Summary
מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).
Abstract
בידוד של מיקרוגליה מרקמת מערכת העצבים המרכזית הוא כלי חקירה רב עוצמה המשמש ללימודי ביולוגיה microglial vivo לשעבר. השיטה הנוכחית פרטי הליך לבידודה של מיקרוגליה מקליפת המוח העכברי ילוד על ידי תסיסה מכאנית עם שייקר סיבובי. בידוד מיקרוגליה זה תשואות שיטת מיקרוגליה בקליפת המוח טהורים מאוד כי תערוכת מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים מעידים על מיקרוגליה שקטים בתנאים רגילים, nonpathological in vivo. הליך זה גם משמר את immunophenotype microglial והפונקציונליות ביוכימיים כפי שהודגם על ידי האינדוקציה של שינויים מורפולוגיים, טרנסלוקציה הגרעינית של למקטע p65 של NF-κB (p65), והפרשה של ציטוקינים מעודדי דלקת סימן היכר, גורם-α נמק גידול (TNF-α ), על lipopolysaccharide (LPS) ופאם 3 4 צסק"א (פאם) אתגרים. לכן, הליך הבידוד הנוכחי משמר את immunophenotype של שניהם שקטים וactiמיקרוגליה vated, מתן שיטה ניסיונית של חקירת ביולוגיה מיקרוגליה בתנאי vivo לשעבר.
Introduction
תאי microglial, מקרופאגים המעקב של parenchyma מערכת העצבים המרכזית, מהווים כ 12% מאוכלוסיית התאים הכוללת של המוח של היונקים הבוגרים. מיקרוגליה נגזרים מצק חלמון מיאלואידית מבשר תאים ולהשתנות בצפיפות תאים ומורפולוגיה באזורי cytoarchitectural שונים בתוך מערכת העצבים המרכזית הבוגר 1-5. במוח בוגר בריא, מיקרוגליה הם תאים קטנים, מסועפים או קוטב עם תהליכים עדינים ודינמיים. בניגוד למורפולוגיה מקרופאג היקפי, מיקרוגליה להפגין פנוטיפ במוחות בריאים שעלולות להופיע כחוסר פעילות הסלולר שקט, בפרופיל נמוך, עם זאת, במחקרי הדמיה vivo מראים כי תהליכי microglial דינמי להאריך ולחזור בו כדי לפקח microenvironment שלהם באופן המזכיר את " דגימה ומדידות "6,7.
מיקרוגליה הם מאוד ואופן דיפרנציאלי מגיבים לשינויים סביבתיים וpathophysiological במוח, מיתוגממשגיח למדינות מדינות בדרך כלל נחשבים למנוחה שלהם והופעלו מפעיל, בהתאמה. מתג בהפעלה זו יכול להיות מתווך על ידי מעורבות של קולטני קרום הנכנס זיהוי תבניות (PRRs), כגון קולטנים כמו חיוג (TLRs), אשר מגיבים הלקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן (PAMPs), ליפופרוטאינים כלומר חיידקים ונגיפיים נגזרים , חומצות גרעין, ופחמימות 8-11. בנוסף לPAMPs, PRRs יש גם הוכח כדי לגרום להפעלת microglial נגד מולקולות סטרילי, nonpathogenic המכונים דפוסי סכנה / הקשורים לנזק מולקולרי (damps), המייצגות את הפרעות במערכת העצבים המרכזית הומאוסטזיס, כגון נזק לתאים 12-16. עוסק ברגע, PRRs ליזום תאית מפל איתות כי תוצאות שינויים בביטוי מורפולוגיה של תאים וגני microglial, במיוחד, מיקרוגליה הופעלו להתאים פנוטיפ כמו אמבואידית, translocate מקטע p65 NF-κB (p65) לגרעין התא, וupregulate production והפרשה של ציטוקינים מעודדי דלקת, כגון גורם-α גידול הנמק (TNF-α), β interleukin-1 (IL-1β), יחד עם מיני חמצן תגובתי (ROS) 16-24. אמנם נפרד בתגובה החיסונית המולדת של מערכת העצבים המרכזית, מולקולות המופרשות על אלה יש גם נמצאים להגדיל סטרס חמצונים עצביים, ובכך ישכנעו והחרפת ניוון מוחיים במדינות חולות כמו פרקינסון ואלצהיימר 25-29.
