Summary
Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.
Abstract
Die Isolierung der Mikroglia von ZNS-Gewebe ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um investigative Mikroglia Biologie studieren ex vivo. Das vorliegende Verfahren Details ein Verfahren zur Isolierung von murinen Mikroglia von neonatalen Kortex durch mechanische Bewegung mit einem Rotationsschüttler. Diese Methode liefert Mikroglia Isolierung hochreiner kortikalen Mikrogliazellen, die morphologischen und funktionellen Eigenschaften in normalen, nicht pathologischen Bedingungen in vivo bezeichnend für Ruhe Mikroglia aufweisen. Dieses Verfahren bewahrt auch die Mikro Immunphänotyps und biochemischen Funktionen, wie durch die Induktion der morphologischen Veränderungen, die nukleäre Translokation der p65-Untereinheit von NF-kB (p65), und Sekretion des proinflammatorischen Zytokins Markenzeichen, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α nachgewiesen ), auf Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) Herausforderungen. Daher erhält das vorliegende Verfahren die Isolierung Immunophänotyp sowohl Ruhe und aktivierenviert Mikroglia und bietet eine experimentelle Methode zur Untersuchung der Biologie in Mikroglia ex vivo-Bedingungen.
Introduction
Mikrogliazellen, die Überwachungs Makrophagen des ZNS Parenchym, umfassen etwa 12% der Gesamtzellpopulation des erwachsenen Gehirns von Säugetieren. Mikrogliazellen sind aus Dottersack myeloischen Vorläuferzellen abgeleitet und variieren in der Zelldichte und Morphologie in verschiedenen cytoarchitectural Regionen innerhalb der adulten ZNS 05.01. In einem gesunden erwachsenen Gehirn sind Mikroglia kleinen, verzweigten oder polaren Zellen mit feinen, dynamischen Prozessen. Im Gegensatz zu peripheren Makrophagen Morphologie, Mikrogliazellen zeigen eine Ruhe, Low-Profile-Phänotyp in gesunden Gehirnen, die als zelluläre Inaktivität erscheinen können, aber in-vivo-Imaging-Studien zeigen, dass die Mikroglia-Prozesse dynamisch aus-und einfahren, um ihre Mikroumgebung überwachen in einer Art und Weise erinnert an " Probenahme-und Vermessungs "6,7.
Mikroglia sind stark unterschiedlich und als Reaktion auf Umwelt und pathophysiologischen Veränderungen im Gehirn, Schaltvon einem Wacher zu einer Effektor-Zustand häufig als ihre Ruhe angesehen und aktivierten Zustände auf. Dieser Schalter kann bei der Aktivierung durch den Eingriff der membrangebundenen Mustererkennungsrezeptoren (PRRS), wie etwa Toll-like Rezeptoren (TLR), die pathogen-associated molecular Muster reagieren (PAMPS), nämlich Bakterien-und Virus-abgeleitete Lipoproteine vermittelt , Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und 8-11. Zusätzlich zu PAMPs haben KFVs auch gezeigt, dass Mikroglia-Aktivierung gegen steriles, nicht-pathogenen Molekülen Gefahr / Beschädigung assoziierte molekulare Muster (gedämpft) bekannt, die eine Störung der Homöostase im ZNS darstellen, wie beispielsweise Zellschäden induzieren 12-16. Einmal aktiviert, PRRs initiieren eine intrazelluläre Signalkaskade, die zu Veränderungen in Mikroglia-Zellmorphologie und Genexpression führt, insbesondere aktivierte Mikroglia eine Anpassung amoeboid-ähnlichen Phänotyp, die p65 transloziert NF-kB-Untereinheit (p65) in den Zellkern und regulieren die production und Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen, wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-1 β (IL-1β), zusammen mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), 16-24. Obwohl integral an der angeborenen Immunantwort des ZNS haben diese Moleküle sezerniert wurde auch gefunden, neuronale oxidativen Stress zu erhöhen, wodurch induzieren und verschlimmern Neurodegeneration bei Krankheitszuständen, wie Parkinson-und Alzheimer-Krankheit 25-29.
