Summary
En nyckel till framgångsrik utredning av microglial biologi är bevarandet av microglial immunofunction ex vivo under isolering från CNS-vävnad. Isolera mikroglia via roterande skakar resultat i mycket rena och immunofunctional cellkulturer som bedöms av fluorescerande imaging, immuncytokemiundersökning och ELISA efter mikroglia aktivering med proinflammatoriska stimuli lipopolysackarid (LPS) och Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolering av mikroglia från CNS-vävnad är ett kraftfullt utredningsverktyg som används för att studera microglial biologi ex vivo. Den nuvarande metoden information ett förfarande för isolering av mikroglia från neonatal mus cortex genom mekanisk omrörning med en roterande skak. Denna mikroglia isolering metod ger mycket rena kortikala mikroglia som uppvisar morfologiska och funktionella egenskaper tyder på vilande mikroglia i normala, nonpathological förhållanden in vivo. Detta förfarande bevarar också den microglial immunofenotyp och biokemisk funktion som visas av inducering av morfologiska förändringar, nukleär translokation av p65-subenheten hos NF-kB (p65) och utsöndring av ett kännetecken proinflammatorisk cytokin, tumörnekrosfaktor-α (TNF-α ), på lipopolysackarid (LPS) och Pam 3 CSK 4 (Pam) utmaningar. Därför bevarar immunofenotyp av både vilande och akti föreliggande isoleringsprocedurverad mikroglia, som ger en experimentell metod för att undersöka mikroglia biologi i ex vivo-förhållanden.
Introduction
Mikrogliaceller, övervaknings makrofagerna i CNS parenkym, utgör ungefär 12% av den totala cellpopulationen av den vuxna däggdjurshjärnan. Mikroglia härrör från gulesäcken myeloid precursorceller och varierar i celltäthet och morfologi på olika cytoarchitectural regioner inom den vuxna CNS 1-5. I en frisk vuxen hjärna, mikroglia är små, förgrenade eller polära celler med fina, dynamiska processer. I motsats till perifera makrofager morfologi, mikroglia visar en vilande, låg profil fenotyp i friska hjärnor som kan visas som cellulär inaktivitet, men in vivo imaging studier visar att microglial processer dynamiskt sträcka ut och dra för att övervaka deras mikromiljö på ett sätt som påminner om " provtagning och mätning "6,7.
Mikroglia är starkt och differentiellt lyhörda för miljö-och patofysiologiska förändringar i hjärnan, bytafrån en surveillant till en effektor stats allmänt betraktas som deras vilande och aktiverade stater, respektive. Denna switch i aktivering kan förmedlas genom ingrepp av membranbundna mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS), såsom avgiftsliknande receptorer (TLRs), som svarar mot patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), nämligen bakterie-och virus-härledda lipoproteiner , nukleinsyror och kolhydrater 8-11. Förutom PAMPs har PRRs även visats inducera microglial aktivering mot sterila, icke-patogena molekyler som kallas fara / skada-associerade molekylära mönster (dämpas), som utgör en störning i CNS homeostas, såsom cellskador 12-16. En gång i ingrepp, PRRs initiera en intracellulär signalkaskad som resulterar i förändringar i microglial cellmorfologi och genexpression; specifikt aktiverade mikroglia anpassa en amöboid liknande fenotyp, translokera p65-NF-KB-subenhet (p65) till cellkärnan, och uppreglera produInsatser och utsöndring av proinflammatoriska cytokiner, såsom tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), interleukin-1 β (IL-1β), tillsammans med reaktiva syreradikaler (ROS) 16 till 24. Även integrerad i det medfödda immunsvaret i CNS har dessa utsöndrade molekyler även befunnits öka neuronal oxidativ stress och därmed inducera och förvärrar neurodegeneration i sjukdomstillstånd som Parkinsons och Alzheimers sjukdom 25-29.
