Summary
Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
El aislamiento de microglia de tejido del SNC es una poderosa herramienta de investigación utilizada para estudiar la biología microglial ex vivo. El presente método detalla un procedimiento para el aislamiento de la microglía de las cortezas murinos neonatales por agitación mecánica con un agitador rotatorio. Este aislamiento microglia método rendimientos microglia corticales altamente puros que exhiben características morfológicas y funcionales indicativos de la microglia en reposo en condiciones normales, no patológicas in vivo. Este procedimiento también preserva el inmunofenotipo de la microglia y la funcionalidad bioquímica como se demuestra por la inducción de cambios morfológicos, la translocación nuclear de la subunidad p65 de NF-kappa B (p65), y la secreción de la citoquina proinflamatoria sello, factor de necrosis tumoral-α (TNF-α ), al lipopolisacárido (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam) desafíos. Por lo tanto, el presente procedimiento de aislamiento conserva el inmunofenotipo de tanto reposo y Actimicroglia vada, proporcionando un método experimental de la investigación de la biología de la microglía en condiciones ex vivo.
Introduction
Las células microgliales, los macrófagos de vigilancia de la parénquima del SNC, comprenden aproximadamente el 12% de la población total de células del cerebro de los mamíferos adultos. La microglía se derivan de saco vitelino mieloides precursoras células y varían en densidad celular y la morfología en diferentes regiones cytoarchitectural en el SNC adulto 1-5. En un cerebro adulto sano, la microglia son células pequeñas, ramificadas o polares, con procesos dinámicos finos. En contraste con la morfología de los macrófagos periféricos, microglia demuestran un reposo, de bajo perfil fenotipo en cerebros sanos que pueden aparecer como la inactividad celular, sin embargo, en los estudios de imagen in vivo demuestran que los procesos microgliales se extienden de forma dinámica y se retraen para monitorear su microambiente de una manera que recuerda a " muestreo y de estudio "6,7.
La microglía son altamente y diferencialmente sensibles a alteraciones ambientales y fisiopatológicos en el cerebro, de conmutacióndesde un surveillant a un estados considerados como su reposo y activadas comúnmente estatales efectoras, respectivamente. Este interruptor de activación puede estar mediada por la participación de los receptores de membrana de reconocimiento de patrones (PRRS), como los receptores tipo Toll (TLR), que responden a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), lipoproteínas de saber bacterianas-y derivados-viral , ácidos nucleicos, hidratos de carbono y 8-11. Además de PAMP, parentales también se han mostrado para inducir la activación microglial contra moléculas estériles, no patógenas conocidas como patrones moleculares peligro / daño-asociado (apaga), que representan una perturbación en la homeostasis del SNC, tales como daño celular 12-16. Una vez enganchado, PRRS inician una cascada de señalización intracelular que resulta en cambios en la morfología celular microglial y la expresión génica; específicamente, microglia activada adaptar un fenotipo-ameboide como, translocate la p65 de NF-kappa B subunidad (p65) para el núcleo de la célula, y la upregulate producción y la secreción de citocinas proinflamatorias, tales como factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), la interleucina-1 β (IL-1β), junto con especies de oxígeno reactivas (ROS) 16-24. Aunque integral en la respuesta inmune innata del sistema nervioso central, también se han encontrado estas moléculas secretadas para aumentar el estrés oxidativo neuronal, induciendo de ese modo y exacerbando la neurodegeneración en estados de enfermedad tales como Parkinson y la enfermedad de Alzheimer 25-29.
