Summary
Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.
Abstract
CNS dokusundan mikrogliya İzolasyonu ex vivo mikrogliyal biyolojisi okumak için kullanılan güçlü bir araştırma aracıdır. Mevcut yöntem, döner bir karıştırıcı, mekanik çalkalama ile neonatal murin kortekslerinden mikroglia izolasyonu için bir prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, mikroglia izolasyon verimi canlı içinde normal ve patolojik olmayan koşullarda sakin mikroglia göstergesidir morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini gösteren yüksek ölçüde saf bir kortikal mikroglia. Morfolojik değişiklikler, NF-KB (p65) bir p65 alt birimi nükleer translokasyonu ve ayırt edici özelliği pro-enflamatuar sitokin salgılanması, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α endüksiyonu ile gösterildiği gibi, bu prosedür, aynı zamanda mikroglial immünfenotip ve biyokimyasal özelliğe korur ), lipopolisakarid'e (LPS) ve Pam 3 CSK 4 (Pam) zorluklar üzerine. Bu yüzden, bu izolasyon prosedürü ve hareketsiz acti hem de immünfenotip korurex vivo koşullarda mikrogliya biyolojiyi araştıran deneysel bir yöntem sağlayan çıkartılır mikrogliya.
Introduction
Mikroglial hücreleri, CNS parankima gözetim makrofajlar, erişkin memeli beyin, toplam hücre popülasyonunun yaklaşık olarak% 12 ihtiva eder. Mikroglia yolk kesesi miyeloid öncü hücrelerinden türetilen ve yetişkin CNS 1-5 içinde farklı bölgelerde cytoarchitectural hücre yoğunluğu ve morfolojik olarak değişmektedir. Sağlıklı bir yetişkin beyninde, mikrogliya ince, dinamik süreçleri ile, küçük dallanmış veya polar hücrelerdir. Bununla birlikte, in vivo görüntüleme çalışmaları mikroglial işlemleri dinamik "andıran bir şekilde uzanır ve mikro izlemek için geri göstermektedir; çevresel makrofaj morfolojisi aksine, mikroglia hücresel işlem olarak görünebilir sağlıklı beyinlerinde bir hareketsiz, düşük profilli bir fenotip göstermektedir örnekleme ve "6,7 ölçme.
Mikroglia geçiş, yüksek ve diferansiyel olarak beyinde çevresel ve patofizyolojik değişikliklere duyarlısırasıyla bir efektör devlet-genellikle kendi dinlenme olarak kabul ve aktif devletler, bir surveillant dan. Aktivasyonuna Bu anahtar, bu patojenle ilişkili moleküler kalıpları yanıt toll benzeri reseptörler (TLR), (PAMPs), yani bakteri ve viral türevli lipoproteinler olarak membrana bağlı görüntü tanıma reseptörleri (PRR) arasında takılma ile aracılık edilebilir , nükleik asitler, karbonhidratlar ve 8-11. PAMPs ek olarak, PRR'ler, aynı zamanda, hücre hasarı 12-16 gibi CNS homeostatisinde sarsımına temsil tehlike / hasar ile bağlantılı moleküler kalıpları (DAMPS) olarak bilinen steril, patojenik olmayan moleküllere karşı, mikroglial aktivasyonunu teşvik ettiği gösterilmiştir. Bir kez yerleştikten sonra PRR mikroglial hücre morfolojisi ve gen ekspresyonunda değişiklikler ile sonuçlanır bir hücre içi sinyalleme kaskadını başlatabilir, özel olarak ise, aktive edilmiş mikroglia bir amoeboid benzeri fenotip adapte hücre çekirdeğine NF-KB p65 alt ünitesi (p65) yerini değiştirmek ve upregüle süredenşeklinde gösterilmektedir ve bu reaktif oksijen türleri (ROS) 16-24 ile birlikte, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), interlökin-1 β (IL-1β) gibi proenflamatuar sitokinlerin salgılanması. CNS'nin doğuştan gelen immün yanıt olarak tamamlayıcı olsa da, bu salgılanan moleküller de bu şekilde, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi hastalık durumlarının 25-29 nörodejenerasyonu neden olan ve arttıran, nöronal oksidatif stres geliştirmek için bulunmuştur.