Emellertid är mekanismen av microglial aktivering i patologiska tillstånd inte helt klarlagd. Därför är isolering av mikroglia ett kraftfullt undersökande verktyg i dessa biologiska processer, så många in vivo funktioner i microglial aktivering kan rekapituleras i kultur. Flera metoder finns tillgängliga för isolering av mikroglia, inklusive isolering via en Percoll gradient efter enzymatisk nedbrytning av CNS-vävnad 30,31. Emellertid kan enzymatisk spjälkning förändraden immunofenotyp av cellerna genom att minska cellyteantigen uttryck 32 och resulterar i lägre cellutbyte per djur än den metod som beskrivs häri. Specifikt rapporterar vi en genomsnittlig mikroglia avkastning per valp cortex av 7,5 x 10 5 celler, medan tidigare rapporterade isoleringsmetoder från hela CNS via en Percoll gradient avkastning 3-5 x 10 5 celler 30,33,34. Det nuvarande förfarandet kringgår användning av matsmältningsenzymer genom att isolera mikroglia baserat på deras låg vidhäftningsförmåga och därmed bevara den microglial immunofenotyp och funktionalitet.
I den aktuella studien beskriver vi isoleringen av mikrogliaceller från blandade gliaceller kulturer härrör från neonatal heterozygota CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) och C57BL / 6 mus cortex genom mekanisk omrörning på en roterande shaker, en förlängning av tidigare publicerad metod 24,35. Vi utnyttjar det tidigare musstam för enkel visualisering av mikroglia, somDessa möss uttrycker GFP under kontroll av den endogena CX3CR1 locus - en monocyt-specifik promotor från 36 till 38. Denna metod ger högrena microglial kulturer med en bevarad immunofenotyp ex vivo såsom visas genom morfologiska förändringar, nukleär translokation av p65 och utsöndring av TNF-α när de utsattes för bakteriell lipopolysackarid (LPS) eller Pam 3 CSK 4, TLR4 och TLR1 / 2 agonister , respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Före start detta protokoll, samla neonatala möss vid postnatal dag 1-3 (P1-3) i en steril behållare kapslad med original bur strö för skydd och värme. Det är viktigt att arbeta snabbt och effektivt genom detta protokoll för att optimera microglial avkastning. Se tabell 1 för fullständig reagens lista.
1. Beredning av instrument, Kultur Media och rätter
- Bered 10 ml / pup Mikroglia Complete Media (MCM; 1x Minimal Essential Medium Earles [MEM] kompletteras med: 1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 0,6% volym / volym D-(+)-glukos, 100 | ig / ml penicillin / streptomycin (P / S), 4% volym / volym fetalt bovint serum (FBS), 6% volym / volym hästserum) och lägga till varje T-75 kolv (en kolv / pup); lock och plats horisontellt i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i jämvikt under 1 timme. Det är viktigt att komma i jämvikt till detta medium i kolv (ar) före start av dissekering.
- Prepare, alikvot, och varm i 37 ° C vattenbad i MCM för dissektion (6 ml / pup) och i ett separat koniskt rör MCM för cellåtersuspension (2 ml / pup). Förbered alikvot, och kyla på is Mincing Media (MM; HBSS supplementerat med: 100 | ig / ml P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / pup) och Analysera media (DM; MEM kompletterat med 100 | ig / ml P / S; 2 ml / pup).
- Sterilisera följande kirurgiska verktyg genom nedsänkning i 70% etanol under 10 min: scissor # 1 (1; att decapitate) forcep # 1 (2; att säkra nos och avlägsna cortex), scissor # 2 (1; nonangled; att öppna hårbotten ), forcep # 2 (1; att ta bort hårbotten), forcep # 3 (1, för att ta bort skallen), forcep # 4 (2; för att ta bort hjärnhinnan), sax # 3 (1; att mala hjärnvävnad). Låt lufttorka på en steril kompress.
