vokser som et monolag oven på anden glia.
5.. Isolering af Mikroglia fra Mixed Glial Culture
- For at isolere microglia, energisk trykke kolbe mod laboratorie bænk. Denne agitation hjælper separate microglia fra andre gliaceller på grund af den lave adhærensegenskaber af mikroglia.
- Samle bundfald medier, der indeholder microglia i en steril konisk centrifugerør, pellet microglia (215 xg, 5 min, swingende spand rotor).
- Resuspender microglial pellet i varmt microgliale Dyrkningsmedium (MGM, MEM suppleret med: 1 mM natriumpyruvat, 0,6% v / vglucose, 1 mM L-glutamin, 100 ug / ml P / S, 5% v / v FBS; ~ 2 ml / kolbe), bestemme koncentrationen celle ved anvendelse af et hæmocytometer, og pladen 1 x 10 5 celler / brønd i en 24-brønds plade-format påplast eller sterile dækglas (500 ul / brønd, MGM). Ved hjælp af denne procedure den gennemsnitlige microglia rente er 7,5 x 10 5 celler / hvalp cortex.
- 24-timers post-plating, fjerne alle de medier og refeed celler med frisk MGM (37 ° C) for at fjerne flydende celler og snavs. Dette trin er kritisk til celle overlevelse og for at bevare hvilende mikroglia. Celler kan anvendes til eksperimenter umiddelbart efter refeeding.
6.. Eksempel Behandlinger
- Eksponere celler til 10 ng / ml Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml lipopolysaccharid (LPS) eller vehikelkontrol, inkuberes i 2 eller 24 timer i befugtet inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
7.. Analyserer Mikroglia til funktionalitet Ex vivo via Immunfluorescens Imaging og Immuncytokemi
- Efter behandlingen høst celledyrkningsmedier i mikrocentrifugerør (1,5 ml) og centrifuge bruge en bordplade mikrocentrifuge (2 min, 900 xg) for at fjerne medier. Overfør supernatanten til et rent mikrocentrifugerør, assay straks, eller opbevares ved -20 ° C, indtil klar til brug. Analyser TNF-α koncentration i cellekultursupernatanten via kommercielt tilgængelige muse-TNF-α-ELISA kit.
- Vask cellerne med phosphatpufret saltvand (PBS) og løse cellerne med 4% (w / v) paraformaldehyd / 4% (w / v) sucrose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min, RT). Efter fiksering vaskes cellerne med PBS i 5 minutter under forsigtig omrystning på en orbitalryster.
- Immunofluorescens / Immunocytokemi. Efter fiksering og vask med PBS proces mikroglia til immuncytokemi. Alle trin udføres med forsigtig omrystning. Permeabilisere celler PBS/0.1% Triton X-100, blok-celler i PBS/10% normalt gedeserum i en time. Cellerne inkuberes O / N ved 4 ° C med kanin-anti-NF-KB-antistof (p65 underenhed, 1/1, 250) eller kanin-anti-Iba-1-antistof (1/750) i blokerende buffer. Visualize antigen: antistof-kompleks efter inkubation med fluorescens-konjugeret gede-anti-kanin-lgG sekundært antistof (1 time, 1/1, 000). Fjerne ubundet sekundært antistof ved vask med PBS/0.1% Triton X-100 (3x 5 min.)
- Counter stain celler med 4 ',6-diamidino-2-phenylindol / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). At visualisere cellekernen Alle mikroglia afledt fra CX3CR1-GFP + / - mus udtrykker GFP. Anvende en 350 nm bølgelængde filter til at visualisere DAPI, et 488 nm bølgelængde filter til at visualisere GFP og et 594 nm bølgelængde filter til at visualisere p65 og Iba-1-immunkomplekser.
- Mount dækglas under anvendelse af vandig montering opløsning og visualisere mikroglia med fluorescerende mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bevarelse af den immunofænotype og funktionaliteten af mikroglia ex vivo under isolation er afgørende at være i stand til at udnytte disse celler som en undersøgelsesgruppe model for microglial biologi. For at demonstrere en vellykket bevarelse af mikroglia immunofunctionality ved hjælp af den nuværende metode, vi isolerede kortikale microglia fra P3 nyfødte (CX3CR1-GFP + / - og C57BL / 6) og behandlede kulturer med enten LPS eller Pam.
Som illustreret i figur 1A, isolering af mikroglia via omrøring ved roterende rystning bevarer hvilende fænotype tilskrives mikroglia i normale in vivo. For at vurdere microglial renhed, CX3CR1-GFP + / - blev cellekulturer farvet for makrofag antigen Iba-1 og tælleren farvet med DAPI for at visualisere cellekernen. Som vist i figur 1A og 1B, under lav forstørrelse, mikroglia isolation via Presently beskrevet metode resulterer i en meget ren cellekultur, som mere end 95% af cellerne udviser colokalisering af GFP, Iba-1 og DAPI.