Bununla birlikte, patolojik durumların mikrogliyal aktivasyonun mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Mikroglial aktivasyonun vivo özellikleri birçok kültür değinmeyecek olabilir Bu nedenle, mikroglia izolasyonu, bu biyolojik süreçlere güçlü bir araştırma aracıdır. Çeşitli yöntemler CNS doku 30,31 enzimatik sindirimi takip eden bir Percoll gradyanı ile izolasyon dahil olmak üzere, mikroglia, izole edilmesi için kullanılabilir. Bununla birlikte, enzimatik sindirim değiştirebilirAntijen ekspresyonu 32 hücre yüzeyi azaltılması ve burada tarif edilen yönteme göre, hayvan başına daha düşük hücre verimle sonuçlar ile hücrelerin immünofenotipi. Daha önce bir Percoll verim 3-5 x 10 5 hücre 30,33,34 yoluyla tüm CNS izolasyon yöntemleri rapor ederken Özellikle, biz, 7,5 x 10 5 hücre yavru korteksinde başına ortalama mikrogliya verim rapor. Bu prosedür, bu şekilde mikroglial immünfenotip ve işlevselliğini korumak, düşük-yapışma özelliklerine göre mikroglia izole edilmesi ile sindirim enzimlerinin aşılmaktadır.
Döner bir karıştırıcı, daha önce bir uzantısına mekanik ajitasyon ile, ve C57BL / 6 faregiller korteks - Bu çalışmada, neonatal heterozigot CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + /) türetilmiş karışık glial kültürlerinden mikroglial hücreleri izole edilmesini tarif 24,35 yayınlanan yöntem. Biz mikrogliya kolay görsellik için eski fare zorlanma kullanmak gibibir monosit spesifik promoter 36-38 - Bu farenin endojen CX3CR1 mahalinin kontrolü altında GFP ifade eder. Bu yöntem, bir korunmuş immünofenotipi ex vivo bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) veya Pam 3 CSK 4 ile meydan morfolojik değişiklikler, p65 nükleer translokasyonu ve TNF-α salgılanması ile gösterildiği gibi, TLR4 ve TLR1 / 2 agonistleri ile son derece saf bir kültür Mikroglial üretir sırasıyla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Önce bu protokolü başlayan, doğum sonrası günlerde yenidoğan farelerin toplamak 1-3 koruma ve sıcaklık için özgün kafes yatak ile iç içe bir steril kap içinde (P1-3). Bu mikrogliyal verimi optimize etmek, bu protokol sayesinde hızlı ve verimli bir şekilde çalışmak önemlidir. Tam reaktif listesi için Tablo 1'e bakınız lütfen.
1.. Aletleri, Kültür, Medya ve Yemekleri hazırlanması
- 10 ml / pup Mikroglia tam ortam maddesi (MCM hazırlanması; 1x Minimal Essential ile desteklenmiş Medium Earle [MEM]: 1 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat,% 0.6 v / v D-(+)-glukoz, 100 ug / ml Penisilin / Streptomisin (P / S),% 4 h / h cenin sığır serumu (FBS), 6 v / v% at serumu) ve her bir T-75 balonuna (1 şişe / yavru) eklemek, kapak ve yeri yatay olarak bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO2), 1 saat boyunca dengelenmeye. O diseksiyon başlamadan önce bir şişe (ler) de bu ortamı dengeye için gereklidir.
