Summary
En nøkkel til vellykket etterforskning av microglial biologi er bevaring av microglial immunofunction ex vivo under isolasjon fra CNS vev. Isolere mikroglia via roterende risting resultater i svært rene og immunofunctional cellekulturer som vurderes av fluorescerende bildebehandling, immunocytochemistry, og ELISA følgende microglia aktivering med proinflammatoriske stimuli lipopolysakkarid (LPS) og Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolering av mikroglia fra CNS vev er en kraftig undersøkende verktøy som brukes til å studere microglial biologi ex vivo. Den foreliggende fremgangsmåte detaljer av en fremgangsmåte for isolering av mikroglia fra neonatale murine cortices ved mekanisk omrøring med en rotasjonsrister. Dette microglia isolasjon metoden gir svært rene kortikale microglia som viser morfologiske og funksjonelle egenskaper som tyder på hvil mikroglia i normale, nonpathological forhold i vivo. Denne fremgangsmåten bevarer også den microglial immunfenotype og biokjemiske funksjoner som vist ved induksjon av morfologiske endringer, nukleær translokasjon av p65 subenhet av NF-κB (p65) og sekresjon av kjennemerket proinflammatorisk cytokin, tumor nekrose faktor-α (TNF-α ), på lipopolysakkarid (LPS) og Pam 3 CSK 4 (Pam) utfordringer. Derfor bevarer dagens isolasjon prosedyren immunophenotype av både stillestående og aktivigende microglia, som gir en eksperimentell metode for å undersøke microglia biologi i ex vivo forhold.
Introduction
Mikrogliale celler, makrofager overvåking av CNS-parenchyma, utgjør omtrent 12% av den totale cellepopulasjon av den voksne hjernen hos pattedyr. Microglia er utledet fra plommesekken myeloide forløper celler og varierer i celletetthet og morfologi i ulike cytoarchitectural regioner innenfor voksen CNS 1-5. I en frisk voksen hjerne, microglia er små, ramified eller polare celler med fine, dynamiske prosesser. I motsetning til perifer makrofag morfologi, mikroglia demonstrere en sovende, lavprofil fenotype hos friske hjerner som kan vises som cellular inaktivitet, men in vivo imaging studier viser at microglial prosesser dynamisk ut og inn for å overvåke deres mikromiljøet på en måte som minner om " prøvetaking og oppmåling "6,7.
Microglia er høyt og forskjellig lydhør for miljø-og patofysiologiske forandringer i hjernen, byttefra en surveillant til en effektor stats ofte regnet som deres hvile og aktiveres stater, henholdsvis. Denne bryter i aktiveringen kan være mediert ved inngrep av membran-bundet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs), for eksempel toll-lignende reseptorer (TLR), som reagerer på patogen-assosiert molekyl mønstre (PAMPs), nemlig bakterie-og virus-avledede lipoproteiner , nukleinsyrer, karbohydrater og 8-11. I tillegg til PAMPs, har PRRs også blitt vist å indusere microglial aktivering mot sterilt, ikke-patogeniske molekyler som kalles fare / skadeassosiert molekyl mønstre (demper), som representerer en forstyrrelse i sentralnervesystemet homeostase, slik som cellulær skade 12-16. Når engasjert, PRRs initiere en intracellulær signalering kaskade som resulterer i endringer i microglial cellemorfologi og genuttrykk, spesielt, aktiveres mikroglia tilpasse en amoeboid lignende fenotype, translocate den p65 NF-κB subenhet (p65) til cellekjernen, og oppregulere proDette skjer og sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, slik som tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1-β (IL-1β), sammen med reaktive oksygenarter (ROS) 16-24. Selv integrert i den medfødte immunrespons i CNS, har disse utskilte molekylene også blitt funnet å øke neuronal oksidativt stress, og dermed indusere og forverrer neurodegenerering i syke tilstander som Parkinsons og Alzheimers sykdom 25-29.