- Torka av arbetsstationen och dissektion mikroskop horisontal-luftflödet med 70% etanol.
- Fördela DM i 2 sterila, 100 mm petriskålar för att fånga huvudet (3 ml, 1 skål / 3 valpar) och dissektion (1 ml;1 fat / valp, kylda på is före dissektion). Fördela MM i 1 steril, 100 mm petriskål för malning hjärnvävnad (1 ml, 1 fat / valp).
2. Brain Tissue Dissection
- Före dödshjälp, försiktigt sanera hals och huvud av valp med 70% etanol med hjälp av ett labb vävnad. Med scissor # 1, snabbt avliva pup genom avlägsnande av huvud, fånga huvudet i tidigare framställda petriskål. Euthanize och slutföra dissektion av en valp innan du fortsätter till nästa djur.
- För över huvudet till kyld dissektion skålen, i dissektion mikroskop säkra huvudet genom att klämma näsan med hjälp forcep # 1 (alternativt kan huvudet säkras genom piercing pincetten genom ögonhålan), öppen hårbotten med hjälp av sax # 2 genom att skapa en Y-cut: börja från botten av huvudet och i vinkel mot ögonen. Använd forcep # 3 för att försiktigt ta bort hårbotten genom att dra i sidled, exponera skallen.
- Använda forcep # 3, försiktigt bort bindväv vid basen avhuvud. När basen av skallen är utsatt, försiktigt öppna skallen genom att trä en arm av forcep mellan hjärnan och skallen (efter interhemispheric spricka), grepp, dra försiktigt skallen uppåt för att riva upp.
- Disrupt bindväv enligt ventrala sidan av hjärnan med hjälp forcep # 1, och därefter ta bort hjärnan med användning av samma verktyg. Lyft hjärnan ur skallen med hjälp av en uppåtriktad kraft på den ventrala sidan av hjärnan.
- Håll hjärnan i dess anatomiska positioner: dorsala sidan uppåt för att visualisera cortex under dissektionsmikroskop; säkra hjärnan på plats genom att föra in spetsarna på pincetten i skärningspunkten mellan mitthjärnan och cortex; fullständigt avlägsna kortikala hjärnhinnorna med forcep # 4, fortsätt sedan att ta bort den ventrala hjärnhinnorna. När hjärnhinnorna har tagits bort, separera cortex från resten av hjärnan med hjälp forcep # 4. Det är viktigt att helt ta bort meningeal vävnad för att maximera mikroglia renhet och yield.
3. Brain Tissue Mincing
- Överför cortex tidigare förberedd hackskål, fortsätta att finhacka steg med steril teknik i klass II biologiska säkerhetsskåp.
- Färs hjärnvävnad med hjälp av sax # 3, överföring malet vävnad till ett 15 ml koniskt rör,. Skölj saxar och hackskål med 1 ml MM vardera, samla in och fördela sköljningar i 15 ml koniskt rör som innehåller den malda vävnaden Denna sköljsteg maximerar avkastningen av mikroglia genom att säkerställa att alla kvarvarande vävnad överförs till koniska rör. Lämna vävnad fjädring ostört i 1-2 minuter, vilket gör malet vävnad för att bosätta sig i botten av röret. Överskrid inte 2 minuter som MM inte innehåller viktiga näringsämnen.
- Ta försiktigt bort och kasta 2 ml av supernatanten med generiska 1,000 l mikropipett med en vanlig pipett spets, göra vissa att inte störa den fasta malet-vävnad. Tillsätt 3 ml MCM till malet-vävnad, mal sönder vävnaden med full kraft med hjälp av en generisk 1,000 l mikropipett med en vanlig pipett spets Ingen märkbar fast vävnad bör förbli vid rivning är klar.. Lägg till ytterligare 3 ml MCM med samma pipettspets, samla resterande triturerades prov från pipettspetsen.