- Prepare, kısım ve sıcak diseksiyon (6 ml / pup) için 37 ° C su banyosu MCM ve hücre yeniden süspansiyon (2 mi / yavru) için ayrı bir konik tüp MCM halinde. Ve Kesme Media (DM; MEM 100 ug / ml ile takviye edilmiş P /: buz Kıyma Media (,, 100 ug / ml P / S, 0.01 M HEPES 3 ml / pup HBSS ile takviye MM) hakkında Hazırlama, kısım ve soğuk S, 2 ml / pup).
- 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde boğulma yolu ile aşağıdaki cerrahi aletleri sterilize: makas # 1 (1; başını kesmek için), # 1 forcep (2; burun güvenli ve korteks kaldırmak için), makas # 2 (1; nonangled; açmak için kafa derisi ,) makas # 3 (1 meninksler kaldırmak için,), forcep # 2 (1;,) kafatası kaldırmak için forcep # 4 (2; # 3 (1 forcep) derisini çıkarmak için beyin dokusunu inceltmek için). Steril bir pad üzerinde kurumaya bırakın.
- % 70 etanol ile yatay hava akımı iş istasyonu ve diseksiyon mikroskop aşağı silin.
- Başını yakalamak için 2 steril, 100 mm Petri kapları içine DM dağıtın (3 ml, 1/3 yavrular çanak) ve diseksiyonu (1 ml;Diseksiyon önce buz üzerinde soğutulmuş); / yavru 1 tabak. Beyin dokusu (; 1 tabak / yavru 1 ml) kıyma için 1 steril, 100 mm Petri kabı içine MM dağıtın.
2. Beyin Dokusu Diseksiyon
- Ötenazi öncesinde, hafifçe bir laboratuar dokusu kullanılarak% 70 etanol ile boyun ve yavru başını sterilize. Makas # 1, hızla başını kaldırarak yavru euthanize; yakalama kafasını önce hazırlanan Petri kabındaki. Euthanize ve sonraki hayvana geçmeden önce bir yavru diseksiyon tamamlayın.
- Soğutulmuş diseksiyon çanak kafa transferi, açık kafa derisi bir oluşturarak makas # 2 kullanarak; diseksiyon mikroskobu altında # 1 (alternatif olarak, kafa göz soket aracılığıyla forseps piercing tarafından güvence altına alınabilir) forcep kullanarak burun sıkarak başını sağlamlaştırmak Y-cut: kafa tabanından ve gözleri doğru bir açıyla başlar. Yavaşça kafatası açığa yanal soyulması ile kafa derisi kaldırmak için 3. forcep kullanın.
- Forcep 3. kullanarak, yavaşça tabanının en bağ dokusu kaldırmakkafa. Kavrama,, kafatası tabanı (interhemisferik fissür aşağıdaki) beyin ve kafatası arasında forcep bir kolunu dizilerek, dikkatli, açık kafatası maruz kaldığında yavaşça açık gözyaşı yukarı kafatası çekin.
- Forcep # 1 kullanarak beynin ventral tarafında küçük bağ dokusu bozabilir ve daha sonra aynı aracı kullanarak beyin kaldırmak. Beynin ventral tarafında altında yukarı doğru bir kuvvet kullanılarak kafatası dışına beyin kaldırın.
- Anatomik pozisyonda beyin tutun: sırt tarafında diseksiyon mikroskop altında korteks görselleştirmek için yukarı bakacak, orta beyinde ve korteks kesiştiği forseps ipuçlarını takarak yerine beyin sağlamak için; tamamen forcep # 4 ile kortikal meninksler kaldırmak, sonra ventral meninksler kaldırmak için devam edin. Zarları tamamen çıkarıldıktan sonra, forcep # 4 ile beyin kalan kısmından ayırmak korteks. Tamamen mikroglia saflık ve yiel üst düzeye çıkarmak için zarı doku kaldırmak için gereklidird.
3. Beyin Dokusu Kıyma
- Transferi Korteksler önce yemek kıyma hazırlanmış; Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril tekniği kullanarak adımı kıyma devam ediyor.