Sin embargo, los mecanismos de activación microglial en estados patológicos no se entienden completamente. Por lo tanto, el aislamiento de microglia es una poderosa herramienta de investigación en estos procesos biológicos, como muchos en funciones in vivo de la activación microglial puede ser recapitulado en la cultura. Varios métodos están disponibles para el aislamiento de la microglía, incluyendo el aislamiento a través de un gradiente de Percoll después de la digestión enzimática de tejido del SNC 30,31. Sin embargo, la digestión enzimática puede alterarel inmunofenotipo de las células mediante la reducción de la superficie celular la expresión del antígeno 32, y los resultados en el rendimiento de células por animal inferior que el método descrito en el presente documento. En concreto, se presenta un rendimiento promedio microglia por corteza cachorro de 7,5 x 10 5 células, mientras que los métodos de aislamiento de todo el SNC ya se ha informado a través de un rendimiento gradiente de Percoll 3-5 x 10 5 células 30,33,34. El presente procedimiento evita el uso de enzimas de digestión mediante el aislamiento de la microglia en base a sus propiedades de baja adherencia, preservando así el inmunofenotipo y la funcionalidad de la microglia.
En el presente estudio, se describe el aislamiento de las células microgliales de mezcla de culturas gliales derivadas de heterocigotos CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) neonatales, y C57BL / 6 corticales murinas mediante agitación mecánica en un agitador rotatorio, una extensión de anterioridad publicado 24,35 método. Utilizamos la antigua cepa de ratón para facilitar la visualización de la microglia, comoestos ratones expresan GFP bajo el control del locus endógeno CX3CR1 - un promotor específico de los monocitos 36-38. Este método produce microglial culturas altamente puro con un inmunofenotipo conservados ex vivo como se demuestra por cambios morfológicos, la translocación nuclear de p65, y la secreción de TNF-α cuando son desafiados con lipopolisacárido bacteriano (LPS) o Pam 3 CSK 4, TLR4 y TLR1 / 2 agonistas , respectivamente.
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Protocol
Antes de iniciar este protocolo, recoger ratones recién nacidos en los días postnatales 1-3 (P1-3) en un recipiente estéril anidado con ropa de cama caja original para protegerlo y abrigarlo. Es importante trabajar de manera rápida y eficiente a través de este protocolo para optimizar el rendimiento de la microglia. Por favor consulte la Tabla 1 para la lista completa de reactivos.
1. Elaboración de instrumentos, medios de cultivo, y platos
- Preparar 10 ml / cachorro microglía completo Media (MCM; 1x Esencial Mínimo de Medio Earle [MEM] suplementado con: 1 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 0,6% v / v de D-(+)-glucosa, 100 g / ml La penicilina / estreptomicina (P / S), 4% v / v de suero bovino fetal (FBS), 6% v / v de suero de caballo), y añadir a cada matraz T-75 (1 matraz / PUP); tapa y horizontalmente en lugar una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) equilibrar durante 1 hora. Es esencial para equilibrar este medio en un matraz (s) antes de comenzar la disección.
- PrepaRe, alícuota, y caliente en 37 ° C MCM baño de agua para la disección (6 ml / PUP) y en un tubo cónico de MCM separada para la resuspensión celular (2 ml / PUP). Preparar, alícuota, y enfriar en hielo Picado de medios (MM; HBSS suplementado con: 100 mg / ml P / S, 0,01 M HEPES; 3 ml / cría), y disección de medio (DM; MEM suplementado con 100 mg / ml P / S, 2 ml / perrito).
- Esterilizar las siguientes herramientas quirúrgicas por inmersión en etanol al 70% durante 10 min: tijera # 1 (1; decapitar), fórceps # 1 (2, para asegurar la nariz y eliminar las cortezas), tijera # 2 (1; nonangled; para abrir el cuero cabelludo ), fórceps # 2 (1; para quitar el cuero cabelludo), fórceps # 3 (1; para eliminar cráneo), fórceps # 4 (2; para eliminar meninges), tijera # 3 (1; pelos en el tejido cerebral). Deje secar al aire en una gasa estéril.
- Limpie la estación de trabajo y la disección microscopio horizontal con flujo de aire con 70% de etanol.