Imidlertid er mekanismene for microglial aktivering i patologiske tilstander er ikke helt forstått. Derfor, isolering av microglia er en kraftig undersøkende verktøy inn i disse biologiske prosesser, som mange i vivo funksjoner i microglial aktivering kan recapitulated i kultur. Flere metoder er tilgjengelige for å isolere mikroglia, inkludert isolasjon via en Percoll gradient etter enzymatisk fordøyelse av CNS vev 30,31. Imidlertid kan enzymatisk fordøyelse alterimmunfenotypen av cellene ved å redusere celle-overflate-antigen ekspresjon 32, og resulterer i lavere celleproduksjonen per dyr enn den metode som er beskrevet heri. Nærmere bestemt, rapporterer vi en gjennomsnittlig mikroglia avkastning per valp cortex av 7,5 x 10 5 celler, mens tidligere rapportert isolasjon metoder fra hele CNS via en Percoll gradient avkastning 3-5 x 10 5 celler 30,33,34. Den nåværende prosedyren omgår bruk av fordøyelsesenzymer ved å isolere mikroglia basert på deres lav-overholdelse egenskaper, og dermed bevare microglial immunfenotypen og funksjonalitet.
I den foreliggende studien, beskriver vi isolering av microglial celler fra blandede glial kulturer som stammer fra neonatal heterozygote CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), og C57BL / 6 murine ekser via mekanisk agitasjon på en roterende shaker, en forlengelse av tidligere publisert metode 24,35. Vi utnytter den tidligere mus belastning for enkel visualisering av microglia, somDisse mus uttrykker GFP under kontroll av den endogene Cx3Cr1 locus - en monocytt-spesifikk promoter 36-38. Denne metoden gir svært rene microglial kulturer med en bevart immunophenotype ex vivo som demonstrert av morfologiske endringer, kjernefysisk translokasjon av p65, og sekresjon av TNF-α når utfordret med bakteriell lipopolysakkarid (LPS) eller Pam 3 CSK 4, TLR4 og TLR1 / 2 agonister , henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før du starter denne protokollen, samle neonatal mus ved døgnene 1-3 (P1-3) i en steril beholder nestet med originale bur sengetøy for beskyttelse og varme. Det er viktig å jobbe raskt og effektivt gjennom denne protokollen for å optimalisere microglial yield. Vennligst se tabell 1 for fullstendig reagenslisten.
En. Utarbeidelse av instrumenter, Culture Media og retter
- Forbered 10 ml / pup Microglia Komplett Media (MCM, 1x Minimal Essential Medium Earles [MEM] supplert med: 1 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 0,6% v / v D-(+)-glukose, 100 mikrogram / ml Penicillin / streptomycin (P / S), 4% v / v Fetal Bovine Serum (FBS), 6% v / v Horse Serum), og legge til hver T-75 kolbe (en kolbe / valp), cap og sted horisontalt inn en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for å stabilisere i 1 time. det er nødvendig å stabilisere dette mediet i kolben (s) før disseksjon.
- Forberedelsere, alikvoter, og varme i 37 ° C vannbad MCM til disseksjon (6 ml / pup), og i en separat konisk rør MCM for celle-suspensjon (2 ml / pup). Forbered, delmengde, og chill på is Mincing Media (MM; HBSS supplert med: 100 mikrogram / ml P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / valp), og Dissecting Media (DM; MEM supplert med 100 mikrogram / ml P / S, 2 ml / pup).
- Steril følgende kirurgiske verktøy ved neddykking i 70% etanol i 10 min: saks # 1 (1; å halshogge), forcep # 1 (2, for å sikre nese og fjerne ekser), sakse # 2 (1; nonangled; å åpne hodebunnen ), forcep # 2 (1; å fjerne hodebunnen), forcep # 3 (1; å fjerne skallen), forcep # 4 (2; å fjerne hjernehinnene), sakse # 3 (1; å hakke hjernevev). La det lufttørke på et sterilt pad.
