Summary
Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolamento de microglia de tecido do SNC é um poderoso instrumento de investigação utilizado para estudar biologia microglial ex vivo. O presente método de detalhes de um procedimento para o isolamento da microglia de córtices murino neonatal por agitação mecânica com um agitador rotativo. Esse isolamento microglia método produz microglia corticais altamente puras que apresentam características morfológicas e funcionais indicativos de microglia quiescentes em condições não patológicas normais in vivo. Este procedimento também preserva a imunofenotipagem da microglia e funcionalidade bioquímica como demonstrado pela indução de alterações morfológicas, translocação nuclear da subunidade p65 de NF-kB (p65), e a secreção de citoquina pró-inflamatória característica, fator de necrose tumoral-α (TNF-α ), ao lipopolissacarídeo (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam) desafios. Portanto, o processo de isolamento do presente preserva a imunofenotipagem de ambos quiescente e actimicroglia motivadas, proporcionando um método experimental de investigação de biologia microglia em condições ex vivo.
Introduction
Células microgliais, os macrófagos de vigilância do parênquima do SNC, compreendem cerca de 12% da população total de células de cérebro de mamíferos adultos. Microglia são derivadas do saco vitelino mielóides células precursoras que variam em densidade celular e morfologia em diferentes regiões citoarquitecturais dentro do SNC adulto 1-5. Em um adulto saudável do cérebro, microglia são células pequenas, ramificadas ou polares, com processos dinâmicos finas. Em contraste com a morfologia dos macrófagos periférica, microglia demonstrar um repouso, fenótipo de baixo perfil em cérebros saudáveis que podem aparecer como inatividade celular, no entanto, estudos in vivo de imagens demonstram que processos microgliais estender dinamicamente e retrair para monitorar seu microambiente de uma forma que lembra " amostragem e levantamento "6,7.
Microglia são altamente responsivos e diferencialmente a alterações ambientais e fisiopatológicos no cérebro, a mudançaa partir de um vigilante de um estados considerados como seu repouso e activado comumente no estado efectoras, respectivamente. Esta chave na ativação pode ser mediada por um envolvimento de receptores ligados à membrana de reconhecimento de padrões (PRRs), tais como receptores toll-like (TLRs), que respondem a padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), lipoproteínas nomeadamente bacterianas e virais derivadas , ácidos nucleicos, hidratos de carbono e 8-11. Além de PAMPs, PRRs também foram mostrados para induzir a ativação da microglia contra moléculas estéreis, não patogênicas, conhecidos como padrões moleculares perigo / associado a danos (amortece), que representam uma perturbação na homeostase do SNC, tais como danos celulares 12-16. Uma vez envolvido, PRRs iniciar uma cascata de sinalização intracelular, que resulta em alterações na morfologia celular e a expressão do gene da microglia, mais especificamente, a microglia activada adaptar um fenótipo amebóides semelhante, translocar o p65 de NF-kB subunidade (p65) para o núcleo da célula, e regula positivamente a producção e secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1 β (IL-1β), juntamente com espécies reativas de oxigênio (ROS) 16-24. Embora integrante da resposta imune inata do sistema nervoso central, estas moléculas segregadas também foram encontradas para aumentar o stress oxidativo neuronal, induzindo e exacerbar a neurodegeneração em estados patológicos, tais como a doença de Parkinson e doença de Alzheimer 25-29.
No entanto, os mecanismos de ativação da microglia em estados patológicos não estão completamente esclarecidos. Portanto, o isolamento de microglia é uma poderosa ferramenta de investigação para esses processos biológicos, como muitos em características in vivo de ativação da microglia pode ser reproduzido na cultura. Vários métodos estão disponíveis para o isolamento de microglia, incluindo o isolamento por meio de um gradiente de Percoll a seguir à digestão enzimática de tecido do SNC 30,31. No entanto, a digestão enzimática pode alterara imunofenotipagem de células por redução da superfície da célula expressão de antigénios de 32, e resulta na produção de células por animal menor do que o método aqui descrito. Especificamente, nós relatamos um rendimento médio por microglia filhote córtex de 7,5 x 10 5 células, enquanto anteriormente relatados métodos de isolamento de todo CNS através de um gradiente de Percoll rendimento 3-5 x 10 5 células 30,33,34. O presente processo evita a utilização de enzimas de digestão, isolando microglia com base nas suas propriedades de baixa aderência, preservando assim a imunofenotipagem da microglia e funcionalidade.