Jedoch sind die Mechanismen der Mikroglia-Aktivierung in pathologischen Zuständen nicht vollständig verstanden. Daher Isolierung der Mikroglia ist ein leistungsfähiges Werkzeug in Untersuchungs dieser biologischen Prozesse, wie viele in-vivo-Funktionen von Mikroglia-Aktivierung in Kultur rekapituliert werden. Es sind mehrere Verfahren zur Isolierung von Mikroglia, einschließlich Isolierung über einen Percoll-Gradienten folgende enzymatische Verdauung von ZNS-Gewebe 30,31 erhältlich. Allerdings enzymatische Verdauung verändern könnender Immunphänotyp der Zellen, indem Zelloberflächenantigen-Expression 32 und führt zu einer geringeren Zellausbeute pro Tier als dem hier beschriebenen Verfahren. Insbesondere weisen wir einen durchschnittlichen Ertrag pro Welpe Mikroglia Kortex von 7,5 x 10 5 Zellen, während zuvor berichtet Isolierungsverfahren aus ganzen ZNS über einen Percoll-Gradienten Ausbeute 5.3 x 10 5 Zellen 30,33,34. Das vorliegende Verfahren umgeht die Verwendung von Verdauungsenzymen durch Isolierung Mikroglia auf der Grundlage ihrer niedrigen Hafteigenschaften, wodurch die Mikro Immunophänotyp und Funktionalität erhalten bleibt.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Isolierung von Mikroglia-Zellen aus gemischten Glia-Kulturen aus Neugeborenen-heterozygoten CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) abgeleitet und C57BL / 6 Mäuse Kortex über mechanische Bewegung auf einem Rotationsschüttler, eine Erweiterung der zuvor publizierten Methode 24,35. Wir nutzen die ehemaligen Mausstamm für die einfache Visualisierung von Mikrogliazellen, alsDiese Mäuse exprimieren GFP unter der Kontrolle des endogenen Locus CX3CR1 - ein Monozyten-spezifische Promotor 36-38. Dieses Verfahren erzeugt sehr reine Mikrokulturen mit dem erhaltenen Immunphänotyps ex vivo, wie durch morphologische Veränderungen, die nukleäre Translokation von p65 und Sekretion von TNF-α nachgewiesen, wenn mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) oder Pam 3 CSK 4 gefordert, TLR4 und TLR1 / 2-Agonisten sind.
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Protocol
Vor Beginn dieses Protokoll, sammeln neugeborenen Mäusen an postnatalen Tag 1-3 (P1-3) in einem sterilen Behälter mit Original-Käfig Bettwäsche für Schutz und Wärme verschachtelt. Es ist wichtig, schnell und effizient durch dieses Protokoll arbeiten, um Mikroglia-Ausbeute zu optimieren. Bitte siehe Tabelle 1 für vollständige Reagenzienliste.
1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte
- Vorbereitung 10 ml / Welpen Mikroglia komplette Medien (MCM; 1x Minimal Essential Medium Earles [MEM], ergänzt mit 1 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,6% v / v D-(+)-Glucose, 100 &mgr; g / ml Penicillin / Streptomycin (P / S), 4% v / v Fetal Bovine Serum (FBS), 6% v / v Pferdeserum), und fügen Sie zu jedem T-75-Kolben (1-Kolben / Welpe), Kappe und Ort horizontal in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 1 h äquilibrieren gelassen. Es ist wichtig, dieses Medium in Flaschen (en) vor Beginn der Präparation äquilibrieren.
- Prepare, aliquote, und warm im 37 ° C warmen Wasserbad für MCM-Dissektion (6 ml / Welpe) und in einem separaten konischen Rohr MCM für Zell Aufwirbelung (2 ml / Welpe). Bereiten aliquote, und Chill auf Eis Mincing Medien (MM; HBSS, ergänzt mit 100 ug / ml P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / Welpe) und Dissecting Medien (DM; MEM mit 100 ug / ml ergänzt P / S; 2 ml / Welpe).