- Tørk den horisontale luftgjennomstrømning arbeidsstasjon og disseksjon mikroskop med 70% etanol.
- Tilsett DM inn to sterile, 100 mm petriskåler for å fange hodet (3 ml, en tallerken / 3 unger) og disseksjon (1 ml;En tallerken / valp; kjølt på is før disseksjon). Tilsett MM inn i en steril, 100 mm petriskål for hakking hjernevev (1 ml, en tallerken / valp).
2. Hjernevev Dissection
- Før dødshjelp, forsiktig rense halsen og hodet av valp med 70% etanol ved hjelp av en lab vev. Med sakse # 1, raskt avlive valpen ved å fjerne hodet, fangst hodet i tidligere utarbeidet petriskål. Avlive og fullføre disseksjon av en valp før du går videre til neste dyr.
- Overfør hodet til kjølt disseksjon fatet, etter disseksjon mikroskop sikre hodet ved å knipe nesen ved hjelp forcep # 1 (alternativt kan hodet være sikret ved piercing pinsett gjennom øyehulen), åpen hodebunnen ved hjelp av sakse # 2 ved å opprette en Y-cut: begynne fra bunnen av hodet og i en vinkel mot øynene. Bruk forcep # 3 for å forsiktig fjerne hodebunnen ved å trekke sideveis, utsette skallen.
- Bruke forcep # 3, forsiktig fjerne bindevev ved foten avhode. Når bunnen av skallen er utsatt, forsiktig åpne skallen ved å tre en arm av forcep i mellom hjernen og kraniet (etter interhemispheric sprekken), grep, dra forsiktig i skallen oppover for å rive åpen.
- Forstyrre bindevevet under ventral side av hjernen ved hjelp forcep # 1, og deretter fjerne hjernen ved hjelp av samme verktøy. Løft hjernen av skallen ved hjelp av en oppadrettet kraft i henhold til den ventrale side av hjernen.
- Hold hjernen i sin anatomisk stilling: ryggsiden opp for å visualisere cortex under disseksjon mikroskop; sikre hjernen på plass ved å sette tuppen av tang i skjæringspunktet mellom midthjernen og hjernebarken; fjerne kortikale hjernehinnene med forcep # 4, deretter fortsette å fjerne ventral hjernehinnene. Når hjernehinnene har blitt fullstendig fjernet, skille kortekser fra resten av hjernen ved hjelp av forcep nr. 4. Det er viktig å fjerne hinne-vev for å maksimere microglia renhet og yield..
Tre. Hjernevev Mincing
- Overfør cortex til tidligere utarbeidet hakking fatet, fortsetter å hakking trinn ved hjelp av steril teknikk i klasse II biologisk sikkerhetskabinett.
- Kjøttdeig hjernevev bruker sakse # 3; overføring hakket vev til en 15 ml konisk tube;. Skyll saks og hakking parabolen med en ml MM hver, samle og dispensere skyller inn i 15 ml konisk rør som inneholder kjøttdeig vev Denne skylling trinnet vil maksimere utbyttet av microglia ved å sikre at alle rester av vev er overført til konisk tube. La vevsuspensjon uforstyrret i 1-2 min, slik at hakket vev å bosette på bunnen av røret. Ikke overskrid 2 min som MM ikke inneholder essensielle næringsstoffer.
- Fjern forsiktig og kast 2 ml av supernatanten med generisk 1000 mL mikropipette med en standard pipette spissen, gjør sikkert ikke å forstyrre den avgjort hakket-vev. Tilsett 3 ml MCM til kjøttdeig-vev; Triturer vev med full kraft ved hjelp av en generisk 1000 mL mikropipette med en standard pipette tips Ingen merkbar solid vev bør forbli når trituration er fullført.. Legg til ytterligere 3 ml MCM med samme pipettespissen, samle rest gnidd prøve fra pipettespissen.