Vi næste forsøgt at bekræfte reaktionsevne microglia ex vivo ved at udfordre celler med LPS. I forhold til køretøjets behandling, LPS-behandlede CX3CR1-GFP + / -. Mikroglia tilpasset en skarp morfologisk ændring fra en lille, bipolar fænotype til en amoeboid-lignende form, som vist i figur 1B Denne morfologisk ændring også sammenfattet i corticale mikroglia isolerede fra C57BL / 6 nyfødte behandlet med Pam (figur 2). Dette bevarede morfologiske respons mellem genetisk forskellige microglia, aktiveres med forskellige stimuli, understregninger reproducerbarhed og anvendeligheden af denne protokol i forhold til forskellige eksperimentelle modeller.
Selv om denne ændring i morfologi er indikativt for aktivering 39, er det nødvendigt at determine hvis mikroglia isoleret ved orbitalryster bevarer deres evne til at translokere p65 ved aktivering, hvilket indikerer konservering af funktionelle TLR-medieret intracellulær signalering. For at bekræfte dette signaleringskaskade behandlede vi mikroglia isoleret fra C57BL / 6 nyfødte med Pam. Som illustreret i figur 2, immuncytokemiske farvning for p65, viser, at under normale omstændigheder, er p65 diffust lokaliseret i hele cytoplasmaet, hvorimod efter en 2 hr stimulation med Pam, p65 immunoreaktivitet dramatisk flyttet lokalisering til cellekernen.
Efter at have fastslået, at mikroglia isoleret med metoden præsenteret heri bevarer de molekylære mekanismer til at translokere p65 til kernen, vi næste ønskede at bekræfte, at isolerede mikroglia bevarer deres biokemiske immunofunctionality ved at teste deres evne til at udskille et stempel proinflammatorisk cytokin TNF-α ved aktivering . Som vist i figur 3, isammenligning med vehikelbehandlede mikroglia, celler udsat for Pam eller LPS øger sekretion af TNF-α i dyrkningsmedierne (P <0,0001, en-vejs ANOVA), hvilket indikerer funktionel TLR1 / 2 andTLR4 signalveje henholdsvis.
Derfor tilsammen disse data fastslå, at isolation af microglia via roterende rystning resulterer i stærkt rene cellekulturer med bevaret immunofænotype og funktionalitet, ex vivo.
.. Figur 1 orbitalryster udbytter høj renhed microgliale kulturer med konserverede immunofænotype microgliale celler blev isoleret fra CX3CR1-GFP + / - neonatale mus P3 og behandlet med enten vehikel (A) eller bakteriel LPS (B) i 24 timer.Cellerne blev fikseret med 4% PFA immunocytokemisk farvet for Iba-1 og tæller farvet med DAPI. (A) Mikroglia behandlet med PBS udviser en bipolar, hvilende fænotype. (B) Når LPS udfordring, mikroglia tilpasse et amoeboid-lignende fænotype, hvilket indikerer aktivering. Flettede kanal i paneler (A) og (B) under 10X forstørrelse viser, at> 95% af cellerne er GFP/Iba-1 positive celler. 10X skala bar: 100 m; 40X skala bar: 20 pm. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Mikroglia isoleret via orbitalryster translokere NF-KB til cellekernen ved Pam challenge. microgliale celler blev isoleret fra C57BL / 6 nyfødte på P3 og behandlet med vehikel eller Pam i 2 timer. Cellerne blev fikseret med 4% PFA og farvet for p65 via immuncytokemi. Celler blev counter farvet med DAPI for at visualisere cellekernen. I behandlede køretøj microglia er p65 lokaliseret i hele cytoplasmaet, mens stimulation med Pam inducerer kernetranslokation af p65. 40X skala bar:. 20 um Klik her for at se større billede.
Figur 3. Mikroglia isoleret med orbitalryster release TNF-α ved udsættelse for Pam eller LPS. Microgliale celler blev isoleret fra C57BL / 6 neonatale mus P3 og behandlet med vehikel, Pam, eller LPS i 2 timer. Cellekultur-supernatanter blev opsamlet og analyseret via ELISA for TNF-α frigivelse. *** P <0,0001 (n = 2; envejs ANOVA). Data er præsenteret som middelværdi ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende procedure giver en effektiv metode til isolering af kortikale microglia fra neonatale mus. Denne fremgangsmåde har en dobbelt fordel af 1) bevarelse microglia immunofænotype og funktionalitet, som bestemt af fluorescerende billeddannelse, immuncytokemi og ELISA, og 2) at tillade mikroglia at modne i overværelse af andre gliaceller (astrocytter og oligodentrocytes) forud for isolation, hvilket kan fremme vigtige celle-celle interaktioner under glial kultur modningsperiode. Vigtigere er det, udstillet isolerede celler høj levedygtighed og ensartethed med bevaret funktionalitet og immunofænotype ex vivo.