עם זאת, המנגנונים של הפעלת microglial במצבים פתולוגיים שאינם מובן לחלוטין. לכן, בידוד של מיקרוגליה הוא כלי רב עוצמה לחקירת תהליכים ביולוגיים אלה, כפי שרבים בתכונות vivo של הפעלת microglial יכולים להיות סכמו בתרבות. מספר שיטות זמינות לבידוד מיקרוגליה, כולל בידוד באמצעות שיפוע Percoll הבא עיכול אנזימטי של רקמת מערכת העצבים המרכזית 30,31. עם זאת, עיכול אנזימטי יכול לשנותimmunophenotype של התאים על ידי הפחתה על פני קרום תא ביטוי אנטיגן 32, ותוצאות בתשואה נמוכה יותר לכל תא בבעלי חיים מאשר בשיטה שתוארה במסמך זה. באופן ספציפי, אנו מדווחים תשואת מיקרוגליה ממוצעת לקליפת גור של 7.5 x 10 5 תאים, בעוד שדווחו בעבר שיטות בידוד מכל מערכת העצבים המרכזית באמצעות תשואת שיפוע Percoll 3-5 x 10 5 תאים 30,33,34. ההליך הנוכחי עוקף את השימוש באנזימי עיכול על ידי בידוד מיקרוגליה המבוססים על המאפיינים נמוך דבקותם, ובכך לשמר את immunophenotype ופונקציונליות microglial.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים את הבידוד של תאי microglial מתרבויות גליה מעורבות נגזרו מCX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) הטרוזיגוטיים בילוד, וC57BL / 6 הקורטקס עכברי באמצעות תסיסה מכאנית על שייקר סיבובי, הרחבה של העבר 24,35 שיטה שפורסם. אנו משתמשים בזן העכבר לשעבר להדמיה קלה של מיקרוגליה, כפיעכברים אלה מבטאים GFP תחת שליטתו של מוקד CX3CR1 אנדוגני - אמרגן מונוציטים הספציפיים 36-38. שיטה זו מייצרת תרבויות microglial טהורות מאוד עם השתמרו immunophenotype לשעבר, / 2 אגוניסטים TLR4 וTLR1 vivo כפי שהודגם על ידי שינויים מורפולוגיים, טרנסלוקציה הגרעינית של p65, והפרשה של TNF-α כאשר תיגר עם lipopolysaccharide חיידקים (LPS) או פאם 3 צסק"א 4 , בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לפני תחילת פרוטוקול זה, לאסוף עכברים בילוד בימים שלאחר הלידה 1-3 (P1-3) במכל סטרילי מקונן עם מצעי כלוב מקוריים להגנה וחמימות. חשוב לעבוד במהירות וביעילות באמצעות פרוטוקול זה כדי לייעל את תשואת microglial. אנא ראה טבלה 1 לרשימה מגיב מלאה.
1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, וצלחות
- הכן 10 מיליליטר / גור מדיה שלמה Microglia (MCM; 1x מינימאלי חיוני [ממ] של בינוני ארל בתוספת: 1 L-גלוטמין מ"מ, פירובט נתרן 1 מ"מ,) גלוקוז D-(+ 0.6% v / v, 100 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), 4% v / v בסרום שור העוברי (FBS), 6% V / V סוסים סרום), ולהוסיף לכל בקבוק T-75 (בקבוק 1 / גור); כובע ומקום אופקי לתוך חממה (37 מעלות צלזיוס, CO 2 של 5%) לאזן במשך שעה 1. זה חיוני כדי לאזן את המדיה הזו בבקבוק (ים) לפני תחילת הניתוח.