- Makas # 3 kullanılarak kıyma beyin dokusu, bir 15 ml konik tüp transfer kıyılmış doku,., Makas ve MM her 1 ml ile kıyma çanak durulayın toplamak ve kıyılmış doku içeren 15 ml konik tüp içine durulama dağıtmak Bu durulama adım maksimize edecek Tüm kalıntı doku konik tüpe aktarılır sağlayarak mikroglia verimi. Kıyılmış doku tüpün dibinde yerleşmek için izin, 1-2 dakika boyunca rahatsız doku süspansiyonu bırakın. MM gerekli besinleri içermez gibi 2 dk aşmayın.
- Dikkatlice çıkarın ve yerleşmiş kıyılmış doku bozmak için değil bazı yapım, standart bir pipet ile jenerik 1.000 ul mikropipetöre ile 2ml'si atın. Kıyılmış-dokuya MCM 3 ml ekleyin, standart bir pipet ile bir jenerik 1.000 ul micropipettor kullanarak tam güçle doku çiğnemek trituration tamamlandığında hiçbir discernable katı doku kalmalıdır.. Pipet ucu kalıntı toz haline numune alınması, aynı pipet ucu ile MCM bir 3 ml ilave edilir.
4. Büyüyen Kortikal Hücreler
- Santrifüj hücreleri (215 xg, 5 dk; RT; sallanan bir kova rotor ile klinik santrifüj) pelet için kıyılmış doku. Biyolojik güvenlik kabini için pelet hücreleri dönün, kaldırmak ve süpernatant atılır; yavaşça hücre pelet (; MCM 2 ml / tüp); tekrar süspansiyon önceden hazırlanmış T-75 balona hücre tabanda ekleyin; şişesi kapağı ve içine yatay olarak yerleştirin , nemlendirilmiş, standart bir doku kültürü kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO2). Hücreler, 24 saat boyunca inkübasyona izin verin.
- 24 saat sonra, yavaşça bozmaya avucunuzda karşı şişeyi dokunundoku enkaz. Öncesi ve enkaz tümüyle kaldırılmasını sağlamak için dokunarak sonra hücrelerin kontrol edin. Set Şişe dikey, kaldırma ve ortam atılır; şişenin dibine yeni MCM ekle (12 mi, 37 ° C), kapağı ve yatay olarak geri inkübatör içine yerleştirin.
- Kontaminasyon için günlük hücreleri kontrol ve büyümesini izlemek için.
- In vitro (DIV) içinde yaklaşık 17-21 gün, Mikroglial hücreleri karışık glial kültür hasat için hazır olacak. Hücreler hazır olup olmadığını belirlemek için, bir ters faz-kontrast mikroskop altında hücrelerini inceleyen. Mikroglia hasat için hazır olduğunuzda% 40 confluency ~ at. Başka glia üstünde bir tek tabaka olarak büyüyen küçük, parlak, küresel hücreler olarak görünür.
5. Karışık Glial Kültür gelen mikrogliya İzolasyonu
- Mikroglianın ayırmak için, kuvvetli bir laboratuvar tezgah karşı şişesi dokunun. Bu ajitasyon mikroglia düşük yapışma özellikleri nedeniyle diğer glial hücrelerden ayrı mikroglia yardımcı olur.
- Pellet mikroglia (215 x g,, 5 dak; kepçe rotor sallanan) süpernatantı steril bir konik santrifüj tüpüne mikroglia ihtiva eden ortam toplayın.
- ~ 2,% 0.6 v / vglucose, 1 mM L-glutamin, 100 ug / ml P / S,% 5 v / v FBS 1 mM sodyum piruvat:; sıcak Mikroglial Büyüme Ortamı (MGM olarak mikroglial pelletini ile takviye edilmiş MEM ml / şişe), bir hemositometre kullanılarak, hücre konsantrasyonunu saptamak ve plaka 1 x 10, 24 oyuklu bir plaka biçiminde 5 hücre / gözplastik veya (500 ul / kuyu; MGM) steril cam kapak fişleri., bu prosedürü kullanarak ortalama mikrogliya verimi 7.5 x 10 5 hücre / yavru korteks.