4. Växande kortikala Celler
- Centrifugera malet vävnaden till pellets cellerna (215 xg, 5 min, RT, klinisk centrifug med svängrotor). Återgå pelleterat celler till biologisk säkerhet skåp, ta bort och kassera supernatanten, försiktigt resuspendera cellpelleten (2 ml / rör, MCM), lägga cellen resuspension till den tidigare beredda T-75 kolv, mössa kolven och placera den horisontellt i en fuktad, standard vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2). Låt cellerna att inkubera under 24 timmar.
- Efter 24 timmar, knacka försiktigt kolven mot handflatan för att störavävnad skräp. Kolla celler före och efter knacka för att säkerställa fullständigt avlägsnande av skräp. Set kolv vertikal; ta bort och kasta medier; tillsätta färsk MCM till botten av kolven (12 ml, 37 ° C), locket och placera tillbaka i inkubatorn, horisontellt.
- Kolla celler dagligen för föroreningar och att övervaka tillväxten.
- Vid ungefär 17-21 dagar in vitro (DIV), kommer mikrogliaceller vara redo för skörd från den blandade gliaceller kulturen. För att avgöra om cellerna är redo, undersöka celler under ett inverterat faskontrastmikroskop. Mikroglia är redo för skörd när på ~ 40% sammanflytning. De visas som små, ljusa, sfäriska celler, växer som ett monolager ovanpå andra glia.
5. Isolering av Mikroglia från Mixed Glial Culture
- För att isolera mikroglia, kraftigt knacka kolven mot laboratoriebänk. Denna agitation hjälper separata mikroglia från andra gliaceller på grund av de låga vidhäftningsegenskaper mikroglia.
- Samla supernatanten media som innehåller mikroglia i ett sterilt koniskt centrifugrör, pellets mikroglia (215 xg, 5 min, svängig hink rotor).
- Resuspendera microglial pelleten i varm Microglial Growth Medium (MGM; MEM kompletterat med: 1 mM natriumpyruvat, 0,6% volym / vglucose, 1 mM L-glutamin, 100 | ig / ml P / S, 5% vol / vol FBS; ~ 2 ml / kolv), bestämma cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer, och plattan 1 x 10 5 celler / brunn i en 24-brunnars platta format påplast eller sterila täckglas (500 l / brunn, MGM). Med hjälp av denna procedur i genomsnitt mikroglia avkastningen är 7,5 x 10 5 celler / valp cortex.
- 24-tim efter plätering, ta bort alla media och refeed celler med färska MGM (37 ° C) för att avlägsna flytande celler och skräp. Detta steg är avgörande för cellöverlevnad och för att upprätthålla vilande mikroglia. Celler kan utnyttjas för experiment direkt efter återmatning.
6. Exempel Behandlingar
- Exponera celler till 10 ng / ml av Pam 3 CSK 4 (PAM), 10 ng / ml lipopolysackarid (LPS) eller vehikelkontroll; inkubera i 2 eller 24 h i fuktad inkubator (37 ° C, 5% CO2).
7. Analysera Mikroglia för funktionalitet Ex vivo via Immunofluorescent Imaging och Immuncytokemi
- Efter behandling, skörd cellodlingsmedia i mikrofugrör (1,5 ml) och centrifuge hjälp av en bordsskiva mikrocentrifug (2 min, 900 xg) för att rensa media. Överför supernatanten till ett rent mikrofugrör, analys omedelbart eller förvara vid -20 ° C tills den ska användas. Analysera TNF-α-koncentrationen i cellodlingssupernatant via kommersiellt tillgänglig mus-TNF-α-ELISA-kit.
- Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och fixera cellerna med 4% (vikt / volym) paraformaldehyd / 4% (vikt / volym) sackaros / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min, RT). Efter fixering, tvätta cellerna med PBS under 5 min med försiktig skakning på orbitalskak.