- תכשיריםמחדש, aliquot, וחם ב37 MCM אמבט המים C ° לנתיחה (6 מיליליטר / גור) ובMCM צינור חרוטי נפרד לתא resuspension (2 מיליליטר / גור). היכונו, aliquot, ומקרר על קרח ממינסינג מדיה (MM; HBSS בתוספת: 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S, M 0.01 HEPES; 3 מיליליטר / גור), וביתור מדיה (DM; MEM השלים עם 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S; 2 מיליליטר / גור).
- לעקר את הכלים כירורגיים הבאים על ידי טבילה באתנול 70% עבור 10 דקות: מספריים # 1 (1; לערוף), מלקחי # 1 (2; כדי לאבטח את האף ולהסיר קליפת מוח), מספריים # 2 (1; קרקפת כדי לפתוח; nonangled ), מלקחיים # 2 (1; להסיר קרקפת), מלקחי 3 # (1; להסיר גולגולת), מלקחיים # 4 (2; להסרת קרומי המוח), מספריים # 3 (1; לבררתי ברקמת מוח). לאפשר לאוויר יבש על משטח סטרילי.
- נגב את המיקרוסקופ תחנת עבודה ונתיחה האופקי-זרימת אוויר עם 70% אתנול.
- לוותר DM לתוך 2 100 מ"מ מנות סטרילי, פטרי ללכידת ראש (3 מיליליטר; מנה 1/3 גורים) ודיסקציה (1 מיליליטר;המנה 1 / גור; מקורר בקרח לפני דיסקציה). לוותר MM לתוך צלחת 1 סטרילי, 100 מ"מ פטרי למיותר ברקמת מוח (1 מיליליטר; מנה 1 / גור).
2. Dissection רקמת המוח
- לפני המתת חסד, בעדינות לטהר צוואר וראש של גור עם אתנול 70% באמצעות רקמות במעבדה. עם מספריים # 1, להרדים במהירות גור על ידי הסרת הראש; ראש ללכוד בצלחת פטרי שהוכנה קודם לכן. להרדים ולהשלים את הנתיחה של גור אחד לפני שתמשיך לחיה הבאה.
- להעביר את הראש לצלחת לנתיחה מקוררת; תחת מיקרוסקופ לנתיחה לאבטח את הראש על ידי צובט את האף באמצעות מלקחי # 1 (לחלופין, הראש יכול להיות מאובטח על ידי פירסינג המלקחיים דרך שקע העין); קרקפת פתוחה באמצעות מספריים מס '2 על ידי יצירת לחתוך-Y: תתחיל מבסיס של ראש ובזווית לכיוון העיניים. השתמש במלקחיים 3 # להסיר בעדינות את הקרקפת על ידי קילוף רוחבי, חושף את הגולגולת.
- באמצעות מלקחיים # 3, בעדינות להסיר רקמת חיבור בבסיסראש. כאשר בסיס גולגולת חשוף גולגולת, בזהירות פתוחה על ידי השחלה זרוע אחת של מלקחיים שבבין המוח והגולגולת (בעקבות סדק המיספרי); אחיזה; משוך בעדינות את הגולגולת כלפי מעלה לקרוע פתוח.
- לשבש את רקמת חיבור בצד הגחוני של המוח באמצעות מלקחי # 1, ולאחר מכן להסיר את המוח תוך שימוש באותו הכלי. הרם את המוח מתוך גולגולת באמצעות כוח כלפי מעלה מתחת לצד הגחוני של המוח.
- שמור על המוח במצב האנטומי שלה: צד גב כלפי מעלה כדי להמחיש את קליפת המוח מתחת למיקרוסקופ לנתיחה; לאבטח את המוח במקום על ידי הוספת טיפים של מלקחיים בצומת של המוח התיכון וקליפת המוח; להסיר לחלוטין את קרומי המוח בקליפת המוח עם מלקחיים # 4, לאחר מכן להמשיך להסיר את קרומי המוח הגחון. ברגע שהקרומים המוח הוסרו לחלוטין, להפריד את קליפת המוח משאר המוח באמצעות מלקחיים # 4. זה חיוני כדי להסיר לחלוטין את רקמת קרום מוח למקסם את טוהר מיקרוגליה וyielד.