- Sterilisieren Sie die folgenden chirurgische Instrumente durch Eintauchen in 70% Ethanol für 10 min: Schere Nr. 1 (1; zu enthaupten), forcep # 1 (2; Nase sichern und Rinden entfernen), Schere Nr. 2 (1; nonangled; zu öffnen Kopfhaut ), forcep Nr. 2 (1; Kopfhaut entfernen), forcep Nr. 3 (1; Schädel zu entfernen), forcep # 4 (2; Hirnhaut entfernen), Schere Nr. 3 (1; Hirngewebe Hackfleisch). An der Luft trocknen auf einer sterilen Unterlage.
- Wischen Sie den horizontalen Luftstrom-Workstation und Dissektionsmikroskop mit 70% Ethanol.
- Dispense DM in zwei sterile, 100 mm Petrischalen für die Erfassung Kopf (3 ml; ein Gericht / 3 Jungtiere) und Zerlegung (1 ml;Ein Gericht / pup; vor der Dissektion auf Eis gekühlt). Dispense MM in ein steriles, 100 mm Petrischale zum Zerkleinern von Hirngewebe (1 ml, 1 Schale / Welpe).
2. Gehirngewebe Dissection
- Vor der Euthanasie, sanft desinfizieren Hals und Kopf des Welpen mit 70% Ethanol mit Hilfe eines Labor-Gewebe. Mit Scheren Nr. 1, schnell Welpen einschläfern durch Entfernen der Kopf, Kopf-Capture in vorbereitete Petrischale. Euthanize und füllen Sie die Dissektion der ein Welpe, bevor Sie mit dem nächsten Tier.
- Übertragen Sie den Kopf auf die Kaltschale Dissektion, unter Dissektionsmikroskop sichern den Kopf durch Kneifen die Nase mit Zange # 1 (alternativ kann der Kopf durch Durchstechen der Zange durch die Augenhöhle befestigt werden), offene Kopfhaut mit Scheren Nr. 2 durch die Schaffung eines Y-Schnitt: Anfang von der Basis des Kopfes und in einem Winkel in Richtung der Augen. Verwenden forcep Nr. 3 zu entfernen sanft die Kopfhaut durch seitlich Peeling, Aussetzen der Schädel.
- Mit Pinzette # 3, entfernen Sie vorsichtig Bindegewebe an der Basis derKopf. Wenn der Schädelbasis ausgesetzt ist, vorsichtig öffnen Schädel durch Einfädeln einem Arm in forcep zwischen Gehirn und Schädel (nach der Interhemisphärenspalt); Griff; ziehen Sie vorsichtig nach oben, um den Schädel aufreißen.
- Stören Bindegewebe unter Bauchseite der Gehirn mit Zange # 1, und anschließend entfernen Gehirn mit dem gleichen Werkzeug. Heben Sie das Gehirn aus der Schädel durch die Verwendung eines nach oben gerichteten Kraft unter der Bauchseite des Gehirns.
- Halten Sie das Gehirn in seiner anatomischen Position: Rückenseite nach oben, um die Rinden unter der Dissektionsmikroskop visualisieren, sichern das Gehirn an Ort und Stelle durch Einfügen von Spitzen der Pinzette in der Kreuzung des Mittelhirns und des Kortex; kortikalen Hirnhaut vollständig zu entfernen mit Zange Nr. 4, fahren Sie dann mit der ventralen Hirnhäute entfernen. Sobald die Hirnhaut vollständig entfernt wurden, trennen Sie die Rinden von dem Rest des Gehirns mit Zange Nr. 4. Es ist wichtig, vollständig zu entfernen Hirnhautgewebe Mikroglia Reinheit und yiel maximierend.
3. Gehirngewebe Mincing
- Über Kortex zuvor vorbereitet Hacken Schüssel; weiterhin Hacken Schritt mit sterilen Technik in der Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank.