- Dispense DM en 2, 100 mm placas de Petri estériles para la captura de la cabeza (3 ml; 1 plato / 3 cachorros) y la disección (1 ml;1 plato / crías; enfriada en hielo antes de la disección). Dispense MM en 1 estéril, 100 mm placa de Petri para picar el tejido cerebral (1 ml, 1 plato / perrito).
2. Tejido Cerebral Disección
- Antes de la eutanasia, desinfectar suavemente el cuello y la cabeza del cachorro con etanol al 70%, utilizando un pañuelo de papel de laboratorio. Con tijera # 1, la eutanasia rápidamente mediante la eliminación de las crías de la cabeza, la cabeza de captura en placa de Petri previamente preparado. La eutanasia y completar la disección de una cría antes de proceder a la siguiente animal.
- Transfiera la cabeza al plato disección fría; bajo el microscopio de disección asegurar la cabeza apretando la nariz usando fórceps # 1 (como alternativa, la cabeza puede ser asegurada por la perforación de las pinzas a través de la cuenca del ojo); cuero cabelludo abierto utilizando tijeras # 2 por la creación de un Y-cut: comenzar desde la base de la cabeza y en un ángulo hacia los ojos. Utilice fórceps # 3 para eliminar suavemente el cuero cabelludo, quitando lateralmente, exponiendo el cráneo.
- El uso de fórceps # 3, remover suavemente el tejido conectivo en la base decabeza. Cuando la base del cráneo está expuesto el cráneo, abra cuidadosamente enroscando un brazo de pinza entre el cerebro y el cráneo (siguiendo la cisura interhemisférica); agarre, tire suavemente el cráneo hacia arriba para rasgar.
- Interrumpir el tejido conectivo debajo de la parte ventral de cerebro usando fórceps # 1, y posteriormente eliminar el cerebro utilizando la misma herramienta. Levantar el cerebro fuera del cráneo mediante el uso de una fuerza hacia arriba bajo la parte ventral del cerebro.
- Mantener el cerebro en su posición anatómica: frente lado dorsal hacia arriba para visualizar las cortezas bajo el microscopio de disección; asegurar el cerebro en su lugar mediante la inserción de puntas de pinzas en la intersección del cerebro medio y la corteza; eliminar completamente las meninges corticales con fórceps # 4, a continuación, proceder a retirar las meninges ventral. Una vez que las meninges se han separado completamente, separe las cortezas de la parte restante del cerebro utilizando fórceps # 4. Es esencial para eliminar por completo el tejido meníngeo para maximizar la pureza microglia y yield.
3. Tejido Cerebral Picado
- Cortezas de transferencia para preparar previamente picado plato; seguir picando paso utilizando una técnica estéril en la categoría II del Gabinete de Seguridad Biológica.
- Pique tejido cerebral usando tijera # 3, la transferencia de tejido picado a un tubo cónico de 15 ml;. Enjuague tijeras y picado plato con 1 ml de mM de cada uno, recoger y dispensar enjuagues en el tubo cónico de 15 ml que contiene el tejido picado Este paso de enjuague maximizará el rendimiento de la microglia, asegurando que todo el tejido residual se transfiere al tubo cónico. Deja suspensión de tejido en reposo durante 1-2 min, permitiendo tejido picado se asiente en el fondo del tubo. No exceda de 2 min como MM no contiene nutrientes esenciales.
- Retire con cuidado y deseche 2 ml de sobrenadante con micropipeta genérica 1.000 l con una punta de pipeta estándar, asegurándose de no perturbar el tejido picado resuelto. Añadir 3 ml de MCM a la-tejido picado; se tritura el tejido con toda su fuerza usando un 1,000 l genérico micropipeta con una punta de pipeta estándar No se discernible tejido sólido debe permanecer cuando la trituración es completa.. Agregar otro 3 ml de MCM con la misma punta de la pipeta, la recogida de la muestra se tritura residual de la punta de la pipeta.