3. רקמת מוח ממינסינג
- העברת הקורטקס להכין בעבר מיותר מנה; תמשיך מיותר צעד באמצעות טכניקה סטרילית בClass II בטיחות הביולוגית קבינט.
- רקמת בשר טחון מוח באמצעות מספריים # 3; רקמה טחונות העברת צינור חרוטי 15 מיליליטר;. לשטוף מספריים ומנה מיותרות עם 1 מיליליטר של MM כל אחד, לאסוף ולוותר על שטיפות לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל רקמה הטחון צעד שטיפה זה יהיה למקסם התשואה של מיקרוגליה על ידי הבטחה כי כל הרקמה שיורית מועברת לצינור חרוטי. השאר השעיה רקמות ללא הפרעה במשך 1-2 דקות, המאפשר רקמה טחונות להתיישב בחלק תחתון של צינור. האם לא יעלה על 2 דקות כMM אינו מכיל חומרים מזינים חיוניים.
- מוציא בזהירות וזורקים 2 מיליליטר של supernatant עם micropipettor 1,000 μl גנרית עם קצה פיפטה סטנדרטי, מה שהופך מסוימים לא לשבש התיישבו טחונות רקמות. הוסף 3 מיליליטר של MCM לטחון רקמות; triturate הרקמה בכל כוח באמצעות micropipettor 1,000 μl גנרית עם קצה פיפטה סטנדרטי לא ניתן להבחין רקמה מוצקה צריכה להישאר כאשר טחינה דקה הושלמה.. להוסיף עוד 3 מיליליטר של MCM עם אותו קצה פיפטה, איסוף דגימת triturated שיורי מקצה פיפטה.
4. תאים בקליפת מוח גידול
- צנטריפוגה הרקמה הטחון עד גלולה תאים (XG 215; 5 דקות, RT; צנטריפוגות הקלינית עם הרוטור דלי מתנדנד). חזרו תאי pelleted לארון הבטיחות ביולוגית, להסיר ולבטל את supernatant; עדינות resuspend התא גלולה (2 מיליליטר / צינור; MCM); להוסיף resuspension התא לבקבוק שהוכן בעבר T-75; מכסה את הבקבוק ומניח אותו בצורה אופקית לתוך חממת humidified, סטנדרטית תרבית רקמה (37 ° C CO, 2 5%). אפשר התאים כדי לדגור על 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, לטפוח בעדינות בקבוק נגד כף היד לשבשפסולת רקמות. בדקו תאים לפני ואחרי ההקשה על מנת להבטיח הסרה מלאה של פסולת. בקבוק סט אנכי; להסיר ולסלק תקשורת; להוסיף MCM הטרי לתחתית של הבקבוק (12 מיליליטר; 37 מעלות צלזיוס); כובע ומניח בחזרה לתוך החממה, בצורה אופקית.
- בדקו תאים מדי יום לזיהום וכדי לפקח על צמיחה.
- כ 17-21 בימים במבחנה (DIV), תאי microglial יהיו מוכנים לקציר מתרבות גליה המעורבת. כדי לקבוע אם תאים מוכנים, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. Microglia מוכן לקציר, כאשר ב ~ confluency 40%. הם מופיעים כתאים קטנים, בהירים, כדוריים, גדל כmonolayer על גבי גליה אחרת.
5. בידוד של Microglia ממעורב גלייה תרבות
- כדי לבודד מיקרוגליה, במרץ ברז בקבוק נגד ספסל מעבדה. תסיסה זו מסייעת מיקרוגליה נפרדים מתאי גליה אחרים בשל המאפיינים נמוך דבקות של מיקרוגליה.
- לאסוף תקשורת supernatant המכילה מיקרוגליה לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי חרוטי; מיקרוגליה גלולה (215 XG; 5 דקות, מתנדנד הרוטור דלי).