No presente estudo, descrevemos o isolamento de células microgliais de culturas mistas gliais derivadas de heterozigotos CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) neonatal e C57BL / 6 córtices murino via agitação mecânica num agitador rotativo, uma extensão do anteriormente método publicado 24,35. Nós utilizamos o ex-tensão do mouse para fácil visualização da microglia, comoestes ratinhos expressam GFP sob o controlo do locus endógeno CX3CR1 - um promotor específico de monócitos 36-38. Este método produz culturas microgliais altamente puros com um imunofenotipagem conservados ex vivo, como demonstrado por alterações morfológicas, a translocação nuclear de p65, e a secreção de TNF-α quando desafiados com o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) ou Pam 3 CSK 4, TLR4 e TLR1 / 2 agonistas , respectivamente.
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Protocol
Antes de iniciar este protocolo, recolher os ratos neonatal nos dias pós-natal 1-3 (P1-3) em um recipiente estéril aninhados com roupa de cama gaiola original para proteção e calor. É importante trabalhar com rapidez e eficiência através deste protocolo para otimizar o rendimento da microglia. Por favor, consulte a Tabela 1 para a lista de reagentes completa.
1. Preparação de instrumentos, Meios de Cultura, e pratos
- Preparar 10 ml / filhote Microglia Meio Completo (MCM; 1x Essencial Mínimo de Meio Earle [MEM], suplementado com: 1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 0,6% v / v D-(+)-glucose, 100 ug / ml penicilina / estreptomicina (P / S), 4% v / v de soro fetal bovino (FBS), 6% v / v de soro de cavalo), e adicionar a cada frasco T-75 (um frasco / cão); tampa e horizontalmente em lugar uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para se equilibrar durante 1 hora. É essencial para equilibrar este meio em frasco (s) antes de iniciar a dissecção.
- Prepare, alíquota, e quente em 37 ° C MCM banho-maria por dissecção (6 ml / filhote de cachorro) e em um tubo cônico MCM separado para a ressuspensão celular (2 ml / filhote de cachorro). Preparar, alíquota, e frio em gelo trituração meios (MM; HBSS suplementado com: 100 mg / ml de P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / cão), e meios de dissecação (DM; MEM suplementado com 100 ug / ml de P / S; 2 ml / filhote de cachorro).
- Esterilizar os seguintes instrumentos cirúrgicos por submersão em etanol 70% por 10 min: tesoura # 1 (1; decapitar), fórceps # 1 (2, para proteger o nariz e remover córtices), tesoura # 2 (1; nonangled; abrir couro cabeludo ), fórceps # 2 (1; remover couro cabeludo), fórceps # 3 (1, para remover o crânio), fórceps # 4 (2; remover meninges), tesoura # 3 (1; picar o tecido cerebral). Deixe secar ao ar em uma almofada estéril.
- Limpe a estação de trabalho do fluxo de ar horizontal e dissecção microscópio com etanol 70%.
- Dispensar DM em 2 estéreis, 100 milímetros placas de Petri para a captura de cabeça (3 ml, 1 prato / 3 filhotes) e dissecção (1 ml;1 prato / filhote; refrigerados em gelo antes da dissecação). Dispensar MM em um estéril, 100 milímetros placa de Petri para picar o tecido cerebral (1 ml, 1 prato / filhote de cachorro).
2. Tecido cerebral Dissecção
- Antes da eutanásia, higienizar suavemente pescoço e cabeça de cachorro com etanol 70%, utilizando um tecido de laboratório. Com tesoura # 1, eutanásia rapidamente filhote, removendo a cabeça, cabeça de captura previamente preparado em placa de Petri. Eutanásia e completar a dissecação de um filhote de cachorro antes de prosseguir para o próximo animal.
- Transfira a cabeça para o prato dissecção refrigerados; sob microscópio de dissecação proteger a cabeça, apertando o nariz com pinça # 1 (em alternativa, a cabeça pode ser assegurada por piercing fórceps através do soquete do olho); couro cabeludo aberto usando tesoura º 2, criando um Y-cut: começar a partir da base da cabeça e em um ângulo em direção aos olhos. Use pinça n º 3 para remover suavemente couro cabeludo, descamação lateralmente, expondo o crânio.