- Mit Scheren Nr. 3 Mince Hirngewebe, die Übertragung zerkleinerte Gewebe in ein 15 ml konischen Röhrchen;. Spülen Scheren und Hacken Schüssel mit 1 ml MM jeden, sammeln und abzugeben Spülungen in die 15 ml konischen Röhrchen, die das zerkleinerte Gewebe wird dieser Spülvorgang zu maximieren die Ausbeute an Mikrogliazellen durch Sicherstellung, dass alle Restgewebe ist mit konischen Röhrchen überführt. Lassen Gewebesuspension für 1-2 min ungestört, so dass zerkleinerte Gewebe auf dem Boden des Röhrchens zu begleichen. Haben 2 Minuten nicht überschreiten, da MM nicht essentiellen Nährstoffe enthalten.
- Entfernen und entsorgen 2 ml Überstand mit generischen 1000 ul Mikropipette mit einer Standard-Pipettenspitze, dass bestimmte nicht zu den niedergelassen Hackfleisch-Gewebe zu stören. 3 ml MCM zu der Hackfleisch-Gewebe; verreiben das Gewebe mit voller Kraft mit einem generischen 1000 ul Mikropipette mit einem Standard-Pipettenspitze ohne erkennbare feste Gewebe sollte bleiben, wenn Verreiben abgeschlossen ist.. Fügen Sie weitere 3 ml MCM mit der gleichen Pipettenspitze, sammeln Rest verrieben Probe aus der Pipettenspitze.
4. Wachsende kortikalen Zellen
- Zentrifuge das zerkleinerte Gewebe Zellen zu pelletieren (215 xg; 5 min; RT; klinischen Zentrifuge mit Ausschwingrotor). Zurück pelletierten Zellen zur biologischen Sicherheitsschrank, entfernen und den Überstand verwerfen; sanft Zellpellet (2 ml / Rohr; MCM), fügen Sie die Zelle Aufwirbelung zu der vorher hergestellten T-75-Kolben; Kappe der Flasche und legen Sie sie horizontal in einer befeuchteten Standardgewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Lassen Sie die Zellen für 24 h inkubiert.
- Nach 24 Stunden, klopfen Sie leicht Kolben gegen die Handfläche zu störenGewebereste. Check-Zellen vor und nach dem Abstich, um eine vollständige Entfernung von Rückständen sicherzustellen. Set Kolben vertikal; entfernen und entsorgen Medien, fügen frische MCM auf den Boden der Flasche (12 ml, 37 ° C), Kappe und legen Sie wieder in den Inkubator, horizontal.
- Überprüfen Zellen täglich auf Verschmutzung und das Wachstum zu überwachen.
- Bei etwa 17 bis 21 Tagen in vitro (DIV), werden Mikrogliazellen bereit für die Ernte aus dem gemischten Gliazellen Kultur. Um festzustellen, ob Zellen sind bereit, zu prüfen Zellen unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop. Mikroglia sind bereit für die Ernte, wenn sie bei ~ 40% Konfluenz. Sie erscheinen als kleine, hell, Kugelzellen wachsen als Monolayer auf andere Gliazellen.
5. Isolierung von Mikroglia vom gemischten Gliazellen Kultur
- Um Mikroglia zu isolieren, kräftig tippen Kolben gegen Labortisch. Diese Bewegung hilft separaten Mikroglia aus anderen Gliazellen aufgrund der niedrigen Hafteigenschaften von Mikroglia.
- Sammeln Stand Medien, die Mikroglia in einen sterilen konischen Zentrifugenröhrchen; Pellet Mikroglia (215 xg, 5 min; Ausschwingrotor).