- Resuspend את כדור microglial בmicroglial החם צמיחה בינונית (MGM; ממ בתוספת: פירובט נתרן 1 מ"מ, 0.6% v / vglucose, L-גלוטמין 1 מ"מ, 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S, 5% V / V FBS; ~ 2 מיליליטר / בקבוק), לקבוע את ריכוז התאים באמצעות hemocytometer, וצלחת 1 x 10 5 תאים / גם בפורמט צלחת 24 גם עלפלסטיק או תלושי סטרילי כיסוי זכוכית (500 μl / טוב; MGM). שימוש בהליך זה תשואת מיקרוגליה הממוצעת היא קליפת 7.5 x 10 5 תאים / גור.
- 24 שעות לאחר ציפוי, להסיר את כל אמצעי התקשורת ובתאי refeed עם MGM הטרי (37 ° C) להסרת תאים ופסולת צפים. שלב זה הוא קריטי להישרדות תא ולשמור על מיקרוגליה שקטים. תאים עשויים להיות מנוצלים לניסויים מייד לאחר refeeding.
6. טיפולים לדוגמא
- לחשוף תאים ל10 ננוגרם / מיליליטר של פאם 3 צסק"א 4 (פאם), 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) או שליטה ברכב; דגירה עבור 2 או 24 שעות בחממת humidified (37 ° C CO, 2 5%).
7. ניתוח Microglia לפונקציונלי Ex vivo באמצעות Immunofluorescent הדמיה וImmunocytochemistry
- לאחר טיפול, תקשורת ותרבות תא קציר בצינורות microfuge (1.5 מיליליטר) וcentrifuge באמצעות microcentrifuge שולחן (2 דקות; 900 XG) כדי לנקות את התקשורת. מעביר את supernatant לצינור microfuge נקי; assay באופן מיידי, או בחנות ב-20 ° C עד מוכן לשימוש. לנתח ריכוז TNF-α בsupernatant תרבית תאים באמצעות ערכת עכבר זמינה מסחרי α-TNF ELISA.
- שטוף תאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), ולתקן את התאים עם 4% (w / v) paraformaldehyde / 4% (w / v) pH סוכרוז / PBS 7.4 (PFA 4%; 15 דקות, RT). בעקבות קיבוע, לשטוף את התאים עם PBS במשך 5 דקות עם רעד עדין על שייקר מסלולית.
- Immunofluorescence / Immunocytochemistry. לאחר הקיבוע וPBS לשטוף, מיקרוגליה תהליך לimmunocytochemistry. כל הצעדים שבוצעו עם רעד עדין. Permeabilize תאים בPBS/0.1% טריטון X-100; תאי בלוק בPBS/10% נסיוב עזים נורמלים למשך שעה אחת. דגירה תאי O / N ב 4 ° C עם נוגדן ארנב נגד NF-κB (מקטע p65; 1/1, 250) או נוגדן ארנב נגד איבא-1 (1/750) בחסימת מאגר. חזותיize אנטיגן: נוגדן מורכב הבא דגירה עם עז מצומדות fluorescently נוגדנים נגד ארנב IgG משניים (1 שעות, 1/1, 000). הסר את שני נוגדנים מאוגדים על ידי שטיפה עם PBS/0.1% X-100 טריטון (3x 5 דקות).
- תאי כתם דלפק עם 4 ',6-diamidino-2-phenylindole / PBS (DAPI; 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר). כדי להמחיש את גרעין התא כל מיקרוגליה נגזרים מ+ / CX3CR1-GFP - העכברים להביע את ה-GFP. לנצל מסנן גל 350 ננומטר לדמיין DAPI; מסנן 488 ננומטר אורך גל לדמיין GFP, ומסנן גל 594 ננומטר לדמיין p65 וייבא-1 immunocomplexes.