4. Økende Kortikale Cells
- Sentrifuger hakket vev til pellets celler (215 XG, 5 min, RT, klinisk sentrifuge med svingende bøtte rotor). Returner pelleterte celler til den biologiske sikkerhetskabinett, fjern og kast supernatanten; forsiktig cellepelleten suspenderes (2 ml / rør; MCM), legg cellen resuspensjon til tidligere utarbeidet T-75 kolbe; cap flaska og plasser den horisontalt inn en fuktet, standard vevkultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Tillate cellene og inkuberes i 24 timer.
- Etter 24 timer, banke forsiktig på kolbe mot håndflaten for å forstyrrevev rusk. Sjekk cellene før og etter tapping for å sikre fullstendig fjerning av rusk. Set kolbe vertikal, fjernes og kastes materiale, tilsett friskt MCM til bunnen av kolben (12 ml, 37 ° C); lokket og plassere tilbake i inkubatoren, horisontalt.
- Kontroller celler daglig for forurensning og for å overvåke vekst.
- Ved ca 17-21 dager in vitro (DIV), vil microglial celler være klar for høsting fra den blandede glial kultur. For å finne ut om cellene er klar, undersøke cellene under en omvendt fase-kontrast mikroskop. Microglia er klare for innhøsting når på ~ 40% confluency. De vises som små, lyse, kuleformede celler, vokser som en monolayer oppå annet gliaceller.
5. Isolering av Microglia fra Mixed Glial Kultur
- For å isolere microglia, kraftig trykk kolbe mot laboratoriebenken. Denne agitasjon hjelper separate mikroglia fra andre gliacellene grunn av lav-adheranse egenskaper microglia.
- Samle supernatanten materiale innehold mikroglia i en steril konisk sentrifugerør, pellet mikroglia (215 xg 5 min,; svingende bucket rotor).
- Resuspender microglial pellet i varm microglial Growth Medium (MGM; MEM supplert med 1 mM natrium-pyruvat, 0,6% v / vglucose, 1 mM L-glutamin, 100 ug / ml P / S, 5% v / v FBS; ~ 2 ml / kolbe), bestemme cellekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer, og platen 1 x 10 5 celler / brønn i en 24-brønn plate-format påplast eller sterile glass dekkglass (500 mL / vel, MGM). Ved hjelp av denne prosedyren gjennomsnittlig microglia avkastning er 7,5 x 10 5 celler / valp cortex.
- 24-timers post-plating, fjerne alt av media og refeed celler med friske MGM (37 ° C) for å fjerne flytende celler og rusk. Dette trinnet er kritisk til celle overlevelse og for å opprettholde hvil microglia. Cellene kan anvendes for eksperimentering umiddelbart etter refeeding.
6. Eksempel Behandlinger
- Eksponere cellene til 10 ng / ml av Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml lipopolysakkarid (LPS) eller kjøretøykontroll, inkuber i 2 eller 24 timer i fuktet inkubator (37 ° C, 5% CO2).
7. Analysere Microglia for funksjonalitet Ex vivo via Immunofluorescent Imaging and Immunocytochemistry
- Etter behandling, innhøsting cellekulturmedia i mikrofugerør (1,5 ml) og centrifuge med en tabletop mikrosentrifuge (2 min, 900 xg) for å fjerne medier. Overfør supernatanten til et rent micro rør; analysen umiddelbart, eller oppbevar ved -20 ° C til den er klar til bruk. Analyser TNF-α-konsentrasjon i cellekultur supernatant via kommersielt tilgjengelig mus TNF-α ELISA kit.
- Vask cellene med fosfatbufret saltvann (PBS), og løse-celler med 4% (w / v) paraformaldehyd / 4% (w / v) sukrose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min, RT). Etter fiksering vaskes cellene med PBS i 5 min med forsiktig rysting på en orbital shaker.