- Resuspendieren der Mikropellets in warmem Mikroglia-Wachstumsmedium (MGM, MEM, ergänzt mit 1 mM Natriumpyruvat, 0,6% v / vglucose, 1 mM L-Glutamin, 100 ug / ml P / S, 5% v / v FBS, 2 ~ ml / Kolben), bestimmen die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und Platte 1 x 10 5 Zellen / Well in einer 24-Well-Plattenformat aufKunststoff-oder sterilen Glasdeckgläser (500 ul /; MGM). Mit diesem Verfahren die durchschnittliche Mikroglia Ausbeute beträgt 7,5 x 10 5 Zellen / pup Kortex.
- 24 Stunden nach der Beschichtung, entfernen Sie alle Medien-und Rückführungs Zellen mit frischem MGM (37 ° C), um schwimmende Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben der Zelle und Ruhe Mikroglia zu halten. Die Zellen können zum Experimentieren unmittelbar nach refeeding genutzt werden.
6. Beispiel Behandlungen
- Aussetzen Zellen 10 ng / ml von Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml Lipopolysaccharid (LPS) oder einer Fahrzeugsteuerung; Inkubation für 2 oder 24 h in befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
7. Analyse von Mikrogliazellen für Funktionalität Ex-vivo-Imaging über Immunfluoreszenz-und Immunzytochemie
- Nach der Behandlung der Ernte von Zellkulturmedien in Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) und zentrifuge mit einer Tischmikrozentrifuge (2 min; 900 xg), um Medien zu löschen. Den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen; Test sofort oder bei -20 ° C bis zur Verwendung. TNF-α Analysieren Konzentration in Zellkulturüberstand über handelsübliche Maus TNF-α-ELISA-Kit.
- Waschen der Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), und fixieren die Zellen mit 4% (w / v) Paraformaldehyd / 4% (w / v) Saccharose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min, RT). Nach der Fixierung, waschen Sie die Zellen mit PBS für 5 min unter leichtem Schütteln auf einem Rundschüttler.
- Immunfluoreszenz / Immunocytochemistry. Nach der Fixierung und PBS waschen, Prozess Mikroglia für Immunzytochemie. Alle Schritte mit leichtem Schütteln durchgeführt. Zellen permeabilisiert PBS/0.1% Triton X-100; Blockzellen in PBS/10% normalem Ziegenserum für eine Stunde. Zellen O / N Inkubieren bei 4 ° C mit Kaninchen-Anti-NF-&kgr; B-Antikörper (p65-Untereinheit; 1/1, 250) oder Kaninchen-anti-Iba-1-Antikörper (1/750) in Blockierungspuffer. Visuellize Antigen: Antikörper-Komplex nach Inkubation mit Fluoreszenz-konjugierte Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1 h, 1/1, 000). Entfernen von ungebundenem sekundärem Antikörper durch Waschen mit PBS/0.1% Triton X-100 (3 × 5 min).
- Gegenfärbung Zellen mit 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). In den Zellkern zu visualisieren Alle Mikroglia aus CX3CR1-GFP + / abgeleitet - Mäuse exprimieren GFP. Nutzen Sie eine 350 nm Wellenlängenfilter, um DAPI visualisieren, ein 488 nm Wellenlängenfilter mit GFP zu visualisieren, und ein 594 nm Wellenlängenfilter an p65 und Iba-1-Immun visualisieren.
- Berg Deckgläser unter Verwendung wässriger Lösung und Montage visualisieren Mikroglia mit Fluoreszenzmikroskopie.
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Representative Results
Beibehaltung der Immunphänotyp und Funktionalität der Mikroglia ex vivo während der Isolierung ist entscheidend, um in der Lage, diese Zellen als Untersuchungsmodell für Mikro Biologie zu nutzen. Um die erfolgreiche Konservierung von Mikroglia immunofunctionality Verwendung des vorliegenden Verfahrens zu demonstrieren, isolierten wir kortikalen Mikrogliazellen von P3 Neugeborenen (CX3CR1-GFP + / - und C57BL / 6) und behandelten Kulturen entweder mit LPS oder Pam.