Der er flere trin, der skal udføres med særlig opmærksomhed og omhu for en vellykket isolering af microglia med den højeste renhed og udbytte. Disse trin er: 1) opretholdelse af et sterilt, sund kultur i hele eksperimenter procedure, 2) fjerne alle meninges fra korsis under mikrodissektion 3) korrekt vask af hakning plade og saks efter hakning cortex, 4) equilibrating MCM i T-75 kolber i kuvøse, før du begynder mikrodissektion, 5) refeeding 24 timer post-isolation.
Da microglia er de bosiddende immunceller af CNS, de er meget lydhøre over for miljømæssige fornærmelser. Derfor undgå forurening kultur med patogener er afgørende for at bevare de immunfænotypisk og funktionelle egenskaber af hvilende mikrogliaceller. Daglig inspektion af celler til at overvåge forurening og vækst er en integreret undgå kompromitterede cellekulturer og for at få en bedre forståelse af microglial vækst-rate. Endvidere er det nødvendigt at opdatere MGM 24 timer efter udpladning af mikroglia for at opretholde levedygtighed og funktionalitet celle.
En stor hindring for at overvinde isolere mikroglia er at sikre, at det hakkede CNS-væv er fri af endotelceller, hvilkethvis til stede, kan hindre microglial spredning ved at danne tætte kolonier i glial kulturer. Af denne grund er det vigtigt at grundigt at fjerne CNS meninges under mikrodissektion af hjernen. Det er vores erfaring, er hjernehinde på P3 nyfødte fjernes med større lethed end P1 nyfødte, da vævet er mere udviklet og lettere at visualisere under dissektion mikroskop. Derudover er det vigtigt at undgå at fugte den dorsale side af hjernen DM efter fjernelse af hjernen fra kraniet. Dette kan gøres ved at holde hjernen anatomisk position (dorsale side op), når overføre den til DM. Holde dorsalsiden af tørre hjerne giver mulighed for bedre visualisering og lettere fjernelse af meninges.
Vi har fundet, at den mest effektive måde at fjerne meninges er at indsætte den kraft nr. 4 i den mest bageste del af interhemispheric revne, og skræl meninges off, sideværts. Når dorsale hjernehinderne er blevet ryddet, vi så remove ventrale hjernehinde ved at vende hjernen (ventrale opad), og forsigtigt gribe olfaktoriske pærer og skrælning tilbage mod den bageste del af hjernen. Vi fjerner derefter eventuelt resterende ventrale meningeal væv ved forsigtigt at skrælle og pincet på en sideværts bevægelse. Efterfølgende adskillelse af cortex fra resten af hjernen er afgørende for at isolere kun corticale mikroglia. Fremgangsmåden beskrevet heri er også fleksibel, idet den kan anvendes til at isolere mikroglia fra subkortikale regioner samt. Selvom, er det vigtigt at bemærke, at celleudbytte kan være lavere på grund af variation i mikroglia density ligegyldige cytoarchitectural hjernen regioner 40.
Vi har fundet, at for at maksimere det endelige udbytte af mikroglia, er det vigtigt at skylle og indsamle skyllevæsken fra de anvendte i hakningen proces materialer. Disse skylninger sikre den komplette samling af alle resterende væv, der kan være forblevet på hakningen saks, petriskål, og pipettenspids anvendes til Afmål hakket væv ind i konisk rør. Det er vigtigt, at disse skylninger finde sted umiddelbart efter overførsel hakket CNS-væv til konisk rør, for at optimere cellernes levedygtighed. Det er også afgørende for celle levedygtighed, at cellerne ikke bo i MM i længere tid end 2 min siden MM er blottet for vigtige næringsstoffer.
Endelig er det afgørende at forberede T-75 kolber med MCM og placere dem i fugtet inkubator (37 ° C, 5% CO 2) før du starter mikrodissektion protokollen. Uforsætlige-75 kolbe har en porøs foring under sin hætte, der giver mulighed for udveksling af gasser, lette medier ligevægt før tilsætning af blandede gliaceller kulturer. Vi har fundet, at undladelse af at gøre dette resulterer i en suboptimal microglial høst. Det er også vigtigt at forsegle T-75 kolbe cap med Parafilm forud for at placere kolben på et roterende rysteapparat for at minimere luftskifte i og ud af kolben under rotation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at den forskning, blev gennemført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