- Immunfluorescens / Immunocytochemistry. Etter fiksering og PBS vask, prosess mikroglia for immunocytochemistry. Alle trinn utført med forsiktig risting. Permeabilize celler i PBS/0.1% triton X-100; blokkere celler i PBS/10% normalt geiteserum i en time. Inkuber cellene O / N ved 4 ° C med kanin-anti-NF-κB antistoff (p65 subenheten, 1/1, 250) eller kanin anti-Iba-1-antistoff (1/750) i blokkerende buffer. Visualize antigen: antistoff-komplekset etter inkubasjon med fluorescensmerket konjugert geite-anti-kanin-IgG sekundært antistoff (1 t, 1/1, 000). Fjern ubundet sekundært antistoff ved vasking med PBS/0.1% triton X-100 (3 x 5 min).
- Counter flekk celler med 4 ',6-diamidino-2-phenylindole / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). For å visualisere cellekjernen Alle microglia avledet fra CX3CR1-GFP + / - mus uttrykker GFP. Bruk en 350 nm bølgelengde filter for å visualisere DAPI, en 488 nm bølgelengde filter for å visualisere GFP, og en 594 nm bølgelengde filter for å visualisere p65 og Iba-en immunocomplexes.
- Mount dekselet glipper bruker vandig monteringsløsning og visualisere mikroglia bruker fluoriserende mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beholde immunophenotype og funksjonalitet av mikroglia ex vivo under isolasjon er avgjørende for å kunne utnytte disse cellene som en utredningsmodell for microglial biologi. For å vise den vellykkede bevaring av microglia immunofunctionality ved hjelp av den foreliggende fremgangsmåte, har vi isolert kortikale mikroglia fra P3 nyfødte (CX3CR1-GFP + / - og C57BL / 6) og behandlede kulturer med enten LPS eller Pam.
Som vist i figur 1A, isolering av mikroglia via omrøring ved roterende rysting bevarer hvile fenotype tilskrives mikroglia i normale in vivo-betingelser. For å vurdere microglial renhet, CX3CR1-GFP + / - ble cellekulturer farget for makrofag antigen Iba-en og teller farget med DAPI for å visualisere cellekjernen. Som vist på figurene 1A og 1B, under liten forstørrelse, microglia isolert via presently beskrevne metoden resulterer i en svært ren cellekultur, som er større enn 95% av cellene oppviser colocalization av GFP, Iba-1, og DAPI.
Vi neste søkt å bekrefte responsen mikroglia ex vivo ved å utfordre celler med LPS. I forhold til kjøretøyets behandling, LPS-behandlede CX3CR1-GFP + / -. Microglia tilpasset en sterk morfologisk endring fra en liten, bipolar fenotype til en amoeboid-lignende form, slik som vist i figur 1B Denne morfologisk endring er også rekapitulert i kortikale microglia isolerte fra C57BL / 6 nyfødte behandlet med Pam (figur 2). Dette konservert morfologisk respons mellom genetisk distinkt microglia, aktiveres med ulike stimuli, understreker reproduserbarhet og anvendelsen av denne protokoll i forhold til ulike eksperimentelle modeller.
Selv om denne forandring i morfologien er indikativ for aktivering 39, er det nødvendig å determine hvis mikroglia isolert av roterende risting beholde sin evne til å translocate p65 ved aktivering, noe som indikerer bevaring av funksjonelle TLR-mediert intracellulær signalering. For å bekrefte dette signalering kaskade, behandlet vi mikroglia isolert fra C57BL / 6 nyfødte med Pam. Som illustrert i figur 2, immunocytochemical farging for p65 dokumentert at, under normale betingelser, er p65 diffust lokalisert over hele cytoplasmaet, mens etter en 2-timers stimulering med Pam, p65 immunoreaktivitet dramatisk forskjøvet lokalisering til cellekjernen.