4. El cultivo de células corticales
- Se centrifuga el tejido picado para que sedimenten las células (215 xg, 5 min; RT; centrífuga clínica con rotor basculante). Volver células sedimentadas a la cabina de seguridad biológica, retirar y desechar el sobrenadante, resuspender suavemente el sedimento celular (2 ml / tubo; MCM), añadir la resuspensión celular a la T-75 frasco previamente preparado; tapar el frasco y colocarla horizontalmente en un humidificado, incubadora de cultivo de tejidos estándar (37 ° C, 5% de CO 2). Permitir que las células se incuban durante 24 horas.
- Después de 24 horas, toque suavemente frasco contra la palma de la mano para interrumpirrestos de tejido. Compruebe las células antes y después de tocar a asegurar la completa eliminación de los desechos. Frasco Set vertical; retirar y eliminar los medios de comunicación; añadir MCM fresco al fondo del frasco (12 ml; 37 ° C); tapa y colóquelo de nuevo en la incubadora, horizontalmente.
- Compruebe células diaria de contaminación y para monitorear el crecimiento.
- En aproximadamente 17 a 21 días in vitro (DIV), las células microgliales estarán listos para la cosecha del cultivo glial mixto. Para determinar si las células están listas, examinar las células bajo un microscopio de contraste de fase invertida. Microglia están listos para la cosecha, cuando en ~ 40% de confluencia. Aparecen como células pequeñas, brillante, esféricas, creciendo como una monocapa sobre otro glia.
5. El aislamiento de microglia de glial mixto Cultura
- Para aislar la microglía, toque vigorosamente frasco contra la mesa de laboratorio. Esta agitación ayuda a microglia separadas de otras células gliales debido a las propiedades de baja adherencia de la microglia.
- Recoger medio sobrenadante que contienen microglia en un tubo de centrífuga cónico estéril; microglia pellets (215 xg, 5 min; rotor con cubeta oscilante).
- Resuspender el precipitado de la microglia en caliente Microglial Medio de Crecimiento (MGM; MEM suplementado con: 1 mM piruvato de sodio, 0,6% v / vglucose, 1 mM de L-glutamina, 100 mg / ml de P / S, 5% v / v de FBS; ~ 2 ml / matraz), determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro, y la placa de 1 x 10 5 células / pocillo en un formato de placa de 24 pocillos enplástico o resbalones estériles cubierta de vidrio (500 l / pocillo; MGM). Mediante este procedimiento el rendimiento promedio microglia es cortex 7,5 x 10 5 células / cachorro.
- 24 horas después de la galvanoplastia, quite todos los medios de comunicación y las células de realimentación con MGM fresco (37 º C) para eliminar las células flotantes y escombros. Este paso es fundamental para la supervivencia celular y mantener microglia en reposo. Las células pueden ser utilizados para la experimentación inmediatamente después de la realimentación.
6. Tratamientos Ejemplo
- Exponer las células a 10 ng / ml de Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml de lipopolisacárido (LPS) o de control del vehículo; incubar durante 2 o 24 horas en incubador humidificado (37 ° C, 5% de CO 2).
7. Analizando Microglia para Funcionalidad ex vivo a través de inmunofluorescencia de Imágenes e inmunocitoquímica
- Después del tratamiento, los medios de cultivo celular de cosecha en tubos de microcentrífuga (1,5 ml) y Centrifuge utilizando una microcentrífuga de mesa (2 min; 900 xg) para borrar los medios de comunicación. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio; ensayo inmediatamente o almacenar a -20 ° C hasta su utilización. Analizar la concentración de TNF-α en células de cultivo sobrenadante a través de kit de ELISA de TNF-α ratón comercialmente disponible.
- Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y fijar las células con 4% (w / v) de paraformaldehído / 4% (w / v) de sacarosa / PBS a pH 7,4 (4% de PFA; 15 min; RT). Después de la fijación, lavar las células con PBS durante 5 min con agitación suave en un agitador orbital.