- 24-saat post-kaplama, yüzen hücreleri ve enkaz kaldırmak için taze MGM (37 ° C) ile medya ve tekrar çember yükleme hücreleri kaldırmak. Bu adım, hücrenin yaşamını ve sakin mikroglianın korumak için önemlidir. Hücreler hemen sonra refeeding deney için kullanılabilir.
6. Örnek Tedaviler
- Pam 3 CSK 4 (PAM) / ml, 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) ve araç kontrolü 10 ng hücreleri açığa, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 2 ya da 24 saat süreyle inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2).
7. İşlevsellik Ex vivo yoluyla Immunofluorescent Görüntüleme ve İmmünositokimya için mikrogliya Analizi
- Mikrofüj tüplerine (1.5 ml) ve centr tedavisi, hücre kültür ortamı hasat sonrasındamedyayı temizlemek için; ifuge bir masa mıkro (900 xg 2 dak) kullanarak. Temiz bir mikrofüj tüpüne süpernatant aktarın, tahlil derhal veya mağaza -20 ° C'de kullanmaya hazır olana kadar. Ticari olarak temin edilebilen, fare TNF-α ELISA kiti ile hücre kültür tortusu içinde TNF-α konsantrasyonu analiz edin.
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) hücreleri yıkayın ve% 4, hücreler (ağ / hac) paraformaldehit /% 4 (ağ / hac) sakroz / PBS pH 7.4 (% 4 PFA, 15 dakika, RT). Tespit sonra, yumuşak bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayarak 5 dakika boyunca PBS ile yıkama hücreleri.
- İmmünofloresan / İmmünositokimya. Sabitleme ve PBS immünsitokimya için, süreç mikroglianın yıkayın. Nazik sallayarak ile yürütülen tüm adımlar. PBS/0.1% triton X-100 hücreleri geçirgenleştirmek, bir saat boyunca PBS/10% normal keçi serumu içinde blok hücreler. Ya da bloke edici tampon içinde tavşan anti-Gözler-1 antikoru (1/750), tavşan anti-NF-KB antikoru (1/1, 250 p65 alt ünite) ile 4 ° C'de hücreler O / N inkübe edin. Görselantijen ize: floresan konjüge keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor (1 saat, 1/1, 000) ile, inkübasyonu takiben antikor kompleksi. PBS/0.1% Triton X-100 (3 x 5 dk) ile yıkanarak bağlanmamış ikinci antikor çıkarın.
- 4 ',6-diamidino-2-fenilindol / PBS (DAPI; 0.1 ug / mL) ile leke hücreleri. Hücre çekirdeği görselleştirmek için CX3CR1-GFP + / türetilmiş tüm mikroglia - farenin GFP ifade eder. DAPI görselleştirmek için bir 350 nm dalga boyu filtre kullanmak; GFP görselleştirmek için bir 488 nm dalga boyu filtre ve 594 nm dalga boyu filtre p65 ve İba-1 immünokompleksler görselleştirmek için.
- Dağı kapak sulu montaj solüsyonu ve floresan mikroskop kullanarak mikroglianın görselleştirmek kayıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Izolasyonu sırasında mikroglia ex vivo immunfenotipine ve işlevselliğini İstinat mikrogliyal biyoloji için bir soruşturma model olarak bu hücreleri kullanmak edebilmek için önemlidir. (- Ve C57BL / 6 CX3CR1-GFP + /) ve LPS veya Pam ya ile tedavi edilen kültürler, bu yöntem kullanılarak mikroglia immunofunctionality başarılı bir şekilde korunması göstermek amacıyla, P3 yenidoğanlardan kortikal mikroglia izole edilmiştir.