Etter å ha fastslått at microglia isolert via metoden som presenteres her bevare de molekylære mekanismer for å translocate p65 til kjernen, vi neste ønsket å bekrefte at isolerte mikroglia beholde sin biokjemiske immunofunctionality ved å teste deres evne til å skille ut et kjennetegn proinflammatoriske cytokiner, TNF-α, ved aktivering . Som vist i figur 3, iforhold til vehicle-behandlede mikroglia, celler eksponert for Pam eller LPS øke sekresjonen av TNF-α i kulturmedier (P <0,0001, en-veis ANOVA), en indikasjon på funksjonelle TLR1 / 2 andTLR4 signalveier, henholdsvis.
Derfor tas sammen, disse dataene fastslå at isolering av mikroglia via roterende risting resultater i svært rene cellekulturer med bevart immunophenotype og funksjonalitet, ex vivo.
.. Figur 1. Roterende risting utbytter med høy renhet microglial kulturer med bevart immunophenotype mikrogliale celler ble isolert fra CX3CR1-GFP + / - neonatale mus ved P3 og behandlet med enten kjøretøy (A), eller bakteriell LPS (B) i 24 timer.Celler ble løst med 4% PFA, immunocytochemically farget for Iba-en, og teller farget med DAPI. (A) Microglia behandlet med PBS utviser en bipolar, quiescent fenotype. (B) Ved LPS utfordring, mikroglia tilpasse en amoeboid lignende fenotype, en indikasjon på aktivering. Sammenslåtte kanal i panelene (A) og (B) i henhold til 10X forstørrelse viser at> 95% av cellene er GFP/Iba-1 positive celler. 10X skala bar: 100 mikrometer; 40X skala bar: 20 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Microglia isolert via roterende risting translocate NF-κB til cellekjernen når Pam challenge. mikrogliale celler ble isolert fra C57BL / 6 nyfødte ved P3 og behandlet med bærer eller Pam i 2 timer. Celler ble løst med 4% PFA og farget for p65 via immunocytochemistry. Celler ble farget med DAPI telleren for å visualisere cellekjernen. I bilen behandlet mikroglia, er p65 lokalisert i hele cytoplasma, mens stimulering med Pam induserer den kjernefysiske translokasjon av p65. 40X skala bar:. 20 mikrometer Klikk her for å se større bilde.
Fig. 3. Microglia isolert med roterende riste frigjøring TNF-α ved eksponering for Pam-eller LPS. Mikrogliale celler ble isolert fra C57BL / 6 mus ved neonatal P3 og behandlet med kjøretøyet, Pam eller LPS i 2 timer. Cellekultur-supernatanter ble samlet og analysert via ELISA for TNF-α frigjøring. *** P <0,0001 (n = 2, en-veis ANOVA). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende fremgangsmåte gir en effektiv metode for isolering av kortikale microglia fra nyfødte mus. Denne prosedyren har en to-fold fordel for en) bevare mikroglia immunophenotype og funksjonalitet, som bestemmes av fluorescerende bildebehandling, immunocytochemistry, og ELISA, og, 2) slik at mikroglia å modne i nærvær av andre gliacellene (astrocytes og oligodentrocytes) før isolering, noe som kan forenkle viktige celle-celle-vekselvirkninger under glial kultur modningsperiode. Viktigere, isolerte celler utstilt høy levedyktighet og ensartethet med bevart funksjonalitet og immunophenotype ex vivo.
Det er flere trinn som må utføres med spesiell oppmerksomhet og flid for vellykket isolering av microglia med høyest renhet og utbytte. Disse trinn er: 1) å opprettholde en steril, sunn kultur under hele prosedyren eksperimentering, 2) å fjerne alle meninges fra det tilsvarkartlegge praksisen under microdissection; 3) skikkelig vask av hakking plate og saks etter hakking ekser, 4) equilibrating MCM i T-75 kolber i kuvøse før du begynner microdissection; 5) refeeding 24 timers post-isolasjon.