- Immunfluorescens / Immuncytokemi. Efter fixering och PBS tvättar, process mikroglia för immunocytokemi. Alla steg utförs med försiktig skakning. Permeabilisera celler in PBS/0.1% Triton X-100; blockera celler i PBS/10% normalt getserum under en timme. Inkubera cellerna O / N vid 4 ° C med kanin-anti-NF-KB-antikropp (p65-subenheten, 1/1, 250) eller kanin anti-Iba-1-antikropp (1/750) i blockeringsbuffert. Visuellize antigen: antikropp-komplexet efter inkubering med fluorescerande konjugerad get anti-kanin IgG sekundär antikropp (1 timme, 1/1 000). Avlägsna obunden sekundär antikropp genom tvättning med PBS/0.1% Triton X-100 (3 x 5 min).
- Counter fläck celler med 4 ',6-Diamidino-2-fenylindol / PBS (DAPI, 0,1 | ig / ml). Att visualisera cellkärnan Alla mikroglia härledda från CX3CR1-GFP + / - möss uttrycker GFP. Använda en 350 nm våglängd filter för att visualisera DAPI, en 488 nm våglängd filter för att visualisera GFP, och en 594 nm våglängd filter för att visualisera p65 och Iba-1 immunkomplex.
- Montera täckglas med hjälp av vattenmonteringslösning och visualisera mikroglia med fluorescerande mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att behålla immunofenotyp och funktionaliteten av mikroglia ex vivo under isoleringen är avgörande för att kunna utnyttja dessa celler som en utredningsmodell för microglial biologi. För att demonstrera den framgångsrika bevarandet av mikroglia immunofunctionality användning av föreliggande förfarande isolerade vi kortikala mikroglia från P3 nyfödda (CX3CR1-GFP + / - och C57BL / 6) och behandlades kulturerna med antingen LPS eller Pam.
Såsom illustreras i fig 1A, isolering av mikroglia via agitation genom roterande skakning bevarar quiescent fenotyp skrivas mikroglia under normala in vivo-betingelser. För att bedöma microglial renhet, CX3CR1-GFP + / - var cellodlingar färgades för makrofag antigen Iba-1 och motfärgades med DAPI för att synliggöra cellkärnan. Som visas i figur 1a och 1b, under låg förstoring, mikroglia isolering via presently beskriven metod resulterar i en mycket ren cellodling, eftersom mer än 95% av cellerna uppvisar colocalization av GFP, Iba-1, och DAPI.
Vi sökte bredvid bekräfta lyhördhet mikroglia ex vivo genom att utmana celler med LPS. I jämförelse med behandlingen vehikel, LPS-behandlade CX3CR1-GFP + / -. Mikroglia anordnad en skarp morfologisk förändring från ett litet, bipolär fenotypen till en amöboid liknande form, såsom visas i Figur 1B Denna morfologiska förändringar är också sammanfattat i kortikala mikroglia isolerade från C57BL / 6 nyfödda barn som behandlas med Pam (Figur 2). Detta bevarade morfologiska respons mellan genetiskt distinkta mikroglia, aktiveras med olika stimuli, stryker reproducerbarhet och tillämpligheten av detta protokoll i fråga om att olika experimentella modeller.
Även om denna förändring i morfologi indikerar aktivering 39, är det nödvändigt att determine om mikroglia isoleras med roterande skakning behåller sin förmåga att translocate p65 vid aktivering, vilket indikerar att bevara funktionella TLR-förmedlad intracellulär signalering. För att bekräfta detta signalering kaskad, behandlade vi mikroglia isolerade från C57BL / 6 nyfödda med Pam. Som visas i figur 2, immuncytokemiska färgning för p65 framgår att, under normala förhållanden, är p65 diffust lokaliserad i hela cytoplasman, medan efter en 2 tim stimulering med Pam, p65 immunreaktivitet skiftat dramatiskt lokalisering till cellkärnan.