Şekil 1A'da gösterildiği gibi, döner bir çalkalama ile çalkalama yolu ile, normal mikroglia izolasyon in vivo koşullarda mikroglia atfedilen hareketsiz fenotipini korumaktadır. Mikroglial saflığı değerlendirmek için, CX3CR1-GFP + / - hücre kültürlerinin makrofaj antijen Gözler-1 ve hücre çekirdeği görselleştirmek için DAPI ile boyanmış sayacı için boyandı. Prese üzerinden düşük büyütme, mikroglia yalıtım altında, Şekil 1A ve 1B'de gösterildiği gibi,ntly hücrelerin% 95'den daha büyük olarak, yüksek ölçüde saf bir hücre kültüründe yöntem sonuçları tarif GFP, IBA-1 ve DAPI ko sergiler.
Önümüzdeki LPS hücreleri meydan okuyarak mikrogliya ex vivo yanıt onaylamak için çalıştı. Araç tedavisi ile karşılaştırıldığında, LPS ile muamele edilen CX3CR1-GFP + / -. Şekil 1B 'de gösterildiği gibi mikroglia bir amoeboid benzeri bir şekil için, küçük ve bipolar fenotipinde bir tam morfolojik değişiklik uyarlanmış Bu morfolojik değişiklik aynı zamanda izole edilmiş kortikal mikroglia değinmeyecek Pam ile tedavi C57BL / 6 yenidoğanlarda (Şekil 2). Farklı uyaranlar ile aktive genetik olarak farklı mikrogliyadan arasındaki bu korunmuş morfolojik tepki, çeşitli deneysel modeller açısından tekrarlanabilirliği ve mevcut protokol uygulanabilirliğini altını çiziyor.
Morfolojisinde bu değişiklik aktivasyon 39 göstergesidir rağmen, d için gerekli olanetermine mikroglia ile izole edilmiş ise döner fonksiyonel TLR aracılı hücre içi sinyal korunmasını gösteren, aktivasyon üzerine p65 yerini değiştirmek koruyabilenlerdir sallayarak. Bu sinyal akışını doğrulamak için, biz Pam ile C57BL / 6 yenidoğanlarda izole mikroglianın tedavi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, p65 için imüno lekeleme Pam bir 2 saat stimülasyondan sonra, p65 immünoreaktivitesi önemli ölçüde, esasen hücre çekirdeğine lokalizasyon kayar iken, normal koşullar altında, p65 diffüz, sitoplazma boyunca lokalize olur, işaret etmektedir.
Sunulan yöntemi ile izole mikroglia burada çekirdeğe transloke p65 için moleküler mekanizmaları korumak tespit ettikten sonra, bu gelecek izole mikroglia aktivasyon üzerine bir ayar damgası pro-enflamatuar sitokin, TNF-α, salgılama yetenekleri test edilerek biyokimyasal immunofunctionality korumak teyit etmek istediği . Şekil 3 de gösterildiği gibisırasıyla sinyal yollarının fonksiyonel TLR1 / 2 andTLR4 göstergesidir,, araçla tedavi edilen mikroglia karşılaştırma Pam veya LPS'ye maruz kalan hücreler, kültür ortamı (tek yönlü ANOVA p <0.0001) içine TNF-α salgılanmasını artırır.
Bu nedenle birlikte alındığında, bu veriler, ex vivo korunmuş immunfenotipik ve işlevselliği, son derece saf bir hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia bu izolasyon kurar.