Siden mikroglia er bosatt immunceller i sentralnervesystemet, er de svært lydhør overfor miljø fornærmelser. Derfor, for å unngå forurensning kultur med sykdomsfremkallende stoffer er avgjørende for å bevare de immunophenotypic og funksjonelle egenskaper av hvil microglial celler. Daglig inspeksjon av celler for å overvåke forurensning og vekst er integrert til å unngå kompromitterte cellekulturer og å få en bedre forståelse av microglial vekst-rate. Videre er det nødvendig å oppdatere MGM 24-timers etterplettering av mikroglia for å opprettholde cellenes levedyktighet og funksjon.
Et stort hinder for å overvinne i å isolere mikroglia er å sikre at den hakket CNS vev er fri for endotelceller, som,hvis de finnes, kan hindre microglial spredning ved å danne tette kolonier i gliacellene kulturer. Av denne grunn er det viktig å grundig fjerne CNS hjernehinnene under microdissection av hjernen. I vår erfaring, er hjernehinnene av P3 nyfødte fjernes med større letthet enn P1 nyfødte, som vevet er mer utviklet og lettere å visualisere under disseksjon mikroskop. I tillegg er det viktig å unngå å fukte den dorsale side av hjernen med DM etter fjerning av hjernen fra skallen. Dette kan gjøres ved å holde hjernen i anatomisk posisjon (ryggsiden opp) ved overføring av den til DM. Å holde den dorsale side av hjernen tørr åpner for bedre visualisering og enklere fjerning av hjernehinnene.
Vi har funnet at den mest effektive måte å fjerne hjernehinnene, er å sette inn den kraft som nr. 4 i den bakre delen av interhemispheric sprekken, og hjernehinnene skallet av, lateralt. Når rygghjernehinnene har blitt ryddet, vi deretter remove de ventral hjernehinnene ved å snu hjernen (ventral-siden opp), og forsiktig fatte olfactory pærer og peeling tilbake mot den bakre delen av hjernen. Vi fjern eventuelt gjenværende ventral meningeal vev ved forsiktig peeling og tweezing i en lateral bevegelse. Etterfølgende separasjon av hjernebarken fra resten av hjernen som er avgjørende for å isolere bare kortikale microglia. Fremgangsmåten beskrevet heri er også fleksibel ved at den kan brukes til å isolere microglia fra subkortikale regioner, også. Skjønt, er det viktig å merke seg at celle Avkastningen kan være lavere på grunn av variasjon av microglia tetthet likegyldig cytoarchitectural hjerneregioner 40.
Vi har funnet at for å maksimere det endelige utbyttet av mikroglia er det viktig å skylle og samle skylling av de materialer som anvendes ved hakking prosessen. Disse skyller sikre den komplette samlingen av all gjenværende vev som kan ha ligget på hakke saks, petriskål, og pipettenspissen brukes til å alikvot kvernet vev inn i det koniske rør. Det er viktig at disse skyllinger finner sted umiddelbart etter overføring av hakket CNS vev til det koniske rør, for å optimalisere cellelevedyktighet. Det er også kritisk til celle levedyktighet at cellene ikke bo i MM lenger enn to minutter siden MM er blottet for viktige næringsstoffer.
Til slutt, er det viktig å forberede T-75 flasker med MCM og plassere dem i fuktet inkubator (37 ° C, 5% CO 2) før du starter microdissection protokollen. TheT-75 kolbe har en porøs fôr under sin cap som gir mulighet for utveksling av gasser, tilrettelegging media stabilisering før tillegg av blandede glial kulturer. Vi har funnet ut at unnlatelse av å gjøre dette resulterer i en suboptimal microglial innhøsting. Det er også viktig å forsegle T-75 kolbe kappe med Parafilm før anbringelse av kolben på rotasjonsrister for å minimalisere gassutveksling i og ut av kolben mens den roterer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at forskningen ble gjennomført i fravær av noen kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