- Usando fórceps # 3, retire cuidadosamente tecido conjuntivo na base dacabeça. Quando a base do crânio é exposta crânio, cuidadosamente aberta enfiando um braço de pinça entre o cérebro eo crânio (após a fissura inter-hemisférica); aderência; puxe o crânio para cima para rasgar.
- Disrupt tecido conjuntivo sob o lado ventral do cérebro usando pinça n º 1 e, posteriormente, remover cérebro usando a mesma ferramenta. Levante o cérebro fora do crânio, utilizando uma força para cima sob o lado ventral do cérebro.
- Mantenha o cérebro em sua posição anatômica: Lado dorsal voltada para cima para visualizar os córtices sob o microscópio de dissecação; proteger o cérebro no lugar através da inserção de pontas de uma pinça na interseção do mesencéfalo eo córtex; remover completamente meninges corticais com pinça # 4, em seguida, proceder para remover as meninges ventral. Uma vez que as meninges foram completamente removidos, os córtices separar do resto do cérebro utilizando fórceps # 4. É essencial para remover completamente o tecido das meninges para maximizar a pureza e microglia yield.
3. Tecido Cerebral Picar
- Córtices Transferência para preparado previamente picados prato; continuar a picar passo usando técnica estéril na Classe II cabine de segurança biológica.
- Tecido cerebral Mince usando tesoura # 3; transferência tecido picada de um tubo de 15 ml;. Lavar tesoura e picar prato com 1 ml de MM cada, recolher e distribuir lavagens para o tubo de 15 ml contendo o tecido picada Esta etapa de lavagem irá maximizar o rendimento da microglia, assegurando que todo o tecido residual é transferido para o tubo cónico. Deixe suspensão de tecido sem ser perturbado por 1-2 min, permitindo que o tecido picada para resolver na parte inferior do tubo. Não exceda 2 min como MM não contém nutrientes essenciais.
- Cuidadosamente retire e descarte 2 ml de sobrenadante com genérico 1.000 mL micropipeta com uma ponteira standard, tornando certas para não perturbar o tecido picada resolvido. Adicionar 3 ml de MCM para o tecido moído; tritura-se o tecido com força total usando um genérico 1000 ul micropipeta com uma ponta de pipeta padrão discernível n tecido sólido devem permanecer quando trituração é completa.. Adicionar mais 3 ml de MCM com a mesma ponteira, coletando amostra triturado residual da ponta da pipeta.
4. Crescer células corticais
- Centrífuga tecido picada para sedimentar as células (215 xg, 5 min; RT; centrífuga clínica com rotor basculante). Retornar células peletizadas para a cabine de segurança biológica, remover e descartar o sobrenadante; delicadamente ressuspender o pellet celular (2 ml / tubo; MCM); adicionar o ressuspensão celular para o T-75 frasco previamente preparado; tampar a garrafa e coloque-o horizontalmente em um humidificado, incubador padrão de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO 2). Permitir que as células a incubar durante 24 horas.
- Após 24 horas, bata suavemente frasco contra a palma da mão para interromperrestos de tecido. Confira as células antes e depois de tocar para garantir a completa remoção de detritos. Conjunto de frasco vertical; remover e descartar media; adicionar MCM fresco para o fundo do frasco (12 ml; 37 ° C); tampa e volte a colocar na incubadora, horizontalmente.
- Confira as células diariamente para a contaminação e para monitorar o crescimento.
- Em cerca de 17-21 dias in vitro (DIV), as células microgliais estará pronto para a colheita a partir da cultura mista glial. Para determinar se as células estão prontos, examinar células sob um microscópio de contraste de fase invertida. Microglia estão prontos para a colheita quando a ~ 40% de confluência. Eles aparecem como células esféricas pequenas, brilhantes, crescendo como uma monocamada em cima de outro glia.
5. Isolamento da microglia de cultura mista de glia
- Para isolar microglia, vigorosamente tocar frasco contra a bancada de laboratório. Esta agitação ajuda microglia separadas de outras células da glia, devido às propriedades de baixa aderência da microglia.
- Recolhe meios de sobrenadante contendo microglia em um tubo de centrífuga estéril cónica; microglia pelota (215 xg, 5 min; rotor basculante).