.. P3 neonatal fare ve 24 saat için bir araç (A) ya da bakteriyel LPS'nin (B) ya da işlemden - Şekil 1, döner verimlerle korunmuş immunfenotipik yüksek saflıkta mikroglial kültür Mikroglial hücreleri çalkalama CX3CR1-GFP + / izole edilmiştir.Hücreler% 4 immunocytochemically IBA-1 için boyandı PFA, ve DAPI ile boyanmış sayacı ile tespit edildi. (A) PBS Mikroglia sergi bir bipolar, sakin fenotip ile işlemden geçirildi. (B) LPS üzerine, mikrogliya aktivasyon göstergesi bir amoeboid benzeri fenotip, uyum. 10X büyütme altında birleştirilmiştir panellerde kanal (A) ve (B) hücreler>% 95 GFP/Iba-1 pozitif hücreler olduğunu göstermektedir. 10X ölçek çubuğu: 100 mikron; 40X ölçek çubuğu: 20 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2.. Mikroglia yoluyla izole döner Pam cha üzerine çekirdeği hücre NF-KB'yi translocate sallayarakllenge. Mikroglial hücreleri P3 C57BL / 6 yenidoğanlarda izole edilmiş ve 2 saat için bir araç ya da Pam ile muamele edilmiştir. Hücreler% 4 PFA ile sabitlenmiş ve immunositokimya ile p65 için boyandı. Hücreler karşı hücre çekirdeği görselleştirmek için DAPI ile boyanmıştır. Pam ile stimülasyon p65 nükleer yer değiştirmesine neden olur, oysa araçla tedavi edilmiş mikroglia olarak, p65, sitoplazma boyunca lokalize olur. 40X ölçek çubuğu:. 20 mikron büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Pam veya LPS'ye maruz kalma üzerine döner çalkalama salma TNF-α izole Şekil 3.. Mikroglia. Mikroglial hücreleri P3 C57BL / 6 neonatal farelerden izole edilen ve vasıta ile tedavi edildi, Pam, ya da 2 saat boyunca LPS. Hücre kültürü süpernatanları TNF-α serbest bırakılması için ELISA ile toplandı ve analiz edildi. *** P <0.0001 (n = 2; tek yönlü ANOVA). Veri ± SD olarak sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu prosedür, neonatal farelerde kortikal mikroglia izolasyonu için etkili bir yöntem sunmaktadır. Bu prosedür, flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve ELISA ile tespit edildiği üzere, 1) koruyucu mikroglia immunfenotipik ve işlevsellik iki kat yararı vardır, ve 2) mikroglia önce diğer glial hücreleri (astrositler ve oligodentrocytes) varlığında, olgun izin glial kültür olgunlaşma döneminde önemli hücre-hücre etkileşimleri kolaylaştırabilir izolasyon. Önemlisi, izole hücreler korunmuş işlevsellik ve immünofenotipi ex vivo yüksek canlılığı ve bütünlüğü sergiledi.
Yüksek saflık ve verim ile mikrogliya başarılı izolasyonu için özel dikkat ve itina ile yapılması gereken birkaç adım vardır. Bu adımlar şunlardır: 1) tüm deneyler işlem boyunca steril, sağlıklı kültürünü koruyarak, 2) kor tüm meninks kaldıraraközel önem verilecektir Mikrodiseksiyon sırasında; korteks kıyma sonra plaka ve makas kıyma 3) doğru yıkama; 4) mikrodiseksiyon başlamadan önce inkübatör T-75 şişelerinde MCM değişikti; 5) 24 saat sonrası izolasyon refeeding.
Mikroglia CNS'nin yerleşik bağışıklık hücreleri olduğu için, çevresel hasarlar için son derece duyarlı. Bu nedenle, patojen maddeler ile kültür kirlenmenin önlenmesi hareketsiz mikroglial hücrelerinin immünofenotipik ve fonksiyonel özelliklerini korumak için çok önemlidir. Kontaminasyonu ve büyümesini izlemek için hücrelerin Günlük muayene tehlikeye hücre kültürleri kaçınarak ve mikrogliyal büyüme hızının daha iyi bir anlayış kazanmak için ayrılmaz bir parçasıdır. Dahası, hücre canlılığı ve işlevselliğini korumak için mikroglia MGM 24 saat sonrası kaplama yenilemek için gereklidir.