- Inmunofluorescencia / inmunocitoquímica. Después de la fijación y lavado con PBS, la microglía proceso para inmunocitoquímica. Todos los pasos llevados a cabo con agitación suave. Permeabilizar las células en PBS/0.1% de Triton X-100; células de bloques en PBS/10% de suero normal de cabra durante una hora. Se incuban las células de O / N a 4 ° C con anticuerpo de conejo anti-NF-kB (subunidad p65; 1/1, 250) o de conejo anti-Iba-1 anticuerpo (1/750) en tampón de bloqueo. Visualize complejo antígeno: anticuerpo tras la incubación con fluorescente conjugado de cabra anti-conejo de anticuerpos IgG secundaria (1 hora, 1/1, 000). Se quita el anticuerpo secundario no unido por lavado con PBS/0.1% de Triton X-100 (3x 5 min).
- Células de manchas contador con 4 ',6-diamidino-2-fenilindol / PBS (DAPI; 0,1 g / ml). Para visualizar el núcleo de la célula Todos microglia derivados de CX3CR1-GFP + / - ratones expresan GFP. Utilizar un filtro de longitud de onda de 350 nm a visualizar DAPI; un filtro de longitud de onda de 488 nm a visualizar GFP, y un filtro de longitud de onda de 594 nm a visualizar p65 y Iba-1 inmunocomplejos.
- Monte la cubierta se desliza usando una solución de montaje acuoso y visualizar microglia utilizando microscopía fluorescente.
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Representative Results
Conservando el inmunofenotipo y la funcionalidad de la microglia ex vivo durante el aislamiento es crítico para ser capaz de utilizar estas células como un modelo de investigación para la biología de la microglia. Con el fin de demostrar la preservación con éxito de immunofunctionality microglia utilizando el presente método, se aislaron microglia corticales de los recién nacidos P3 (CX3CR1-GFP + / - y ratones C57BL / 6) y los cultivos tratados con LPS o Pam.
Como se ilustra en la Figura 1A, el aislamiento de la microglia a través de la agitación a través de agitación rotatorio conserva el fenotipo quiescente atribuido a la microglía en condiciones normales in vivo. Para evaluar la pureza de la microglia, + /-CX3CR1 GFP - cultivos de células se tiñeron para el antígeno de macrófagos Iba-1 y el contador se tiñeron con DAPI para visualizar el núcleo de la célula. Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, en virtud de bajo aumento, el aislamiento microglía a través de la presently descrito método da como resultado en un cultivo celular de alta pureza, como mayor que 95% de las células exhiben colocalización de GFP, Iba-1, y DAPI.
A continuación trató de confirmar la capacidad de respuesta de la microglía ex vivo desafiando células con LPS. En comparación con el tratamiento con vehículo, tratado con LPS CX3CR1-GFP + / -. Microglia adaptado un cambio morfológico Stark a partir de una pequeña, fenotipo bipolar a una forma ameboide-como, como se muestra en la Figura 1B Este cambio morfológico también se recapitula en microglia corticales aisladas de ratones C57BL / 6 recién nacidos tratados con Pam (Figura 2). Esta respuesta morfológica conservada entre distintas genéticamente microglia, que se activa con diferentes estímulos, pone de relieve la reproducibilidad y aplicabilidad del presente Protocolo, en lo que respecta a los diversos modelos experimentales.
A pesar de que este cambio en la morfología es indicativo de activación 39, es necesario determine si microglia aislados mediante agitación rotatoria a retener su capacidad para trasladar a la activación de p65, lo que indica la conservación de la señalización intracelular mediada por TLR funcional. Para confirmar esta cascada de señalización, tratamos microglia aisladas de C57BL / 6 recién nacidos con Pam. Como se ilustra en la Figura 2, tinción inmunocitoquímica para p65 en evidencia que, en condiciones normales, p65 se localiza de forma difusa por todo el citoplasma, mientras que después de una estimulación 2 h con Pam, la inmunorreactividad de p65 cambió drásticamente localización al núcleo celular.