- כיסוי ההר מחליק באמצעות פתרון הרכבה מימית ולדמיין מיקרוגליה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שמירה על immunophenotype ופונקציונליות של מיקרוגליה vivo לשעבר בבידוד היא קריטית כדי להיות מסוגל לנצל את התאים האלה כמודל חקירה לביולוגיה microglial. על מנת להדגים את השימור המוצלח של immunofunctionality מיקרוגליה תוך שימוש בשיטה הנוכחית, אנו מבודדים מיקרוגליה בקליפת המוח מילודי P3 (CX3CR1-GFP + / - וC57BL / 6) ותרבויות שטופלו או LPS או פאם.
כפי שמודגם באיור 1 א ', בידוד של מיקרוגליה באמצעות תסיסה באמצעות טלטול סיבובי משמר את הפנוטיפ שקט המיוחס למיקרוגליה בin vivo בתנאים נורמלים. כדי להעריך את טוהר microglial, + / CX3CR1-GFP - תרביות תאים היו מוכתמות לאנטיגן מקרופאג איבא-1 והדלפק מוכתם עם DAPI כדי להמחיש את גרעין התא. כפי שניתן לראות באיורים 1A ו-1B, בהגדלה נמוכה, בידוד מיקרוגליה באמצעות presently תאר תוצאות שיטה בתרבית תאים טהורות מאוד, כגדול יותר מ95% מתאי תערוכת colocalization של ה-GFP, איבא-1, וDAPI.
בשלב הבא אנו ביקשנו לאשר את ההיענות של מיקרוגליה לשעבר vivo על ידי מאתגר תאים עם LPS. בהשוואה לטיפול ברכב, שטופל ב-LPS CX3CR1-GFP + / -. מיקרוגליה מותאמים שינוי מורפולוגי מוחלט מפנוטיפ קטן, דו קוטבי לצורה כמו אמבואידית-, כפי שמוצג באיור 1 ב שינוי מורפולוגי זה גם סכם במיקרוגליה בקליפת המוח מבודדים מC57BL / 6 ילודים שטופלו בפאם (איור 2). תגובה זו נשמרת המורפולוגי בין מיקרוגליה שונים גנטי, מופעלת עם גירויים שונים, מדגישה את שחזור ותחולתו של הפרוטוקול הנוכחי בכל הקשור למודלי ניסויים שונים.
למרות שינוי זה במורפולוגיה מעיד על הפעלת 39, יש צורך דetermine אם מיקרוגליה בודדו על ידי רוטרי רועד לשמור על היכולת שלהם לtranslocate p65 עם הפעלה, המציין את שימור האיתות תאית בתיווך TLR הפונקציונלית. כדי לאשר את מפל איתות זה, התייחסנו מיקרוגליה מבודדים מC57BL / 6 ילודים עם פאם. כפי שמודגם באיור 2, מכתים immunocytochemical לp65 שמעיד כי, בתנאים רגילים, p65 הוא מקומי מתפזרות ברחבי ציטופלסמה, ואילו לאחר גירוי 2 שעות עם פאם, immunoreactivity p65 באופן דרמטי עבר לוקליזציה לגרעין התא.
לאחר שקבע כי מיקרוגליה מבודדים באמצעות השיטה המוצגת במסמך זה לשמר את המנגנונים המולקולריים לtranslocate p65 לגרעין, אנחנו הבאים רצינו לאשר כי מיקרוגליה המבודדים לשמר immunofunctionality ביוכימיים שלהם על ידי בדיקת היכולת שלהם להפריש ציטוקינים מעודדי דלקת סימן היכר, TNF-α, עם הפעלה . כפי שמודגם באיור 3, בהשוואה למיקרוגליה רכב שטופלה, תאים שנחשפו לפאם או LPS להגביר את ההפרשה של TNF-α לתקשורת והתרבות (P <0.0001; בכיוון אחד ANOVA), מעידה על פונקציונלי TLR1 / 2 andTLR4 איתות מסלולים, בהתאמה.
לכן יחדיו, נתונים אלה להקים בידוד זה של מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות מאוד עם immunophenotype השתמר ופונקציונליות, לשעבר vivo.