Efter att ha fastställt att mikroglia isolerades via den metod som presenteras häri bevara de molekylära mekanismerna att translokera p65 till kärnan, intill ville vi bekräfta att isolerade mikroglia behålla deras biokemiska immunofunctionality genom att testa deras förmåga att utsöndra ett kännetecken proinflammatorisk cytokin, TNF-α, vid aktivering . Såsom visas i figur 3, ijämförelse med vehikelbehandlade mikroglia, celler exponerade för Pam eller LPS öka sekretionen av TNF-α in i odlingsmedier (P <0,0001, en-vägs ANOVA), vilket indikerar funktionell TLR1 / 2 andTLR4 signalvägar, respektive.
Därför tillsammans, dessa uppgifter fastställa att isolering av mikroglia via roterande skakar ger mycket rena cellkulturer med bevarad immunofenotyp och funktionalitet, ex vivo.
.. Figur 1 Rotary skakning utbyten högrena microglial kulturer med bevarad immunofenotyp microglial celler isolerades från CX3CR1-GFP + / - neonatala möss vid P3 och behandlades med antingen vehikel (A), eller bakteriella LPS (B) under 24 timmar.Celler fixerades med 4% PFA, immunocytokemiskt färgades för Iba-1, och motfärgades med DAPI. (A) Mikroglia behandlades med PBS uppvisar en bipolär, stilla fenotyp. (B) När LPS utmaning, mikroglia anpassa en amöboid-liknande fenotyp, ett tecken på aktivering. Sammanslagen kanal i paneler (A) och (B) under 10x förstoring visar att> 95% av cellerna är GFP/Iba-1 positiva celler. 10X skala bar: 100 m; 40X skala bar: 20 nm. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Mikroglia isolerade via roterande skaka translocate NF-kB till cellkärnan på Pam challenge. microglial celler isolerades från C57BL / 6 nyfödda av P3 och behandlades med vehikel eller Pam under 2 timmar. Cellerna fixerades med 4% PFA och färgas för p65 via immunocytokemi. Cellerna motfärgades med DAPI för att synliggöra cellkärnan. I fordon behandlad mikroglia, är p65 lokaliserad i hela cytoplasman, medan stimulering med Pam inducerar den nukleära translokation av p65. 40X skal:. 20 um Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Mikroglia isolerade med roterande skakning frisättning av TNF-α vid exponering för Pam eller LPS. Microglial celler isolerades från C57BL / 6 neonatala möss vid P3 och behandlades med vehikel, Pam, eller LPS för 2 tim. Cell-odlingssupernatanter uppsamlades och analyserades genom ELISA med avseende på TNF-α frisättning. *** P <0,0001 (n = 2, en-vägs ANOVA). Data presenteras som medelvärden ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande förfarandet erbjuder en effektiv metod för isolering av kortikala mikroglia från neonatala möss. Detta förfarande har en dubbel nytta av 1) bevara mikroglia immunofenotyp och funktionalitet, som bestäms av fluorescerande imaging, immuncytokemiundersökning och ELISA, samt, 2) låta mikroglia att mogna i närvaro av andra gliaceller (astrocyter och oligodentrocytes) före isolering, som kan underlätta viktiga cell-cell-interaktioner under glial kultur mognadsperiod. Viktigt är isolerade celler visar hög lönsamhet och enhetlighet med bevarad funktionalitet och immunofenotyp ex vivo.
Det finns flera steg som måste utföras med särskild uppmärksamhet och omsorg för framgångsrik isolering av mikroglia med högsta renhet och avkastning. Dessa steg är: 1) att upprätthålla en steril, hälsosam kultur under hela försöksförfarandet, 2) ta bort alla hjärnhinnor från motsvarandeTices under microdissection, 3) ordentlig tvättning av hackplatta och sax efter finhacka cortex, 4) jämvikts MCM i T-75 kolvar i kuvös innan microdissection, 5) refeeding 24 timmar efter isolering.