- Ressuspender o sedimento em microglia quente Microglial Meio de Crescimento (MGM; MEM suplementado com: 1 mM de piruvato de sódio, 0,6% v / vglucose, 1 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de P / S, 5% v / v de FBS, 2 ~ ml / frasco), determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro, e a placa de 1 x 10 5 células / cavidade em um formato de placa de 24 poços emplástico ou deslizamentos estéreis tampa de vidro (500 mL / poço; MGM). Usando este procedimento, o rendimento médio microglia é de 7,5 x 10 5 células / filhote córtex.
- 24 horas pós-chapeamento, remova todos os meios de comunicação e as células refeed com MGM fresco (37 ° C) para remover as células flutuantes e detritos. Esta etapa é fundamental para a sobrevivência da célula e manter microglia quiescentes. As células podem ser utilizados para a experimentação imediatamente após a realimentação.
6. Tratamentos Exemplo
- Expor as células a 10 ng / ml de Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / mL de lipopolissacarídeo (LPS) ou de controlo de veículo; incubar durante 2 ou 24 horas, numa incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO 2).
7. Analisando Microglia para Funcionalidade Ex vivo via Immunofluorescent Imagem e Imunocitoquímica
- Após o tratamento, meios de cultura de células da colheita em tubos de microcentrífuga (1,5 ml) e centrifuge usando uma microcentrífuga de mesa (2 min; 900 xg) para limpar a mídia. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo; ensaio imediatamente, ou armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para uso. Analisar a concentração de TNF-α em células de cultura sobrenadante através disponível comercialmente kit de TNF-α rato ELISA.
- Lavar as células com tampão fosfato salino (PBS), e fixar as células com 4% (w / v) de paraformaldeído / 4% (w / v) de sacarose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min; RT). Após a fixação, lavar as células com PBS durante 5 min com agitação suave num agitador orbital.
- Imunofluorescência / Imunocitoquímica. Após a fixação e PBS lavar, processo microglia para imunocitoquímica. Todas as etapas realizadas com agitação suave. Permeabilizar as células em PBS/0.1% de triton X-100, células de bloco em PBS/10% de soro de cabra normal durante uma hora. Incubar as células S / N a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-NF-kB (p65 subunidade, 1/1, 250) ou de coelho anti-Iba-1 do anticorpo (1/750) no tampão de bloqueio. Visualize antigénio: anticorpo a seguir à incubação com fluorescência de cabra anti-coelho conjugado anticorpo IgG secundário (1 hora, 1/1, 000). Remover o anticorpo secundário não ligado por lavagem com PBS/0.1% de triton X-100 (3 x 5 min).
- Células contra mancha com 4 ',6-diamidino-2-fenilindole / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). De visualizar o núcleo da célula Todos os derivados de microglia CX3CR1-GFP + / - ratos expressam GFP. Utilizar um filtro de comprimento de onda de 350 nm para visualizar DAPI; de um filtro de comprimento de onda de 488 nm para visualizar GFP, e um filtro de comprimento de onda de 594 nm para visualizar p65 e Iba-1 imunocomplexos.
- Monte lamínulas utilizando solução aquosa de montagem e visualizar microglia por microscopia de fluorescência.
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Representative Results
Mantendo a imunofenotipagem e funcionalidade da microglia ex vivo durante o isolamento é importante ser capaz de utilizar essas células como um modelo de investigação para a biologia da microglia. A fim de demonstrar a conservação bem sucedida da microglia immunofunctionality usando o presente método, foram isoladas a partir de recém-nascidos microglia corticais P3 (CX3CR1-GFP + / - C57BL / 6) e as culturas tratadas quer com LPS ou Pam.
Como ilustrado na Figura 1A, o isolamento da microglia por meio de agitação por meio de agitação rotativa preserva o fenótipo quiescente atribuída a microglia in vivo em condições normais. Para avaliar a pureza da microglia, CX3CR1-GFP + / - culturas de células foram coradas para o antigénio de macrófagos Iba-1 e contra-coradas com DAPI, a fim de visualizar o núcleo da célula. Como mostrado nas Figuras 1A e 1B, sob baixa ampliação, isolamento microglia através da presently descrito método resulta em uma cultura de células de elevada pureza, tal como mais do que 95% das células apresentam uma co-localização de GFP, Iba-1, e DAPI.