.. איור 1 רוטרי רועד תשואות תרבויות microglial טוהר גבוה עם immunophenotype השתמר תאי microglial בודדו מ+ / CX3CR1-GFP - עכברים ילודים בP3 וטופלו גם עם רכב (א), או LPS חיידקים (ב ') ל24 שעות.תאים היו קבועים עם PFA 4%, immunocytochemically מוכתם עבור איבא-1, ודלפק מוכתם עם DAPI. () Microglia טופל בתערוכת PBS דו קוטבי, פנוטיפ שקט. (ב) עם אתגר LPS, מיקרוגליה להתאים את הפנוטיפ כמו אמבואידית, מעיד על הפעלה. ערוץ התמזג בפנלים (א) ו (ב) תחת הגדלה 10x להוכיח כי> 95% מתאים הם תאים חיוביים GFP/Iba-1. סרגל קנה המידה 10X: 100 מיקרומטר; סרגל קנה המידה 40X: 20 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. Microglia מבודד באמצעות סיבובי רועד translocate NF-κB לתא גרעין על פאם צ'הllenge. תאי microglial בודדו מC57BL / 6 ילודים בP3 וטופלו ברכב או פאם במשך שעה 2. תאים היו קבועים עם PFA 4% ומוכתמים עבור p65 באמצעות immunocytochemistry. תאים הוכתמו דלפק עם DAPI כדי להמחיש את גרעין התא. במיקרוגליה רכב שטופל, p65 הוא מקומי בכל רחבי ציטופלסמה, ואילו גירוי עם פאם גורם טרנסלוקציה הגרעינית של p65. בר 40X קנה מידה:. 20 מיקרומטר לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. Microglia מבודד עם TNF-α שחרור רועד הסיבובי עם חשיפה לפאם או LPS. תאי microglial בודדו מעכברי C57BL / 6 בילוד בP3 וטופלו ברכב, פאם, או LPS במשך שעה 2. supernatants תרבית תאים נאספו ונותח באמצעות ELISA לשחרור TNF-α. *** P <0.0001 (n = 2; בכיוון אחד ANOVA). הנתונים מוצגים כאמצעי SD ±.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך הנוכחי מציע שיטה יעילה לבידודה של מיקרוגליה בקליפת המוח של עכברים בילוד. הליך זה יש יתרון כפול של 1) immunophenotype מיקרוגליה לשמר ופונקציונליות, כפי שנקבע על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, וELISA; ו, 2) המאפשר למיקרוגליה להבשיל בנוכחות של תאים אחרים גליה (האסטרוציטים וoligodentrocytes) לפני בידוד, אשר עשוי להקל על תאי תאי אינטראקציות חשובות בתקופת התבגרות תרבות גליה. חשוב מכך, תאים מבודדים הציגו כדאיות גבוהה ואחידות עם פונקציונליות השתמרה וimmunophenotype vivo לשעבר.
ישנם מספר צעדים שצריכות להתבצע בתשומת לב ובחריצות מסוימות לבידוד מוצלח של מיקרוגליה עם הטוהר ואת התשואה הגבוה ביותר. צעדים אלה הם: 1) שמירה על תרבות סטרילי, בריאה לאורך ההליך כל הניסויים; 2) הסרת כל קרומי המוח מcortices במהלך microdissection; 3) שטיפה נאותה של מיותר צלחת ומספריים לאחר ריסוק קליפת מוח; 4) equilibrating מלמ"ק בT-75 צלוחיות בחממה לפני תחילת microdissection; 5) refeeding 24 הודעה בידוד-HR.
מאז מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית, הם קשובים מאוד לעלבונות סביבתיים. לכן, הימנעות מזיהום התרבות עם גורמים פתוגניים היא קריטית לשמירה על תכונות immunophenotypic והתפקודיות של תאי microglial שקטים. בדיקה יומית של תאים כדי לפקח על זיהום וצמיחה היא חלק בלתי נפרד הימנעות תרביות תאים שנפרצו וכדי להשיג הבנה טובה יותר של צמיחה בשיעור microglial. יתר על כן, יש צורך לרענן את ההודעה ציפוי 24 שעות MGM של מיקרוגליה על מנת לשמור על כדאיות תא ופונקציונליות.