Wie in 1A dargestellt, Isolierung der Mikroglia über Agitation durch Schütteln Dreh bewahrt die Ruhe-Phänotyp der Mikroglia im normalen in vivo-Bedingungen zugeschrieben. Um Mikroglia Reinheit, CX3CR1-GFP + / - wurden die Zellkulturen für die Makrophagen-Antigen Iba-1 und Zähler mit DAPI gefärbt, um den Zellkern sichtbar gefärbt. Wie in den 1A und 1B, unter geringer Vergrößerung Mikroglia Isolierung über die Prese gezeigtntly beschriebenen Verfahren zu einem hochreinen Zellkultur, als mehr als 95% der Zellen zeigen Kolokalisation von GFP, Iba-1 und DAPI.
Als nächstes versuchten wir die Reaktionsfähigkeit der Mikroglia ex vivo durch anspruchsvolle Zellen mit LPS bestätigen. Im Vergleich zu Vehikelbehandlung, LPS-behandelten CX3CR1-GFP + / -. Mikroglia angepasst einen starken morphologische Veränderung von einem kleinen, bipolare Phänotyp amöboid artige Form, wie in 1B gezeigt Dieser morphologische Veränderung ist auch in kortikalen Mikroglia isoliert rekapituliert von C57BL / 6 Neugeborenen mit Pam behandelt (Fig. 2). Diese konservierten morphologische Reaktion zwischen genetisch unterschiedlichen Mikroglia, mit unterschiedlichen Stimuli aktiviert, unterstreicht die Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit der vorliegenden Protokolls in Bezug auf die verschiedenen experimentellen Modellen.
Obwohl diese Änderung in der Morphologie anzeigt Aktivierungs 39, erforderlich, d istetermine wenn Mikroglia durch Schütteln isoliert Dreh behalten ihre Fähigkeit, p65 bei Aktivierung transloziert, was die Erhaltung der funktionellen TLR-vermittelten intrazellulären Signal. Um diese Signalkaskade zu bestätigen, behandelten wir Mikroglia aus C57BL / 6 Neugeborenen mit Pam isoliert. Wie in Fig. 2 dargestellt, immunzytochemische Färbung für p65 nachgewiesen, dass unter normalen Bedingungen, p65 diffus im gesamten Zytoplasma lokalisiert, wohingegen nach einer 2 h Stimulation mit Pam, p65-Immunoreaktivität dramatisch verschoben Lokalisation in den Zellkern.
Nachdem festgestellt wurde, dass Mikroglia durch die hierin präsentierten Verfahren isoliert Erhaltung der molekularen Mechanismen, die p65 in den Nukleus translozieren, neben wollten wir bestätigen, daß isolierte Mikroglia behalten ihre biochemischen immunofunctionality durch Testen ihrer Fähigkeit, ein Markenzeichen proinflammatorischen Zytokins TNF-α, bei Aktivierung sezer . Wie in Fig. 3, gezeigt inVergleich zu Vehikel-behandelten Mikroglia-Zellen Pam oder LPS ausgesetzt Erhöhung der Sekretion von TNF-α in das Kulturmedium (P <0,0001; Einweg-ANOVA), indikativ für funktionelle TLR1 / 2 andTLR4 Signalwege sind.
Daher zusammen, diese Daten zu etablieren, dass die Isolierung der Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner Zellkulturen mit erhaltenen Immunophänotyp und Funktionalität, ex vivo.