Eftersom mikroglia är bosatta immunceller i CNS, de är mycket lyhörda för miljö förolämpningar. Därför undvika kontamine kultur med patogena agens är avgörande för att bevara de immunophenotypic och funktionella attribut vilande mikrogliaceller. Daglig inspektion av cellerna för att övervaka kontaminering och tillväxt är väsentlig att undvika komprometterade cellkulturer och att få en bättre förståelse av microglial tillväxttakt. Vidare är det nödvändigt att uppdatera MGM 24-timmar efter plätering av mikroglia i syfte att upprätthålla cellviabilitet och funktion.
Ett stort hinder att övervinna för att isolera mikroglia är att säkerställa att det malda CNS-vävnad är fri från endotelceller, som,om närvarande, kan hindra microglial spridning genom att bilda täta kolonier i gliaceller kulturer. Av denna anledning är det viktigt att noggrant ta bort CNS hjärnhinnorna under microdissection av hjärnan. Enligt vår erfarenhet är hjärnhinnorna av P3 neonates avlägsnades med större lätthet än P1 nyfödda, såsom vävnaden är mer utvecklad och lättare att visualisera under dissektionsmikroskop. Dessutom är det viktigt att undvika att blöta ryggsidan av hjärnan med DM efter att ta bort hjärnan från skallen. Detta kan göras genom att hålla hjärnan i anatomisk position (ryggsidan uppåt) när den överförs till DM. Att hålla ryggsidan av hjärnan torrt ger bättre visualisering och enklare borttagning av hjärnhinnorna.
Vi har funnit att det mest effektiva sättet för att avlägsna hjärnhinnorna är att sätta in den kraft # 4 i den mest bakre delen av interhemispheric fissur och avdrag hjärnhinnorna av, i sidled. När ryggmening har rensats, då remo vive de ventrala hjärnhinnorna genom att vända hjärnan (ventrala sidan uppåt), och försiktigt ta tag lukt lökar och peeling tillbaka mot den bakre delen av hjärnan. Vi tar bort sedan eventuellt kvarventrala meningeal vävnad genom att försiktigt peeling och tweezing i en rörelse i sidled. Efterföljande separation av hjärnbarken från resten av hjärnan som är viktigt för att isolera endast kortikala mikroglia. Det förfarande som beskrivs häri är också flexibel i det att den kan användas för att isolera mikroglia från subkortikala regioner, liksom. Men, är det viktigt att notera att cell avkastningen kan vara lägre på grund av variationer i mikroglia densitet likgiltig cytoarchitectural hjärnregioner 40.
Vi har funnit att för att maximera den slutliga avkastningen av mikroglia är det viktigt att skölja och samla skölj ur de material som används i malningen processen. Dessa sköljningar se den kompletta samlingen av all resterande vävnad som kan ha legat på malningen sax, petriskål, och pipettenspets som används för att alikvot den malda vävnaden i den koniska röret. Det är viktigt att dessa sköljningar ske omedelbart efter överföring av malet CNS-vävnaden till den koniska rör, för att optimera cellernas livskraft. Det är också viktigt att cellviabiliteten att cellerna inte stanna MM längre än 2 minuter sedan MM saknar viktiga näringsämnen.
Slutligen är det viktigt att förbereda T-75 kolvar med MCM och placera dem i fuktig kuvös (37 ° C, 5% CO 2) före start av microdissection protokollet. Thet-75-kolv har en porös foder under sin mössa som möjliggör utbyte av gaser, underlättar mediajämvikts före tillsatsen av blandade gliaceller kulturer. Vi har funnit att underlåtenhet att göra detta resulterar i en suboptimal microglial skörd. Det är också viktigt att försegla T-75 kolv mössa med Parafilm innan produkten släpps ut kolven på den roterande skakapparat för att minimera gasutbyte in och ut ur kolven vid rotation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att den forskning som genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kunde tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