Mikroglianın izole üstesinden gelmek için büyük bir engel kıyılmış CNS doku endotel hücrelerinin serbest olmasını sağlamak için, hangimevcut olduğu takdirde, glial kültürlerde yoğun koloniler oluşturarak mikroglial çoğalmasını engelleyebilir. Bu nedenle, bu iyice beyin mikro-kesim sırasında CNS meninks çıkarmak için çok önemlidir. Doku daha gelişmiş ve diseksiyon mikroskop altında görselleştirmek için daha kolay olduğu gibi bizim deneyim, P3 yenidoğanların menenjlerde, P1 yenidoğanlarda daha büyük kolaylıkla kaldırılır. Ayrıca, kafatası beyin çıkardıktan sonra DM beyin dorsal tarafına ıslanmasını önlemek için önemlidir. Bu DM bunu aktarırken anatomik pozisyonda (dorsal yüzü yukarı) beyin tutarak yapılabilir. Beyin kuru dorsal yüzü tutulması daha iyi görselleştirme ve menenjlerin kolay çıkarılması için izin verir.
Biz meninksler kaldırmak için en etkili yolu interhemisferik fissür en arka kısmında kuvvet 4. eklemek için, ve yanal soyma menenjlerde kapalı, bulduk. Dorsal Meninksler temizlendikten sonra, biz o zaman remobeyin (ventral tarafı kadar) ters çevirerek ve hafifçe koku ampuller açgözlü ve arka beynin arka kısmına doğru soyulması ile ventral meninks ettik. Daha sonra hafifçe soyulması ve bir yanal hareket tweezing kalan herhangi ventral meningeal doku kaldırmak. Beynin geri kalanından korteks sonraki ayrılması sadece kortikal mikroglia izole edilmesi için çok önemlidir. Bunun yanı sıra, beyin korteksinin alt bölgelerinden mikroglia izole etmek için kullanılabilir ki, burada ayrıntılı olarak açıklanan prosedür de esnektir. Rağmen, hücre nedeniyle verim mikrogliya yoğunluğu kayıtsız cytoarchitectural beyin bölgelerinde 40 değişkenliği daha düşük olabilir dikkat etmek önemlidir.
Biz kıyma işleminde kullanılan malzemelerden durulama, ve toplamak için önemlidir mikroglia nihai verimini maksimize etmek bulduk. Bu durulama tam kıyma makas üzerinde kalmış olabilecek tüm kalıntı doku koleksiyonu, Petri ve pipet sağlamakucu konik tüp içine kıyılmış doku kana kullanılır. Bu durulama hücre canlılığı optimize etmek için, konik tüp kıyılmış CNS dokuyu hemen sonra yer alması önemlidir. Ayrıca, MM temel besin yoksun olduğu için, hücreler 2 dakikadan daha uzun bir süre MM kalmaz hücre canlılığı için kritiktir.
Son olarak, MCM ile T-75 şişeler hazırlamak ve nemlendirilmiş inkübatör koyun için çok önemlidir (37 ° C,% 5 CO 2) mikrodisseksiyon protokolü başlamadan önce. Thet-75 şişe karışık glial kültürlerin ilave edilmeden önce ortam dengelenmesini kolaylaştırmak, gaz alışverişine izin verir kendi kapak altında gözenekli bir kaplama vardır. Bunu yapmak için başarısızlık bir suboptimal mikrogliyal hasat sonuçları bulduk. Bu önce dönerken ve şişenin dışında gaz alışverişini en aza indirmek için, döner bir karıştırıcı üzerinde şişeyi yerleştirmek için Parafilm ile T-75 şişe kapağı kapatmak için de önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar araştırma ilgi potansiyel bir çatışma şeklinde olabilir herhangi bir ticari veya finansal ilişkilerin yokluğunda yapılmış olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma NIEHS R01ES014470 (KMZ) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