Una vez establecido que la microglía aislados mediante el método presentado en este documento preservan los mecanismos moleculares para trasladar p65 al núcleo, el próximo querían para confirmar que la microglia aislado conservan su immunofunctionality bioquímica ensayando su capacidad para secretar una citoquina proinflamatoria sello, TNF-α, tras la activación . Como se demuestra en la Figura 3, encomparación con la microglía tratado con vehículo, las células expuestas a Pam o LPS aumentan la secreción de TNF-α en los medios de cultivo (P <0,0001; ANOVA de una vía), indicativo de funcional TLR1 / 2 andTLR4 vías de señalización, respectivamente.
Por lo tanto, en conjunto, estos datos demuestran que el aislamiento de microglia a través rotativos resultados temblorosas en cultivos de células de alta pureza con inmunofenotipo y funcionalidad conservada, ex vivo.
. Figura 1. Agitación rotatoria rendimientos de alta pureza microglial culturas con inmunofenotipo conservado células microgliales se aislaron de CX3CR1-GFP + / - ratones recién nacidos en P3 y se trataron con vehículo (A), o LPS bacteriano (B) durante 24 horas.Las células fueron fijadas con PFA al 4%, se tiñeron para immunocytochemically Iba-1, y el contador se tiñeron con DAPI. (A) La microglia tratados con PBS presentan un bipolar, fenotipo quiescente. (B) Tras la estimulación con LPS, microglia se adaptan un fenotipo ameboide como, indicativo de activación. Canal Fusionada en los paneles (A) y (B) bajo ampliación 10x demuestran que> 95% de las células son células positivas GFP/Iba-1. 10X barra de escala: 100 m; 40X barra de escala: 20 m. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Microglia aisló mediante agitación rotatoria translocate NF-kB en la celda núcleo a Pam challenge. Las células microgliales se aislaron de ratones C57BL / 6 recién nacidos en P3 y tratados con vehículo o Pam durante 2 horas. Las células fueron fijadas con PFA al 4% y se tiñeron para p65 a través de inmunocitoquímica. Las células fueron contra manchadas con DAPI para visualizar el núcleo de la célula. En tratado con vehículo microglia, p65 se localiza en todo el citoplasma, mientras que la estimulación con Pam induce la translocación nuclear de p65. 40X barra de escala:. 20 micras clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Microglía aislado con agitación rotatoria la liberación de TNF-α tras la exposición a Pam o LPS. Las células microgliales se aislaron de ratones C57BL / 6 ratones recién nacidos en P3 y tratados con vehículo, Pam, o LPS durante 2 hr. Sobrenadantes de cultivo de células se recogieron y se analizaron mediante ELISA para la liberación de TNF-α. *** P <0,0001 (n = 2; ANOVA de una vía). Los datos se presentan como medias ± SD.
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Discussion
El presente procedimiento ofrece un método eficaz para el aislamiento de la microglia corticales de ratones neonatales. Este procedimiento tiene un doble beneficio de 1) preservar inmunofenotipo la microglia y la funcionalidad, según lo determinado por proyección de imagen fluorescente, inmunocitoquímica, y ELISA, y, 2) que permite la microglía a madurar en presencia de otras células gliales (astrocitos y oligodentrocytes) antes de la aislamiento, lo que puede facilitar importantes interacciones célula-célula durante el período de cultivo de maduración glial. Es importante destacar que las células aisladas mostraron una alta viabilidad y la uniformidad con la funcionalidad conservada e inmunofenotipo ex vivo.
Hay varios pasos que deben llevarse a cabo con especial atención y diligencia para el aislamiento exitoso de la microglia con la más alta pureza y rendimiento. Estos pasos son: 1) el mantenimiento de un cultivo estéril y saludable durante todo el proceso de experimentación, 2) la eliminación de todas las meninges de la corticas durante microdisección; 3) el lavado adecuado de los pelos en la placa y las tijeras después de picar cortezas; 4) equilibrar MCM en matraces T-75 en la incubadora antes de comenzar microdisección; 5) la realimentación 24 horas después de la aislamiento.