A seguir, procurou confirmar a capacidade de resposta da microglia ex vivo, desafiando células com LPS. Em comparação com o tratamento com veículo, tratadas com LPS CX3CR1-GFP + / -. Microglia adaptada uma alteração morfológica forte a partir de uma pequena, fenótipo bipolar para uma forma amebóides semelhante, como mostrado na Figura 1B Esta alteração morfológica também se condensa em microglia corticais isolados a partir de ratinhos C57BL / 6 neonatos tratados com Pam (Figura 2). Esta resposta morfológica conservadas entre microglia geneticamente distintos, ativado com diferentes estímulos, ressalta a reprodutibilidade e aplicabilidade do presente protocolo em relação aos vários modelos experimentais.
Embora esta mudança na morfologia é indicativo de activação 39, é necessário determine se microglia isolado por rotativo tremendo manter a sua capacidade de translocar p65 após a ativação, indicando a preservação da sinalização intracelular mediada TLR-funcional. Para confirmar essa cascata de sinalização, tratamos microglia isoladas de C57BL / 6 recém-nascidos com Pam. Tal como ilustrado na Figura 2, a coloração imunocitoquímica para p65 mostraram que, em condições normais, o p65 é difusamente localizados ao longo do citoplasma, enquanto que depois de uma estimulação 2 hr com Pam, p65 imuno mudaram drasticamente localização para o núcleo da célula.
Tendo estabelecido que a microglia isolado através do método aqui apresentado preservar os mecanismos moleculares para translocar para o núcleo p65, que ao lado desejado para confirmar que a microglia isolado conservam a sua immunofunctionality bioquímica testando a sua capacidade para segregar uma citocina pró-inflamatória característica, o TNF-α, após activação . Como demonstrado na Figura 3, emcomparação com microglia tratados com veículo, as células expostas a Pam ou LPS aumentar a secreção de TNF-α para o meio de cultura (P <0,0001, ANOVA unilateral), indicativo de funcional TLR1 / 2 andTLR4 vias de sinalização, respectivamente.
Portanto, tomados em conjunto, estes dados estabelecem que o isolamento da microglia por meio de agitação, rotativos resultados em culturas de células de elevada pureza com imunofenotipagem e funcionalidade preservada, ex vivo.
. Figura 1. Rotary agitação rendimentos de alta pureza culturas microgliais com imunofenotipagem preservada células microgliais foram isolados a partir de CX3CR1-GFP + / - ratinhos neonatais em P3 e tratados com veículo (A), ou com LPS bacteriano (B) durante 24 horas.As células foram fixadas com PFA a 4%, imunocitoquimicamente coradas para Iba-1, e contra-coradas com DAPI. (A) Microglia tratados com PBS exibem uma bipolar, fenótipo quiescente. (B) Após o desafio com LPS, microglia adaptar um fenótipo amebóide-like, indicativo de ativação. Canal Incorporada em painéis (A) e (B) em 10x demonstrar que> 95% das células são células positivas GFP/Iba-1. 10X barra de escala: 100 mm; 40X barra de escala: 20 m. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Microglia isolado via rotativo tremendo translocam NF-kB para a célula núcleo sobre Pam challenge. células microgliais foram isoladas a partir de ratinhos C57BL / 6 neonatos em P3 e tratados com veículo ou Pam durante 2 horas. As células foram fixadas com PFA a 4% e coradas para p65 através de imunocitoquímica. As células foram contra-coradas com DAPI para visualizar o núcleo da célula. No veículo tratado microglia, p65 está localizada ao longo do citoplasma, enquanto que a estimulação com Pam induz a translocação nuclear de p65. 40X barra de escala:. 20 mM Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Microglia isolado com agitação rotativa a libertação de TNF-α após exposição a Pam ou LPS. Células microgliais foram isoladas a partir de ratinhos C57BL / 6, ratinhos neonatais em P3 e tratados com veículo, Pam, ou LPS para 2 horas. Os sobrenadantes de cultura de células foram recolhidos e analisados por ELISA para a libertação de TNF-α. *** P <0,0001 (n = 2; one-way ANOVA). Os dados são apresentados como média ± SD.
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Discussion
O presente processo oferece um método eficaz para o isolamento da microglia corticais de ratinhos neonatais. Este procedimento tem um benefício duplo de 1) a preservação imunofenotipagem microglia e funcionalidade, como determinado por imagiologia fluorescente, imunocitoquímica, e ELISA, e, 2), permitindo que a microglia para amadurecer na presença de outras células gliais (astrócitos e oligodentrocytes) antes isolamento, o que pode facilitar as interações célula-célula importantes durante o período de maturação da cultura glial. Importante, células isoladas exibiram alta viabilidade e uniformidade com a funcionalidade preservada e imunofenotipagem ex vivo.