.. Bei P3 neugeborenen Mäusen und entweder mit Fahrzeug (A) oder bakterielle LPS (B) für 24 Stunden behandelt - Abbildung 1 Dreh Schütteln Ausbeuten hoher Reinheit Mikroglia-Kulturen mit erhaltenen Immunophänotyp Mikroglia-Zellen wurden aus CX3CR1-GFP + / isoliert.Die Zellen wurden mit 4% PFA, immuncytochemisch für Iba-1 gefärbt und Zähler mit DAPI angefärbt. (A) mit PBS Mikroglia weisen eine bipolare, Ruhe Phänotyp behandelt. (B) Nach der LPS, Mikroglia eine Anpassung amoeboid-ähnlichen Phänotyp, was auf Aktivierung. Zusammengeführt Kanal in Platten (A) und (B) unter 10-facher Vergrößerung zeigen, dass> 95% der Zellen sind GFP/Iba-1 positiven Zellen. 10X Maßstab: 100 um; 40X Maßstab: 20 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 2. Mikroglia isoliert über Dreh Schütteln transloziert NF-kB zu Kern auf Pam cha Zellellenge. Mikroglia-Zellen wurden aus C57BL / 6 Neugeborenen bei P3 isoliert und mit Fahrzeug oder Pam für 2 Stunden behandelt. Die Zellen wurden mit 4% PFA fixiert und für p65 über Immunzytochemie gefärbt. Zellen wurden mit DAPI gefärbt Zähler in den Zellkern zu visualisieren. In der Fahrzeug behandelt Mikroglia wird p65 in der gesamten Zytoplasma lokalisiert, während die Stimulation mit Pam induziert die nukleäre Translokation von p65. 40X Maßstab:. Um 20 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3. Mikroglia mit Dreh Schütteln Freisetzung von TNF-α bei der Einwirkung von Pam oder LPS isoliert. Mikroglia-Zellen wurden aus C57BL / 6 neugeborenen Mäusen isoliert und bei P3 mit Vehikel, Pam, oder LPS für 2 Stunden. Zellkulturüberstände auf die TNF-α Freisetzung gesammelt und mittels ELISA analysiert. *** P <0,0001 (n = 2; Einweg-ANOVA). Die Daten sind als Mittelwerte ± SD.
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Discussion
Das vorliegende Verfahren bietet eine effektive Methode zur Isolierung der kortikalen Mikrogliazellen von neugeborenen Mäusen. Dieses Verfahren hat einen zweifachen Vorteil 1) Erhaltung Mikroglia Immunphänotyps und Funktionalität, wie durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie und ELISA bestimmt, und 2) ermöglicht Mikroglia in der Gegenwart von anderen Gliazellen (Astrozyten und oligodentrocytes) vor dem reifen Isolation, die während der Gliazellen Kultur Reifezeit wichtige Zell-Zell-Interaktionen ermöglichen kann. Wichtig ist, ausgestellt isolierten Zellen hohe Lebensfähigkeit und Einheitlichkeit mit erhaltener Funktionalität und Immunophänotyp ex vivo.
Es gibt mehrere Schritte, die mit besonderer Aufmerksamkeit und Sorgfalt für die erfolgreiche Isolierung der Mikroglia mit der höchsten Reinheit und Ausbeute durchgeführt werden müssen. Diese Schritte sind: 1) die Aufrechterhaltung einer sterilen, gesunde Kultur in der gesamten Experimentierverfahren, 2) die Beseitigung aller Hirnhaut von der corTices während Mikrodissektion, 3) Waschen der richtigen Hacken Platte und die Scheren nach dem Hacken Kortex, 4) ausgleich MCM in T-75-Flaschen in Inkubator vor Beginn Mikrodissektion, 5) refeeding 24 Stunden nach der Isolation.
Da Mikroglia sind die Immunzellen Wohnsitz des ZNS, sind sie reagieren sehr stark auf Umwelteinflüsse. Daher vermeiden Kultur Kontamination mit Krankheitserregern ist entscheidend für die Erhaltung der immunphänotypische und funktionalen Eigenschaften von ruhenden Mikrogliazellen. Tägliche Inspektion der Zellen, um eine Verunreinigung und Wachstum zu überwachen, ist ein integraler Bestandteil Vermeidung beeinträchtigt Zellkulturen und um ein besseres Verständnis der Mikroglia-Wachstumsrate zu erhalten. Darüber hinaus ist es notwendig, MGM 24 Stunden nach der Beschichtung von Mikrogliazellen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und Funktionalität zu aktualisieren.