Dado que la microglía son las células inmunes residentes del SNC, que son muy sensibles a las agresiones ambientales. Por lo tanto, evitar la contaminación de la cultura con agentes patógenos es fundamental para la preservación de los atributos inmunofenotípicas y funcionales de las células microgliales en reposo. Inspección diaria de las células para controlar la contaminación y el crecimiento es esencial para evitar los cultivos de células comprometidas y para obtener una mejor comprensión de la tasa de crecimiento de la microglia. Además, es necesario refrescar MGM de 24 horas después de la siembra de la microglia con el fin de mantener la viabilidad celular y la funcionalidad.
Un obstáculo importante para superar en el aislamiento de la microglia es para asegurar que el tejido del SNC picada es libre de células endoteliales, que,si está presente, puede impedir la proliferación microglial formando densas colonias en los cultivos gliales. Por esta razón, es crítico para eliminar completamente las meninges del SNC durante la microdisección del cerebro. En nuestra experiencia, las meninges de los neonatos P3 se eliminan con mayor facilidad que los recién nacidos P1, ya que el tejido es más desarrollado y más fácil de visualizar al microscopio de disección. Además, es importante evitar mojar el lado dorsal del cerebro con DM después de quitar el cerebro del cráneo. Esto se puede hacer por mantener el cerebro en posición anatómica (dorsal hacia arriba) cuando se transfiere a la DM. Mantener el lado dorsal del cerebro seco permite una mejor visualización y la eliminación más fácil de las meninges.
Hemos encontrado que la manera más eficaz para eliminar las meninges es insertar la fuerza # 4 en la parte más posterior de la fisura interhemisférica, y cáscara de las meninges fuera, lateralmente. Una vez que las meninges dorsales se han borrado, entonces Remove las meninges ventral invirtiendo el cerebro (lado ventral hacia arriba), y agarrar suavemente los bulbos olfatorios y pelado de nuevo hacia la parte posterior del cerebro. A continuación, retirar cualquier tejido meníngeo ventral restante pelando con suavidad y la depilación con pinzas en un movimiento lateral. La posterior separación de la corteza del resto del cerebro es crucial para aislar sólo la microglía corticales. El procedimiento detallado en el presente documento también es flexible en que se puede utilizar para aislar la microglía de las regiones subcorticales, así. Sin embargo, es importante señalar que el rendimiento de células puede ser más baja debido a la variabilidad de la densidad de la microglia regiones del cerebro cytoarchitectural indiferentes 40.
Hemos encontrado que para maximizar el rendimiento final de la microglia es importante para enjuagar y recoger el enjuague de los materiales utilizados en el proceso de picado. Estos enjuagues aseguran la colección completa de todo el tejido residual que pueda haber quedado en la tijera para picar carne, plato de Petri, y la pipetapunta utilizada para alícuotas del tejido picado en el tubo cónico. Es importante que estos enjuagues tienen lugar inmediatamente después de transferir el tejido del SNC picada para el tubo cónico, para optimizar la viabilidad celular. También es fundamental para la viabilidad celular que las células no se quedan en MM durante más de 2 minutos desde MM carece de nutrientes esenciales.
Por último, es fundamental para preparar los frascos T-75 con MCM y colocarlos en la incubadora humidificado (37 ° C, 5% CO 2) antes de iniciar el protocolo de microdisección. Frasco Thet-75 tiene un revestimiento poroso bajo su tapa que permite el intercambio de gases, lo que facilita el equilibrado de medios antes de la adición de la mezcla de culturas gliales. Hemos encontrado que el hecho de hacer esto se traduce en una cosecha microglial subóptima. También es importante para sellar la tapa matraz T-75 con Parafilm antes de colocar el matraz en el agitador rotatorio con el fin de minimizar el intercambio gaseoso en y fuera del matraz mientras gira.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiero que puedan interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
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