מכשול עיקרי להתגבר בבידוד מיקרוגליה הוא להבטיח כי רקמת מערכת העצבים המרכזית הטחון היא ללא תאים אנדותל, אשר,אם קיימים, יכול לעכב התפשטות microglial על ידי יצירת מושבות צפופות בתרבויות גליה. מסיבה זו, חשוב להסיר ביסודיות את קרומי המוח במערכת העצבים המרכזית בmicrodissection של המוח. מניסיוננו, את קרומי המוח של הילודים P3 יוסרו בקלות רבה יותר מאשר הילודים P1, כמו הרקמה היא מפותחת יותר וקלה יותר לדמיין תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בנוסף, חשוב להימנע מהרטבה בצד הגבי של המוח עם DM לאחר הסרת המוח מהגולגולת. ניתן לעשות זאת על ידי שמירה על המוח במצב האנטומי (עד צד גב) בעת העברתו לDM. שמירה על צד הגב של יבש המוח מאפשרת להדמיה וההסרה קלה יותר של קרומי המוח טובים יותר.
מצאנו כי הדרך היעילה ביותר להסיר את קרומי המוח היא להכניס הכוח # 4 בחלק האחורי ביותר של הסדק הפגום בתוך המיספרה, ולקלף את קרומי המוח, רוחבי. ברגע שקרומי המוח הגבי נוקו, אז אנחנו רמויש קרומי המוח הגחון על ידי היפוך במוח (הגחון כלפי מעלה), ובעדינות לתפוס את נורות חוש הריח ומתקלף חזרה לכיוון החלק האחורי של המוח. לאחר מכן, אנו להסיר את כל רקמת קרום מוח הגחון שנותרה בעדינות על ידי קילוף ומריטות חוזרים ונשנה בתנועה לרוחב. ההפרדה הבאה של הקליפה משאר המוח היא קריטית לבידוד רק מיקרוגליה בקליפת המוח. ההליך המפורטים כאן הוא גם גמיש בכך שהוא יכול לשמש כדי לבודד מיקרוגליה מאזורים קורטיקליים, גם כן. אם כי, חשוב לציין כי תשואת תא עשויה להיות נמוכה יותר בשל ההשתנות של אזורי צפיפות מיקרוגליה אדישים cytoarchitectural מוח 40.
מצאנו כי על מנת למקסם את התשואה הסופית של מיקרוגליה חשוב לשטוף ולאסוף את השטיפה מהחומרים המשמשים בתהליך המצועצע. שטיפות אלה להבטיח את האוסף המלא של כל הרקמה שיורית שאולי נשאר על המספריים המיותרים, צלחת פטרי, ופיפטהקצה המשמש לaliquot רקמות טחונות לתוך צינור חרוטי. חשובה שהשטיפות אלה יתקיימו מייד לאחר העברת רקמת מערכת העצבים המרכזית הטחון לצינור חרוטי, כדי לייעל את כדאיות תא. זה גם קריטי לכדאיויות תא שהתאים לא להישאר בMM ליותר מ 2 דקות מאז MM הוא נטול חומרים מזינים חיוניים.
לבסוף, חשוב להכין את צלוחיות T-75 עם MCM ולמקם אותם בחממת humidified (37 מעלות צלזיוס; CO 2 של 5%) לפני תחילת פרוטוקול microdissection. יש בקבוק thet-75 בטנה נקבובית מתחת לכובע שלה, המאפשר לחילופי גזים, להקל איזון תקשורת לפני התוספת של תרבויות גליה מעורבות. מצאנו כי כישלון לעשות זה תוצאות בקציר microglial הכי מוצלח. כמו כן, חשוב לאטום את מכסה בקבוק T-75 עם Parafilm לפני הצבת הבקבוק שבייקר הסיבובי על מנת למזער חילופי גזים פנימה והחוצה מהבקבוק בזמן שמסתובב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי המחקר נערך בהעדר כל יחסים מסחריים או כספיים שיכול להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