Há várias etapas que precisam ser executadas com especial atenção e diligência para isolamento de microglia com a mais alta pureza e rendimento. Estes passos são: 1) a manutenção de uma cultura saudável estéril durante todo o processo de experimentação todo, 2) a remoção de todas as meninges da corcas durante microdissection; 3) lavagem adequada de picar prato e tesoura após picar córtices, 4) equilibrar MCM em T-75 frascos na incubadora antes de começar microdissection; 5) realimentação de 24 horas pós-isolamento.
Uma vez que a microglia são as células do sistema imunológico residentes do SNC, que são altamente sensíveis às agressões ambientais. Assim, evitando a contaminação da cultura com os agentes patogénicos é crítico para preservar os atributos imunofenotípicas e funcionais de células microgliais quiescentes. Inspeção diária de células para monitorar a contaminação e crescimento é essencial para evitar a culturas de células comprometidas e obter uma melhor compreensão da taxa de crescimento da microglia. Além disso, é necessário para refrescar MGM de 24 horas após plaqueamento de microglia, a fim de manter a viabilidade celular e funcionalidade.
Um dos principais obstáculos para superar a isolar microglia é para garantir que o tecido do SNC picada é livre de células endoteliais, que,se presente, pode impedir a proliferação da microglia, formando colônias densas nas culturas gliais. Por esta razão, é crucial para remover completamente as meninges SNC durante microdissecção do cérebro. Na nossa experiência, as meninges de neonatos P3 são removidos com maior facilidade do que os neonatos P1, como o tecido é mais desenvolvida e mais fácil de visualizar sob o microscópio de dissecação. Além disso, é importante evitar molhar o lado dorsal do cérebro com o DM, após a remoção do cérebro do crânio. Isto pode ser feito, mantendo o cérebro em posição anatómica (dorsal voltada para cima) quando transferi-lo para DM. Mantendo a parte dorsal da seco cérebro permite uma melhor visualização e remoção mais fácil das meninges.
Descobrimos que a maneira mais eficaz para remover as meninges é inserir a força N º 4 na parte mais posterior da fissura inter-hemisférica, e meninges casca fora, lateralmente. Uma vez que as meninges dorsais foram apagadas, nós então remove as meninges ventrais invertendo o cérebro (lado ventral para cima), e agarrando suavemente os bulbos olfatórios e descamação de volta para a parte posterior do cérebro. Em seguida, remover todo o tecido das meninges ventral restante por descascar delicadamente e pinça em um movimento lateral. A separação subsequente do córtex do resto do cérebro é crucial para isolar apenas microglia corticais. O procedimento aqui detalhado, também é flexível, uma vez que pode ser utilizado para isolar a microglia de regiões subcorticais, bem. No entanto, é importante notar que o rendimento de células pode ser mais baixa, devido à variabilidade de indiferentes regiões cerebrais citoarquitecturais densidade microglia 40.
Verificou-se que para maximizar o rendimento final da microglia é importante para enxaguar e recolher a água de lavagem a partir dos materiais utilizados no processo de picagem. Estas lavagens garantir a coleção completa de todo o tecido residual que pode ter permanecido na tesoura picar, placa de Petri, e da pipetaponta usada para divida em alíquotas o tecido moído no interior do tubo cónico. É importante que estas lavagens ter lugar imediatamente após a transferência do tecido do SNC picada para o tubo cónica, para optimizar a viabilidade celular. Também é fundamental para a viabilidade das células que as células não ficam no MM por mais de 2 min desde MM é desprovido de nutrientes essenciais.
Por último, é fundamental para preparar os T-75 frascos com MCM e colocá-los na incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO 2) antes de iniciar o protocolo de microdissecção. Frasco TheT-75 tem um revestimento poroso sob a tampa que permite a troca de gases, facilitando o equilíbrio da mídia antes da adição de culturas gliais mistos. Nós descobrimos que a falha em fazer isso resulta em uma colheita microglial abaixo do ideal. É também importante para selar a tampa frasco T-75 com parafilme antes de se colocar o balão no agitador rotativo, a fim de minimizar a troca de gases e saem do balão durante a rotação.
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Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 in; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of Specific Equipment | |||
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
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