Ein großes Hindernis für die Isolierung Mikroglia zu überwinden ist, sicherzustellen, dass das Hackfleisch ZNS-Gewebe ist frei von Endothelzellen, die,falls vorhanden, Mikroglia-Proliferation durch Bildung von dichten Kolonien in den Gliazellen Kulturen behindern. Aus diesem Grund ist es entscheidend, die während des ZNS Meningen Mikrodissektion des Gehirns gründlich zu entfernen. Nach unserer Erfahrung sind die Meningen P3 Neugeborenen mit größerer Leichtigkeit als P1 Neugeborenen entnommen, während das Gewebe weiter entwickelten und leichter unter dem Präpariermikroskop visualisieren. Zusätzlich ist es wichtig zu vermeiden, die Benetzung der dorsalen Seite des Gehirns mit DM nach dem Entfernen des Gehirns aus dem Schädel. Dies kann, indem sie das Gehirn in anatomischen Position (Rückenseite), wenn es um die Übertragung DM durchgeführt werden. Halten der dorsalen Seite des Gehirns Trocken ermöglicht eine bessere Visualisierung und erleichtert die Entfernung der Hirnhaut.
Wir haben festgestellt, dass der effektivste Weg, um die Hirnhaut zu entfernen, ist in der hintersten Teil des Interhemisphärenspalt legen Sie die Kraft # 4, Hirnhaut-und Schäl aus, seitlich. Sobald die dorsalen Hirnhäute gelöscht wurden, haben wir dann remove der ventralen Hirnhäute durch Invertieren des Gehirns (ventralen Seite nach oben), und sanft Greifen der Riechkolben und Schäl zurück in Richtung des hinteren Teils des Gehirns. Wir entfernen dann alle verbleibenden ventralen Hirnhautgewebe durch leichtes Peeling und zupfen in einer seitlichen Bewegung. Anschließende Trennung der Rinde von dem Rest des Gehirns ist entscheidend für die Isolierung nur kortikalen Mikroglia. Die hier aufgeführten Verfahren ist auch flexibel, es kann verwendet werden, um Mikrogliazellen von subkortikalen Regionen zu isolieren, sowie werden. Obwohl, es ist wichtig zu beachten, dass die Zellausbeute niedriger aufgrund der Variabilität der Mikroglia Dichte gleichgültig cytoarchitectural Hirnregionen 40 sein.
Wir haben gefunden, daß die endgültige Ausbeute an Mikrogliazellen ist es wichtig, aus den in dem Verfahren verwendeten Materialien Wolf gründlich zu sammeln und das Spülen zu maximieren. Diese Spülungen sorgen für die komplette Sammlung aller Restgewebe, die auf den Hacken Schere geblieben sein kann, Petrischale und PipetteSpitze verwendet, um das zerkleinerte Gewebe in den konischen Rohr aliquotiert. Es ist wichtig, dass diese Spülungen erfolgen sofort nach der Übertragung des Hackfleisch ZNS-Gewebe an den konischen Rohr, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu optimieren. Es ist auch wichtig, um die Lebensfähigkeit der Zellen, die die Zellen nicht in MM bleiben länger als 2 min, da MM ist frei von wichtigen Nährstoffen.
Schließlich ist es wichtig, die T-75-Kolben mit MCM vorzubereiten und sie in der befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) vor dem Starten der Mikrodissektion Protokoll. THET-Kolben 75 hat eine poröse Auskleidung unter der Kappe, die für den Gasaustausch ermöglicht, Medien zu erleichtern Äquilibrierung vor der Zugabe des gemischten Gliakulturen. Wir haben festgestellt, dass das Versäumnis, dies zu tun ergibt sich eine suboptimale Mikro Ernte. Es ist auch wichtig, um das T-75-Kolben mit Parafilm Kappe, bevor der Kolben am Rotationsschüttler, um den Gasaustausch in den und aus dem Kolben während der Drehung zu minimieren abzudichten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung wurde in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen, die als potentieller Interessenkonflikt verstanden werden könnte durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIEHS R01ES014470 (KMZ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
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